葉 雷，陳慶森，李 偉，閻亞麗，趙 培，龐廣昌，胡志和

酪蛋白糖巨肽對(duì)小鼠腹腔吞噬細(xì)胞及腸黏膜免疫細(xì)胞的影響

葉 雷，陳慶森*，李 偉，閻亞麗，趙 培，龐廣昌，胡志和

（天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134）

目的：由于酪蛋白糖巨肽（casein glycomacropeptide，CGMP）具有許多生理活性功能和獨(dú)特營養(yǎng)特性，研究CGMP對(duì)小鼠腹腔免疫細(xì)胞以及腸黏膜屏障的影響可為其應(yīng)用于保健食品和醫(yī)藥品提供科學(xué)依據(jù)。方法：以96只健康昆明雌性小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，利用流式細(xì)胞儀、HE染色和免疫熒光標(biāo)記技術(shù)，分別檢測(cè)分析了灌胃不同劑量的CGM P（30 μg/d和120 μg/d）對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠腹腔吞噬細(xì)胞吞噬活性以及腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞（intraepithellal lymphocytes，IEL）和固 有層IgA+漿細(xì)胞數(shù)量的影響，探討CGMP改善小鼠腹腔吞噬細(xì)胞和腸黏膜屏障功能的作用。結(jié)果：CGMP能夠顯著增加小鼠腹腔吞噬細(xì)胞的吞噬能力，灌胃時(shí)間越長，作用效果越明顯；其中灌胃CGMP的劑量為120 μg/d的作用效果優(yōu)于30 μg/d劑量組。且與對(duì)照組相比，灌胃CGMP組小鼠十二指腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)和固有層IgA+漿細(xì)胞數(shù)量顯著增加（P ＜ 0.01）。結(jié)論：CGMP可以增強(qiáng)小鼠腹腔吞噬細(xì)胞吞噬功能，誘導(dǎo)腸道黏膜免疫應(yīng)答，增強(qiáng)腸黏膜免疫屏障功能，有望開發(fā)為抑制腸道炎癥的功能性食品添加劑。

酪蛋白糖巨肽；腸黏膜屏障；吞噬細(xì)胞；腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞；IgA+漿細(xì)胞

近年來，隨著對(duì)炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）、多臟器功能衰竭、細(xì)菌移位、腸源性感染等研究的深入，人們對(duì)腸道復(fù)雜生理功能有了新的認(rèn)識(shí)，注意到腸道不僅是消化和吸收營養(yǎng)物質(zhì)的重要臟器，而且還具有其他功能，如免疫調(diào)節(jié)、內(nèi)分泌功能、黏膜屏障功能。不論腸道的原發(fā) 性病變，還是繼發(fā)性損害，均會(huì)造成腸功能不同程度的損傷。當(dāng)前臨床研究的熱點(diǎn)主要是腸黏膜屏障功能（gut barrier function），腸道黏膜屏障是存在于腸道內(nèi)的具有高效選擇性功能的屏障系統(tǒng)[1]，由腸黏膜非特異免疫屏障和腸黏膜特異性免疫屏障組成[2]，它在保護(hù)機(jī)體免受食物抗原、防御微生物及其產(chǎn)生的有害代謝產(chǎn)物的損害、保持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定方面起重要作用[3]。腸黏膜是食物進(jìn)入腸道后最先接觸的部位，食物經(jīng)過胃腸道的消化和營養(yǎng)吸收，使得小腸暴露在大量抗原中[4-5]，食物中已有的或經(jīng)過胃腸道消化產(chǎn)生的免疫活性肽，調(diào)節(jié)著腸黏膜免疫屏障，使其處于正常的生理狀態(tài)。目前，發(fā)現(xiàn)許多腸道疾病都會(huì)引起腸黏膜屏障功能的變化，如急性腸炎、腸易激綜合癥、潰瘍性結(jié)腸炎等[6]。因此，飲食對(duì)于維持腸道最佳的免疫功能起著重要作用[5,7]，通過食療的方法改善腸道屏障功能成為可能。

1965年，Delfour等[8]發(fā)現(xiàn)κ-酪蛋白的特定位點(diǎn)經(jīng)凝乳酶切斷，生成不溶的副κ-酪蛋白和三氯乙酸可溶的親水性酪蛋白巨肽兩部分。目前，Kim等[9]已經(jīng)通過基因工程改造酵母細(xì)胞，使其能夠產(chǎn)生人體酪蛋白巨肽（human caseinomacropeptide，hCMP）。這些可溶性多肽含有較多的糖鏈，于是被稱為糖巨肽（glycomacropeptide，GMP），而酪蛋白來源的此類多肽都統(tǒng)稱為酪蛋白糖巨肽（caseino-glycomacropeptide，CGMP）。它是乳清中重要的一種活性多肽，是由64 個(gè)氨基酸組成，含有較多的支鏈氨基酸（branched chain amino acid，BCAA），而缺少芳香族氨基酸的特殊結(jié)構(gòu)。對(duì)于CGMP的制備工藝，目前常用的制備CGMP的方法有沉淀法[10]、雙水相法[11]、酶交聯(lián)法[12]以及層析法[13]。其中，沉淀法會(huì)引起部分蛋白質(zhì)變性；雙水相法和酶交聯(lián)法制備成本高；層析法吸附率高，并且不會(huì)引起蛋白質(zhì)變性，因此適用于大規(guī)模生產(chǎn)。前期實(shí)驗(yàn)通過離子交換層析的方法，采用價(jià)格較低的強(qiáng)堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂從乳清粉中分離CGMP，并對(duì)分離過程中的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，尋找了一條過程簡(jiǎn)單、成本較低、純化效果較好、唾液酸含量高的CGMP制備的工藝路線[14]。

通過對(duì)CGMP的結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)CGMP中主要以O(shè)-糖苷結(jié)合2 種中性糖鏈和3 種酸性糖鏈，90%以上的結(jié)合糖鏈都含唾液酸[15]。結(jié)構(gòu)決定性質(zhì)，CGMP的特殊氨基酸組成和配糖體，決定了其對(duì)機(jī)體能夠產(chǎn)生一系列的生物學(xué)活性[16-19]，如果將CGMP中的唾液酸消化掉，則許多生物學(xué)活性就會(huì)減弱或消失。目前，CGMP作為保健營養(yǎng)品（nutraceuticals）引起了科研工作者越來越多的興趣。Yun等[20]通過研究CGMP對(duì)脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）刺激的脾臟細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)CGMP誘導(dǎo)IgA的濃度升高，說明CGMP能夠促進(jìn)正常機(jī)體B淋巴細(xì)胞的增殖，上調(diào)機(jī)體的體液免疫功能。Li等[21]于2004年通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CGMP能夠增加人的吞噬細(xì)胞U937的吞噬活性，并且能夠促進(jìn)其增殖。另外，賈玉臣等[22]研究發(fā)現(xiàn)，乳源CGMP誘導(dǎo)調(diào)節(jié)CD4+細(xì)胞的活性，能夠促進(jìn)小腸上皮的彌散性和促炎細(xì)胞因子如IFN-γ、IL-4等的增加。

綜上所述，尋找并研究一些食源性生物活性物質(zhì)，在維持機(jī)體腸黏膜免疫系統(tǒng)的平衡以及新藥和保健品的研制和開發(fā)方面具有重要價(jià)值。因此，本實(shí)驗(yàn)利用流式細(xì)胞儀、石蠟切片蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色和免疫熒光技術(shù)，檢測(cè)分析CGMP對(duì)小鼠腹腔吞噬細(xì)胞吞噬活性以及十二指腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞（intraepithelial lymphocyte，IEL）和固有層IgA+漿細(xì)胞數(shù)量變化的影響，探討CGMP對(duì)小鼠腹腔免疫細(xì)胞和腸黏膜免疫系統(tǒng)的影響，這為CGMP作為功能性食品添加劑以及新藥的創(chuàng)制提供可靠的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6 周齡昆明雌性小鼠96 只，SPF級(jí)，體質(zhì)量（25.53±1.65）g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 材料與試劑

牛乳源CGMP 新西蘭Tatua公司；啤酒酵母 天津商業(yè)大學(xué)菌種保藏室；異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 美國Sigma 公司；多聚賴氨酸天津華生生物科技有限公司；二甲苯（分析純） 天津市佳興化工玻璃儀器工貿(mào)；蘇木精染液、伊紅染液 天津市久圣醫(yī)療電子儀器有限公司；所用試劑均為分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

FACS Calibur流式細(xì)胞儀（雙激光配置） 美國BD公司；MODULYOD-230冷凍干燥機(jī) 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；YD-355電腦切片機(jī)、TD-B組織烤片機(jī)、YD-A組織攤片機(jī) 金華市益迪醫(yī)療設(shè)備廠；DS-5MC光學(xué)顯微鏡、TE2000熒光顯微鏡 日本Nikon公司。

1.4 方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組Table 1 Grouping of mice in experiments

6 周齡小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2 周后根據(jù)體質(zhì)量將小鼠隨機(jī)分為3 組，隨后按照表1所示的分組和灌胃劑量分別對(duì)小鼠進(jìn)行連續(xù)灌胃，并在實(shí)驗(yàn)開始2、4、6、8 d后分別在各組中隨機(jī)選取8 只小鼠進(jìn)行腹腔吞噬細(xì)胞吞噬活性和腸道免疫細(xì)胞活性的研究。實(shí)驗(yàn)期間，各組小鼠自由采食、飲水。

1.4.2 不同劑量的CGMP對(duì)小鼠腹腔吞噬細(xì)胞吞噬活性的影響

1.4.2.1 啤酒酵母培養(yǎng)和酵母干粉的制備

將活化后的啤酒酵母接種到土豆平板培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)3 d，3 mL無菌水輕輕沖洗獲得酵母細(xì)胞，將收集的酵母細(xì)胞500 r/min離心1 min，棄去沉淀，上清液8 000 r/min離心1 min獲得大小均一的酵母細(xì)胞。無菌水懸浮后－20 ℃冷凍，最后置于冷凍干燥機(jī)中制成凍干粉，4 ℃干燥保存。

1.4.2.2 小鼠血清的制備

眼球摘除法取血，室溫靜置30 min，4 ℃靜置2 h，3 000×g、4 ℃離心10 min獲得小鼠血清，分裝后，－80 ℃貯存，作為熒光標(biāo)記啤酒酵母細(xì)胞的調(diào)理素。

1.4.2.3 熒光標(biāo)記啤酒酵母細(xì)胞

取120 mg啤酒酵母凍干粉，與6 mL 0.01 mol/L的無菌磷酸鹽緩沖溶液（phosphat buffered saline，PBS）緩沖液溶解混勻后，80 ℃水浴加熱15 min滅活。將滅活后的菌體細(xì)胞8 000 r/min離心2 min，棄上清液，將得到的沉淀用6 mL DMSO配制的FITC溶液（0.1 mg/mL）懸浮混勻，室溫避光孵育1 h，離心后去上清液，無菌PBS洗滌沉淀4 次，得到熒光標(biāo)記的酵母細(xì)胞。

1.4.2.4 啤酒酵母細(xì)胞熒光標(biāo)記率的檢測(cè)

利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光標(biāo)記酵母的標(biāo)記率，熒光標(biāo)記率大于99.9%的說明標(biāo)記合格，最后將得到的熒光標(biāo)記合格的酵母細(xì)胞用無菌PBS調(diào)整至終濃度為2×109個(gè)/mL菌懸液，4 ℃避光保存?zhèn)溆谩Ｔ谶M(jìn)行吞噬實(shí)驗(yàn)前將熒光標(biāo)記啤酒酵母細(xì)胞懸液與小鼠血清按照體積比為1∶1的比例室溫孵育60 min，無菌PBS調(diào)整至終濃度為1×109個(gè)/mL。

1.4.2.5 小鼠腹腔吞噬細(xì)胞的分離與吞噬

頸椎脫臼處死各組小鼠，用75%的酒精涂抹腹部，向腹腔注射5 mL的無菌PBS，輕揉腹部1～2 min后，剪開腹部，吸取3 mL腹腔液于離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入0.5 mL的PBS混勻，然后加入50 μL上述制備好的熒光標(biāo)記的酵母細(xì)胞，使其中熒光酵母和吞噬細(xì)胞個(gè)數(shù)比為20∶1?；靹蚝蟮谷?4 孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃恒溫箱中孵育40 min，棄去孔內(nèi)液體，加入4 ℃預(yù)冷的PBS溶液0.5 mL，輕輕晃動(dòng)沖洗1 次，然后再加入0.5 mL、4 ℃預(yù)冷的PBS抽吸吹打，混勻后置于冰上待測(cè)。

1.4.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同劑量的CGMP對(duì)小鼠腹腔吞噬細(xì)胞吞噬功能的影響

利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)每個(gè)分組中8 只小鼠吞噬細(xì)胞樣本的吞噬活性，每份樣本獲取10 000 個(gè)細(xì)胞。以前向散射角（forward scatter，F(xiàn)SC）和側(cè)向散射角（side scatter，SSC） 建立FSC-SSC點(diǎn)圖，設(shè)“門”以圈定待測(cè)的吞噬細(xì)胞群，檢測(cè)“門”內(nèi)吞噬細(xì)胞的FITC熒光強(qiáng)度，獲取FL1-H熒光信號(hào)柱狀圖。利用Cell Quest program 6.0對(duì)獲取的細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，首先以未加熒光標(biāo)記酵母細(xì)胞的吞噬細(xì)胞樣品作為陰性對(duì)照，設(shè)“門”M1表示沒有吞噬熒光標(biāo)記酵母的吞噬細(xì)胞群；接著以熒光標(biāo)記的酵母細(xì)胞為陽性對(duì)照，上機(jī)檢測(cè)，獲得FL1-H熒光信號(hào)柱狀圖并記錄其平均熒光強(qiáng)度（M）；然后以此平均熒光強(qiáng)度M作為一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)單位，按照此標(biāo)準(zhǔn)單位的倍數(shù)依次設(shè)門M2、M3、M4……Mn，分別表示吞噬1、2、3……n-1個(gè)熒光標(biāo)記酵母細(xì)胞的吞噬細(xì)胞群。最后根據(jù)設(shè)“門”的個(gè)數(shù)來確定n值，并按照式（1）計(jì)算吞噬細(xì)胞的吞噬率。

式中：M1代表M1門內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，即沒有吞噬酵母的吞噬細(xì)胞數(shù)。

按照式（2）計(jì)算吞噬指數(shù)。

式中：M2代表M2門內(nèi)的吞噬細(xì)胞數(shù)，即吞噬1 個(gè)酵母細(xì)胞的吞噬細(xì)胞個(gè)數(shù)；Mn代表Mn門內(nèi)的吞噬細(xì)胞數(shù)，即吞噬n－1個(gè)酵母細(xì)胞的吞噬細(xì)胞數(shù)。

1.4.3 不同劑量的CGMP對(duì)小鼠十二指腸上皮內(nèi) 淋巴細(xì)胞和固有層IgA漿細(xì)胞的影響

1.4.3.1 小鼠十二指腸組織的固定

各組小鼠頸椎脫臼處死后迅速取胃下5 cm處十二指腸組織2 cm，放入包埋盒中，做好標(biāo)記，置于4%的福爾馬林溶液中固定48 h。

1.4.3.2 小鼠十二指腸組織石蠟切片的制備和HE染色及IEL計(jì)數(shù)

參照文獻(xiàn)[23-24]中的方法制備各組小鼠十二指腸組織的石蠟切片以及HE染色。

在每張HE染色切片上，隨機(jī)選擇10個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，每個(gè)視野內(nèi)單核的非上皮細(xì)胞被認(rèn)為是淋巴細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)腸IEL數(shù)。

1.4.3.3 免疫熒光標(biāo)記及計(jì)數(shù)

1）將上述制備的常規(guī)石蠟切片脫蠟至水。2）抗原修復(fù)：將洗滌后的組織切片放入加熱煮沸后的檸檬酸鈉（pH 6.0）抗原修復(fù)液中，中火加熱20 min，冷卻至室溫，取出組織切片放入PBS緩沖液中室溫孵育10 min。3）熒光標(biāo)記：將2 mg/mL的FITC-IgA單抗溶液與pH 7.4的PBS溶液按照1∶50（V/V）倍進(jìn)行稀釋；將稀釋的單抗溶液滴加到切片組織上，37 ℃恒溫孵育2 h進(jìn)行熒光標(biāo)記。4）封片：取出切片組織，PBS浸洗3 次，每次10 min；擦去載玻片上多余的水分，滴加甘油進(jìn)行封片。5）鏡檢計(jì)數(shù)：熒光顯微鏡對(duì)組織切片中IgA+細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，每張切片隨機(jī)計(jì)數(shù)10 個(gè)視野。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用SPSS11.5對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和t檢驗(yàn)分析，校驗(yàn)水平為α=0.05；其中，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著；數(shù)據(jù)用±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同劑量的CGMP對(duì)小鼠腹腔吞噬細(xì)胞吞噬活性的影響

2.1.1 不同劑量的CGMP對(duì)小鼠腹腔吞噬細(xì)胞吞噬指數(shù)的影響

圖1 不同劑量CGMP對(duì)吞噬細(xì)胞吞噬指數(shù)的影響Fig.1 Effect of different doses of CGMP on phagocytic index of phagocytes

由圖1可知，實(shí)驗(yàn)期間灌胃CGMP組（G1和G2）小鼠腹腔吞噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)隨著灌胃天數(shù)的增加而增大，并且在灌胃第6天G2組小鼠吞噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)顯著高于G1組（P＜0.01），兩個(gè)劑量組小鼠都在灌胃第8天吞噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)達(dá)到最大值；而在灌胃第2天和第4天，G1和G2組與對(duì)照組G0相比小鼠腹腔吞噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)差異并不顯著（P＞0.05）；但從灌胃第6天開始，G2組吞噬指數(shù)顯著高于G0組（P＜0.01）；第8天G1和G2組小鼠吞噬細(xì)胞吞噬 指數(shù)與對(duì)照組相比均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。

2.1.2 不同劑量的CGMP對(duì)小鼠腹腔吞噬細(xì)胞吞噬率的影響

圖2 不同劑量的CGMP對(duì)腹腔吞噬細(xì)胞吞噬率的影響Fig.2 Effect of different doses of CGMP on phagocytic rate of phagocytes

由圖2可知，在灌胃第2天，G1和G2組與G0組相比小鼠吞噬細(xì)胞的吞噬率均升高，其中G2組與G0組相比差異顯著（P＜0.05）；灌胃第4天， G1和G2組小鼠吞噬細(xì)胞吞噬率降至最低，且與G0組無顯著差異，隨后升高，并在第8天升至最高值。另外，從灌胃第6天開始，G2組小鼠吞噬細(xì)胞吞噬率顯著高于G0和G1組（ P＜0.05）；而在灌胃第8天，G1和G2組小鼠吞噬細(xì)胞吞噬率均顯著高于G0組（P＜0.05），且G2組小鼠腹腔吞噬細(xì)胞吞噬率也顯著高于G1組（P＜0.01）。

2.2 不同劑量的CGMP對(duì)小鼠十二指腸IEL的影響

圖3 不同劑量的C GMP對(duì)小鼠腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響Fig.3 Effect of different doses of CGMP on the number of IEL in mice

由圖3可知，從灌胃第2天開始兩個(gè)劑量的CGMP都能顯著增加小鼠十二指腸IEL的數(shù)量（P＜0.01）；并且隨著灌胃天數(shù)的增加，G1組小鼠十二指腸IEL數(shù)量也隨之增加，在第8天達(dá)到最大值，而G2組小鼠十二指腸IEL數(shù)量于第4天達(dá)到高峰，隨后則無顯著增加。

2.3 不同劑量的CGMP對(duì)小鼠十二指腸固有層中IgA+漿細(xì)胞的影響

圖4 不同劑量的CGMP對(duì)小鼠固有層IgA+漿細(xì)胞數(shù)量的影響Fig.4 Effect of different doses of CGMP on the number of IgA+plasma cells in mice

由圖4可知，從灌胃第2天開始，兩個(gè)劑量的CGMP都能顯著引起小鼠十二指腸固有層中IgA+漿細(xì)胞數(shù)量的增加（P＜0.01），且隨著灌胃時(shí)間的延長IgA+漿細(xì)胞數(shù)量也不斷增加，在第8天達(dá)到最大值。

3 討 論

3.1 建立流式細(xì)胞儀檢測(cè)腹腔吞噬細(xì)胞吞噬活性方法的目的和意義

腹腔吞噬細(xì)胞能夠非特異性的吞噬進(jìn)入人體內(nèi)的病原體，衰老病變細(xì)胞，參與抗原識(shí)別與遞呈，生成多種細(xì)胞因子，對(duì)于機(jī)體抵御病原體的入侵起著重要的作用。因此，檢測(cè)腹腔吞噬細(xì)胞的吞噬活性對(duì)于藥物的篩選和功能性食品的開發(fā)具有重要的意義。然而，傳統(tǒng)的檢測(cè)吞噬細(xì)胞吞噬活性的方法如雞紅細(xì)胞和酵母細(xì)胞的吞噬實(shí)驗(yàn)具有耗時(shí)長、受人的主觀因素影響比較大、觀察的數(shù)量較少等缺點(diǎn)。采用流式細(xì)胞儀來檢測(cè)吞噬細(xì)胞活性不僅靈敏快速，而且高通量檢測(cè)的特點(diǎn)很大程度上提高了檢測(cè)效率，減少了人 為主觀因素的影響，所以該方法受到了人們的廣泛關(guān)注，隨之發(fā)展起來的技術(shù)方法也很多。李煜等[25]通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠腹腔吞噬細(xì)胞吞噬熒光微球的 活性，并與傳統(tǒng)的雞紅細(xì)胞法作比較，雖然吞噬熒光微球的方法檢測(cè)效果較好，但是檢測(cè)成本相對(duì)高昂；而黃瓊[26]和金齊 力[27]等分別通過吞噬熒光標(biāo)記大腸桿菌和結(jié)核分枝桿菌的方法檢測(cè)了吞噬細(xì)胞的吞噬活性，但是由于這些細(xì)菌的細(xì)胞較小容易被吞噬細(xì)胞表面受體黏附且熒光標(biāo)記率低，從而影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

Miliukien?等[28]2005年通過吞噬熒光標(biāo)記啤酒酵母的方法來檢測(cè)外周血中中性粒細(xì)胞 的吞噬活性，但是由于沒有排除未標(biāo)記的酵母細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響造成檢測(cè)結(jié)果誤差較大。因此本實(shí)驗(yàn)在總結(jié)前人的研究經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行了相關(guān)改進(jìn)，使其更能夠準(zhǔn)確反映吞噬細(xì)胞的吞噬活性。將啤酒酵母細(xì)胞作為吞噬顆粒，這是因?yàn)槠浼?xì)胞比較大，菌體大小差別小，同時(shí)，F(xiàn)ITC熒光標(biāo)記率高，可以達(dá)到99.97%，這為后續(xù)研究的準(zhǔn)確性提供了基礎(chǔ)。另外，利用流式細(xì)胞儀的高通量特點(diǎn)進(jìn)一步提高了研究的準(zhǔn)確性和可信度。因此，在本實(shí)驗(yàn)結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)建立了一種具有靈敏快捷、重復(fù)性好、準(zhǔn)確率高等優(yōu)點(diǎn)的檢測(cè)吞噬細(xì)胞活性的方法，并運(yùn)用該方法評(píng)價(jià)了不同劑量的CGMP對(duì)小鼠腹腔吞噬細(xì)胞吞噬活性的影響。

3.2 CGMP對(duì)小鼠腹腔吞噬細(xì)胞吞噬活性的影響

吞噬細(xì)胞包括中性粒細(xì)胞和單核-吞噬細(xì)胞，這些細(xì)胞是執(zhí)行固有免疫作用的效應(yīng)細(xì)胞，可及時(shí)清除入侵體內(nèi)的病原微生物，在機(jī)體早期抗感染免疫過程中發(fā)揮重要作用。吞噬細(xì)胞不僅參與機(jī)體的特異性免疫反應(yīng)和非特異性免疫反應(yīng)，而且是兩種免疫反應(yīng)聯(lián)系的“橋梁細(xì)胞”，在與多種病原微生物識(shí)別與結(jié)合過程中，它可以誘導(dǎo)I-A抗原的高表達(dá)，能夠通過受體與病原體等抗原異物的結(jié) 合作用來主動(dòng)吞噬、殺傷和消化病原微生物并分泌多種細(xì)胞因子。研究發(fā)現(xiàn)，吞噬細(xì)胞吞噬內(nèi)毒素是體內(nèi)清除內(nèi)毒素的主要途徑，當(dāng)吞噬細(xì)胞的吞噬功能受到抑制，導(dǎo)致體內(nèi)清除內(nèi)毒素或病原微生物的功能減弱，會(huì)引起機(jī)體抵抗能力下降[29]。因此吞噬細(xì)胞在調(diào)節(jié)和維持腹腔環(huán)境的穩(wěn)定，增強(qiáng)固有免疫方面具有關(guān)鍵作用。

Stutas等[30]發(fā)現(xiàn)，κ-酪蛋白經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶消化產(chǎn)生的多肽能夠顯著提高促絲裂原誘導(dǎo)的人淋巴細(xì)胞的增殖；而且來源于κ-酪蛋白的胰蛋白酶酶解產(chǎn)物Phe-Phe-Ser-Asp-Lys在體外能夠促進(jìn)抗體的產(chǎn)生并且增強(qiáng)鼠和人吞噬細(xì)胞的吞噬活性。另外，Li等[21]在體外通過CGMP與人吞噬細(xì)胞U937作用，發(fā)現(xiàn)低劑量的CGMP能顯著增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬活性并促進(jìn)其增殖。而在本實(shí)驗(yàn)中，我們通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)G1和G2組小鼠吞噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)和吞噬率呈劑量-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系；而G1和G2組吞噬指數(shù)于灌胃第8天顯著接近且都高于G0組，這可能是因?yàn)楣辔? d后G1和G2組小鼠吞噬細(xì)胞的吞噬能力均增加到最高，所以造成劑量效應(yīng)無顯著差異；另外，G1和G2組小鼠的吞噬率于灌胃第4天出現(xiàn)低谷且與G0組無顯著差異，這可能是因?yàn)楣辔盖捌贑GMP對(duì)吞噬能力的正向調(diào)節(jié)作用有所抑制，而在吞 噬指數(shù)的影響實(shí)驗(yàn)中也可以看到相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，即在灌胃前期吞噬指數(shù)的增加不顯著；因此，在體內(nèi)CGMP同樣能夠顯著增強(qiáng)腹腔吞噬細(xì)胞的吞噬能力，而且隨作用時(shí)間的延長作用效果越明顯，這與Li等[21]的體外研究結(jié)果基本一致。

3.3 CGMP對(duì)小鼠十二指腸IEL的影響

腸黏膜免疫屏障主要由腸道相關(guān)淋巴組織構(gòu)成。腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞是黏膜免疫的主要效應(yīng)位點(diǎn)，淋巴細(xì)胞歸巢的主要部位，在誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)腸黏膜免疫應(yīng)答中起著重要作用。IEL是腸黏膜免疫系統(tǒng)中最先接觸抗原的免疫活性細(xì)胞，它長期與腸道正常菌群、病原微生物接觸，在腸黏膜的抗感染免疫、保持腸上皮細(xì)胞的完整性及調(diào)節(jié)對(duì)外來抗原的免疫應(yīng)答方面均有重要作用。發(fā)生IBD時(shí)，腸黏膜的天然免疫和特異性免疫系統(tǒng)均有免疫異常的表現(xiàn)，而淋巴細(xì)胞參與的IBD異常免疫主要為特異性（適應(yīng)性）免疫反應(yīng)。現(xiàn)在認(rèn)為，腸黏膜免疫系統(tǒng)對(duì)腸腔常駐菌群的耐受異常是IBD發(fā)病機(jī)制的原因之一[31]。因此，IEL對(duì)于維持腸黏膜的免疫耐受方面起著重要作用，通過調(diào)節(jié)IEL來達(dá)到增強(qiáng)IBD患者對(duì)腸道菌群的 免疫耐受性可能是改善或者治療IBD的重要方法。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CGMP可能具有這方面的功能，但仍需要進(jìn)一步的研究進(jìn)行驗(yàn)證。另外，CGMP誘導(dǎo)IEL的顯著增加可能的途徑是CGMP由腸上皮M細(xì)胞傳遞給PP結(jié)內(nèi)的樹突細(xì)胞，刺激PP結(jié)T淋巴細(xì)胞增殖，通過腸系膜淋巴結(jié)到達(dá)黏膜免疫的效應(yīng)位點(diǎn)，主要是CD8+細(xì)胞；CD8+細(xì)胞為殺傷性T細(xì)胞，通過與腸上皮細(xì)胞的相互作用和細(xì)胞因子的分泌，從而能夠維持腸黏膜機(jī)械屏障和免疫屏障功能，抵御腸道中的毒素和病原微生物的侵襲[11]。因此，本研究表明了CGMP在維持腸黏膜免疫屏障方面具有重要作用，長期灌胃CGMP能夠誘導(dǎo)IEL的數(shù)量增加，這也提示CGMP可能具有誘導(dǎo)腸黏膜產(chǎn)生獲得性免疫應(yīng)答作用。

3.4 CGMP對(duì)十二指腸固有層內(nèi)IgA+漿細(xì)胞的影響

小腸固有層是腸黏膜免疫的效應(yīng)位點(diǎn)，固有層IgA漿細(xì)胞分泌的sIgA進(jìn)入腸腔，對(duì)維持局部抗體的有效水平，抵御腸道病原微生物的侵襲，拮抗細(xì)菌定殖、黏附，以及中和腸腔毒素等方面均起重要作用。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，CGMP能夠誘導(dǎo)小鼠十二指腸固有層IgA+漿細(xì)胞數(shù)量的增加。CGMP能夠誘導(dǎo)小鼠十二指腸固有層IgA+漿細(xì)胞數(shù)量的增加的可能機(jī)制包括以下幾個(gè)方面：首先是CGMP干預(yù)后，腸道菌群發(fā)生變化尤其是腸道益生菌如雙歧桿菌數(shù)量顯著增加的結(jié)果[32]；其次，也可能是由于CGMP通過PP結(jié)的M細(xì)胞進(jìn)入黏膜淋巴組織后，經(jīng)APC加工遞呈給B細(xì)胞，在T細(xì)胞和細(xì)胞因子，尤其是TGF-β影響下發(fā)生 IgM-IgA類型轉(zhuǎn)換，然后經(jīng)傳出淋巴管遷移到腸系膜淋巴結(jié)（mesenteric lymph node，MLN），隨后分裂和分化，最后離開MLN，經(jīng)胸導(dǎo)管進(jìn)入血循環(huán)，在歸巢受體介導(dǎo)下遷移至腸黏膜固有層，分化為成熟的IgA+漿細(xì)胞，促使固有層IgA+漿細(xì)胞的增加[15]；然后，可能由于CGMP直接通過腸道上皮層進(jìn)入固有層，刺激CD4+T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，促使IgA+漿細(xì)胞的分化[15]。最后還有一種可能，由于腸黏膜固有層免疫應(yīng)答以Th2型為主，CGMP可能直接通過腸道固有層的樹突細(xì)胞的捕獲進(jìn)入固有層，通過與Th2淋巴細(xì)胞的相互作用，促使Th2細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞因子如TGF-β、IL-4、IL-5、IL-6及IL-10，IL-6可協(xié)同誘導(dǎo)固有層中的sIgA+B細(xì)胞分化成為IgA+漿細(xì)胞[22]。因此，本研究的結(jié)果提示CGMP能夠誘導(dǎo)腸黏膜產(chǎn)生獲得性體液免疫應(yīng)答，這為開發(fā)CGMP作為黏膜疫苗的載體或佐劑來誘導(dǎo)局部黏膜免疫反應(yīng)來提高分泌進(jìn)入腸腔的sIgA量，從感染的源頭阻止病原菌的侵入提供了有力的科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立了一種新的利用流式細(xì)胞儀測(cè)定吞噬細(xì)胞吞噬活性的方法，該方法具有靈敏、快捷、重復(fù)性好準(zhǔn)確率高的優(yōu)點(diǎn)。通過該方法檢測(cè)灌胃不同劑量CGMP小鼠腹腔吞噬細(xì)胞的吞噬能力發(fā)現(xiàn)：CGMP能夠顯著增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬能力；而且灌胃劑量為120 μg/d時(shí)的作用效果優(yōu)于灌胃劑量為30 μg/d時(shí)的作用效果；另外，灌胃時(shí)間越長，CGMP對(duì)吞噬細(xì)胞吞噬能力的作用效果越明顯。因此，這提示CGMP可以作為功能性食品添加劑，增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫細(xì)胞的功能。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小鼠灌胃CGMP后，小腸黏膜免疫反應(yīng)的效應(yīng)位點(diǎn)中腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和固有層IgA+漿細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組相比顯著增加（P＜0.01），這說明CGMP能夠誘導(dǎo)小鼠腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和固有層IgA+漿細(xì)胞的增加。因此，CGMP可以作為功能性食品添加劑誘導(dǎo)腸黏膜體液免疫反應(yīng)，從而分泌多種抗炎因子以增強(qiáng)腸道的抗炎作用。

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Effect of Casein Glycomacropeptide on Phagocytic Cells and Intestinal Mucosa Immune Cells in Mice

YE Lei, CHEN Qing-sen*, LI Wei, YAN Ya-li, ZHAO Pei, PANG Guang-chang, HU Zhi-he
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

Objective: Casein glycomacropeptide (CGMP) has many physiological functions and unique nutritional properties. This study aimed to explore its effect on peritoneal immune cells and intestinal mucosal barrier in mice. Methods: After being intragastrically given CGMP at doses of 30 and 120 μg/d, respectively, 96 female Kunming mice were tested for phagocytic activity, intestinal intraepithelial lymphocytes (IEL) subpopulations and the number of IgA+plasma cells in the lamina propria by flow cytometry, hematoxylin and eosin (HE) staining and immunofluorescence, respectively. Results: CGMP administration to mice resulted in a significa nt increase in phagocytic activity in a dose- and time-dependent manner. Compared with the control group, CGMP administration also resulted in a significantly higher percentage of intraepithel lal lymphocytes (IEL) in the duodenum and a significantly greater number of IgA+plasma cells in the la mina propria (P ＜ 0.01). Conclusion: CGMP can enhance phagocytic activity, induce intestinal mucosal immune response and enhance the intestinal mucosal barrier function.

casein glycomacropeptide; intestinal mucosal barrier; phagocytic activity; intestinal intraepithelial lymphocytes; IgA+plasma cells

TS201.4

A

1002-6630（2014）09-0234-07

10.7506/spkx1002-6630-201409046

2013-12-18

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（30771524；31071522）

葉雷（1989—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锘钚晕镔|(zhì)研究與腸道健康。E-mail：yelei20081020@126.com

*通信作者：陳慶森（1957—），男，教授，碩士，研究方向?yàn)槭吃葱陨锘钚晕镔|(zhì)與腸道健康、蛋白質(zhì)（酶）資源研究與開發(fā)。E-mail：chqsen@tjcu.edu.cn