祝賽峰，吳建峰，趙希榮,*

（1.淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 淮安 223003；2.江蘇今世緣酒業(yè)有限公司，江蘇 漣水 223411）

響應(yīng)面法優(yōu)化枯草芽孢桿菌S0507產(chǎn)四甲基吡嗪的培養(yǎng)條件

祝賽峰1，吳建峰2，趙希榮1,*

（1.淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 淮安 223003；2.江蘇今世緣酒業(yè)有限公司，江蘇 漣水 223411）

通過(guò) 響應(yīng)面分析法對(duì)枯草芽孢桿菌S0507產(chǎn)四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine，TTMP）培養(yǎng)工藝進(jìn)行優(yōu)化。經(jīng)單因素試驗(yàn)后，以Box-Behnken法設(shè)計(jì)考察培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、水分含量3 個(gè)因素對(duì)TTMP產(chǎn)量的交互影響，用Design-Expert v8.0.1.6軟件對(duì)BBD試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)得到的最佳培養(yǎng)條件為：低溫培養(yǎng)時(shí)間33.84 h、培養(yǎng)溫度41.75 ℃、水分含量59.63%，TTMP產(chǎn)量為332.70 mg/kg，理論值（335.49 mg/kg）與實(shí)驗(yàn)值的相對(duì)偏差為0.84%，證明應(yīng)用響應(yīng)曲面法優(yōu)化枯草芽孢桿菌S0507產(chǎn)TTMP的培養(yǎng)條件是可行的。

四甲基吡嗪；枯草芽孢桿菌；響應(yīng)面法；氣相色譜分析

四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine，TTMP），又稱川芎嗪，具有烘烤香氣、甜香，是中國(guó)白酒中的重要香氣化合物，因此，在中國(guó)傳統(tǒng)白酒中均檢測(cè)到一定量的四甲基吡嗪[1-4]。已證明其具有擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)及抑制血小板集聚等作用[5-7]。因而其不僅對(duì)中國(guó)白酒風(fēng)味有重要的貢獻(xiàn)，而且還賦予了中國(guó)白酒有益健康的功能[8-9]，所以，對(duì)白酒中四甲基吡嗪的研究，已成為白酒有益于健康研究的重要方向。

目前，國(guó)內(nèi)外TTMP的實(shí)驗(yàn)室制備方法主要有從川芎中萃取TTMP的直接提取法[10]、利用非Strecker降解方法化學(xué)合成TTMP的化學(xué)合成法[11]以及微生物發(fā)酵法[12-13]。Kosuge等[14]在納豆中分離得到TTMP，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌具有發(fā)酵產(chǎn)生TTMP的能力。Zak等[15]從發(fā)酵可可豆中找到了發(fā)酵產(chǎn)TTMP的枯草芽孢桿菌，且只有在枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)時(shí)，體系中才會(huì)有TTMP。Huang等[16]考察了乙偶姻/乙酸銨模型體系中TTMP的生成過(guò)程，并提出了弱酸高壓條件下TTMP的生成機(jī)制。莊名揚(yáng)等[17]介紹了美拉德反應(yīng)與醬香型白酒香味成份間的聯(lián)系，還闡述了美拉德反應(yīng)不僅是酒體香和味的微量物質(zhì)，同時(shí)也是其他香味物質(zhì)的前驅(qū)物質(zhì)[18]。吳建峰[1]提出在白酒制曲過(guò)程和釀酒堆積發(fā)酵過(guò)程均會(huì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，TTMP是美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物。徐巖等[2]對(duì)中國(guó)白酒中四甲基吡嗪的來(lái)源及產(chǎn)生機(jī)制進(jìn)行了深入的研究，研究驗(yàn)證了中國(guó)白酒中四甲基吡嗪產(chǎn)生的主要途徑來(lái)源于微生物的代謝反應(yīng)，并非美拉德反應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)TTMP，即對(duì)篩選得到的枯草芽孢桿菌S0507進(jìn)行培養(yǎng)條件的優(yōu)化，得到枯草芽孢桿菌S0507產(chǎn)TTMP的最佳培養(yǎng)條件。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

枯草芽孢桿菌S0507，由江蘇省生物釀酒技術(shù)研究院篩選并保藏。

基礎(chǔ)種子培養(yǎng)基：牛肉膏0.3 g/100 mL、蛋白 胨1 g/100 mL、NaCl 0.5 g/100 mL，pH值調(diào)至7.2～7.4，于121 ℃高壓蒸汽濕熱滅菌20 min。

1.2 試劑與儀器

2,3,5,6-四甲基吡嗪（TTMP）、2-乙?；拎ぃ?-acetylpyridine） 美國(guó)Sigma公司（純度＞98%）；乙酸丁酯、95%乙醇（分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；麩皮、花生粉 江蘇今世緣酒業(yè)股份有限公司。

GC6890氣相色譜儀 安捷倫上?？萍加邢薰荆焕状臥HS-3C精密pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；TDL-60C低速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；SHZ-82氣浴恒溫振蕩箱 金壇市杰瑞爾電器有限公司；JB-CJ-1FCS無(wú)菌操作臺(tái) 南通市東盛實(shí)驗(yàn)室裝備有限公司。

1.3 菌種培養(yǎng)

枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基本條件（活化）：從斜面上挑取一環(huán)菌落至新鮮的瓊脂固態(tài)斜面上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)?；A(chǔ)種子培養(yǎng)液培養(yǎng)條件：從新鮮斜面上挑取一環(huán)菌落至種子培養(yǎng)液中（每100 mL三角瓶裝20 mL培養(yǎng)基），于37 ℃、120 r/min下?lián)u床培養(yǎng)24 h。麩皮固態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)條件：從基礎(chǔ)種子培養(yǎng)液中按2%接種于固態(tài)培養(yǎng)基，攪拌均勻后置于隔水式恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.4 單因素培養(yǎng)條件試驗(yàn)

采用兩階段培養(yǎng)模式，即前期低溫培養(yǎng)和后期高溫培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)中固定高溫（60 ℃）與培養(yǎng)時(shí)間（24 h），研究低溫培養(yǎng)溫度（簡(jiǎn)稱培養(yǎng)溫度）、低溫培養(yǎng)時(shí)間（簡(jiǎn)稱培養(yǎng)時(shí)間）、原料比對(duì)TTMP產(chǎn)量的影響。固定原料比（麩皮與花生粉質(zhì)量比）為7∶3、水分含量為50%、溫度為45 ℃，考察培養(yǎng)時(shí)間（24、30、36、42、48 h）對(duì)TTMP產(chǎn)量的影響；固定麩皮與花生粉質(zhì)量比為7∶3、水分含量為50%、培養(yǎng)時(shí)間為48 h，考察培養(yǎng)溫度（29、33、37、41、45、49 ℃）對(duì)TTMP產(chǎn)量的影響；固定麩皮與花生粉質(zhì)量比為7∶3、溫度為45 ℃、時(shí)間為48 h，考察水分含量（45%、50%、55%、60%、65%、70%）對(duì)TTMP產(chǎn)量的影響；固定培養(yǎng)時(shí)間為48 h、水分含量為50%、培養(yǎng)溫度為45 ℃，考察麩皮與花生粉質(zhì)量比9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6，即固態(tài)培養(yǎng)基中花生粉不同含量（10%、20%、30%、40%、50%、60%）對(duì)TTMP產(chǎn)量的影響。同一水平實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.5 響應(yīng)曲面分析法

在單因素研究的基礎(chǔ)上，選取培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度和水分含量3 個(gè)因素為自變量，以TTMP含量為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)響應(yīng)曲面分析試驗(yàn)。

1.6 TTMP的測(cè)定方法

1.6.1 TTMP的提取

稱取發(fā)酵后培養(yǎng)基5 g，搗碎，置于100 mL三角瓶中，加50 mL 12%乙醇溶解，浸泡10 min，超聲30 min，4 500 r/min離心10 min，吸取5 mL上清液于試管，并加入1.4 mL乙酸丁酯，混勻溶液，萃取TTMP。將萃取液置于4 ℃冰箱中靜置，以防止萃取相中溶劑的揮發(fā)。

1.6.2 氣相色譜法測(cè)定TTMP

樣品處理：將萃取液除去乳化層，用1 000 μL移液器吸取上清液于2 mL離心管，用乙酸丁酯定容至1.5 mL，再用10 μL進(jìn)樣器加1 μL內(nèi)標(biāo)30 mg/mL 2-乙?；拎?，混勻[19-20]。

TTMP的定量分析：進(jìn)樣量1 μL，進(jìn)樣口溫度為50 ℃，N2流速為1.0 mL/min；氮磷檢測(cè)器溫度為250 ℃，N2為載氣，流速為2 mL/min，H2流速為3 mL/min，Air流速為60 mL/min。毛細(xì)管色譜柱為Agilent 19011F-102（25 m×0.2 mm，0.30 μm），恒壓模式。程序升溫：50 ℃以10 ℃/min速率升溫至100 ℃，恒溫5 min，以5 ℃/min速率升溫至150 ℃，恒溫10 min，再以10 ℃/min速率升溫至210 ℃，保持5 min。

TTMP的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y＝0.032 2x－0.035 8。其中，y是TTMP與內(nèi)標(biāo)2-乙?；拎さ姆迕娣e之比，x是TTMP的質(zhì)量濃度/（μg/mL）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)TTMP的影響

如圖1所示，培養(yǎng)時(shí)間為24～30 h時(shí)，TTMP產(chǎn)量平穩(wěn)上升；培養(yǎng)時(shí)間為30～36 h時(shí)，TTMP產(chǎn)量上升趨勢(shì)較陡；培養(yǎng)時(shí)間為36～42 h時(shí)，TTMP產(chǎn)量下降趨勢(shì)較陡；培養(yǎng)時(shí)間42～48 h時(shí)，TTMP產(chǎn)量平穩(wěn)下降。這表明，TTMP對(duì)培養(yǎng)時(shí)間很敏感。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，培養(yǎng)基能提供充足的碳源、氮源，細(xì)胞處于生長(zhǎng)期，代謝旺盛，中間產(chǎn)物不斷增加，為TTMP的積累提供前體，TTMP產(chǎn)量相應(yīng)地提高，在培養(yǎng)時(shí)間36 h時(shí)，TTMP產(chǎn)量達(dá)到最大值。然而，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間大于36 h時(shí)，由于高溫培養(yǎng)時(shí)間過(guò)短，低溫時(shí)生成中間產(chǎn)物未能完全轉(zhuǎn)化為TTMP，因而TTMP生成量開始下降。因此，培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)選擇36 h。

2.1.2 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)TTMP的影響

現(xiàn)已證實(shí)，微生物生長(zhǎng)、代謝產(chǎn)物的合成均與酶的催化作用有關(guān)，在微生物代謝產(chǎn)物的合成過(guò)程中，培養(yǎng)溫度對(duì)微生物的生長(zhǎng)，關(guān)鍵酶酶活性具有重要影響[12]。如圖2所示，當(dāng)培養(yǎng)溫度從29 ℃升高到41 ℃時(shí)，產(chǎn)物TTMP含量呈上升趨勢(shì)，當(dāng)溫度高于41 ℃時(shí)，TTMP含量呈下降趨勢(shì)。在試驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，培養(yǎng)溫度41 ℃時(shí)TTMP產(chǎn)量達(dá)到最大值，比初始培養(yǎng)溫度（29 ℃）時(shí)的TTMP產(chǎn)量提高了7.68 倍。這表明產(chǎn)TTMP過(guò)程對(duì)培養(yǎng)溫度較為敏感。培養(yǎng)溫度過(guò)低，菌株生長(zhǎng)緩慢，生長(zhǎng)延滯期長(zhǎng)；溫度過(guò)高，則導(dǎo)致微生物細(xì)胞內(nèi)酶系失活，菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成受到抑制；適宜的培養(yǎng)溫度有利于菌體的生長(zhǎng)，同時(shí)酶活力較高，利于中間產(chǎn)物的積累，TTMP的產(chǎn)量最高。因此，選擇培養(yǎng)溫度36 h進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.3 水分含量對(duì)產(chǎn)TTMP的影響

如圖3所示，當(dāng)水分含量低于60%時(shí)，產(chǎn)物TTMP產(chǎn)量呈上升趨勢(shì)；當(dāng)水分含量為60%時(shí)， TTMP產(chǎn)量最高；當(dāng)水分含量高于60%時(shí)，呈下降趨勢(shì)。這表明，產(chǎn)TTMP S0507枯草芽孢桿菌對(duì)水分含量十分敏感，隨著水分含量的增加，枯草芽孢桿菌發(fā)酵活動(dòng)比較活躍，TTMP產(chǎn)量也相應(yīng)地提高。當(dāng)水分含量從45%上升至60%時(shí)，TTMP產(chǎn)量提高了1.64 倍。水分含量過(guò)高，培養(yǎng)基結(jié)塊，造成氧氣含量不夠，影響微生物生長(zhǎng)代謝。因此，培養(yǎng)基水分含量選擇60%。

圖3 水分含量對(duì)產(chǎn)TTMP的影響Fig.3 Effect of solid-to-liquid ratio on the yield of TTMP

2.1.4 原料比對(duì)產(chǎn)TTMP的影響

圖4 花生粉含量對(duì)產(chǎn)TTMP的影響Fig.4 Effect of wheat bran-to-peanut meal on the yield of TTMP

如圖4所示，隨著原料比（麩皮與花生粉質(zhì)量比）的下降，即花生粉含量的增大，產(chǎn)物TTMP含量增加。當(dāng)原料比（麩皮與花生粉質(zhì)量比）為5∶5，即花生粉含量為50%時(shí)，TTMP含量開始下降，且變化趨勢(shì)較平穩(wěn)。這表明，枯草芽孢桿菌S0507產(chǎn)TTMP的過(guò)程對(duì)花生粉含量較敏感，隨著花生粉含量的增加，枯草芽孢桿菌的發(fā)酵活動(dòng)較平穩(wěn)，菌體生長(zhǎng)代謝穩(wěn)定，TTMP產(chǎn)量也相應(yīng)地提高，但是提高幅度不大。當(dāng)花生粉含量增加至50%時(shí)，TTMP產(chǎn)量?jī)H提高了0.69 倍；當(dāng)花生粉含量繼續(xù)增加時(shí)，麩皮含量較少，微生物代謝所需的碳源不夠，導(dǎo)致TTMP含量下降。因此，花生粉含量為30%～50%時(shí)，最利于TTMP的生成和積累，且變化趨勢(shì)較平穩(wěn)。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)成本，麩皮2.0～5.0 元/kg，花生粉16.0～22.0 元/kg，綜合考慮，固定花生粉含量為30%，即麩皮、花生粉質(zhì)量比為7∶3。

2.2 響應(yīng)曲面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)

以培養(yǎng)時(shí)間（X1）、培養(yǎng)溫度（X2）、水分含量（X3）為自變量，以TTMP產(chǎn)量為響應(yīng)指標(biāo)，采用Box-Behnken方法設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Experimental design and results for response surface analysis

2.2.2 模型建立與方差分析

根據(jù)表1的試驗(yàn)結(jié)果，利用Design Expert v8.0.1.6軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所得主要分析結(jié)果如表2所示。

表2 回歸與方差分析結(jié)果Tbale 2 Results of regression and variance analysis

二次模型中回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)（表2）表明：因素X1、X2對(duì)產(chǎn)TTMP效果的線性效應(yīng)極顯著，因素X3對(duì)產(chǎn)TTMP效果的線性效應(yīng)不顯著；因素X12、X2

2、X3

2對(duì)產(chǎn)TTMP效果的曲面效應(yīng)顯著，因素X1X2、X2X3、X1X3對(duì)產(chǎn)TTMP效果的交互影響不顯著。對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多次擬合回歸，以TTMP產(chǎn)量（Y）為因變量，培養(yǎng)時(shí)間（X1）、培養(yǎng)溫度（X2）、水分含量（X3）為自變量建立回歸方程模型為：Y ＝320.39－58.24X1＋42.92X2－11.55X3＋11.37X1X2－6.45X1X3－0.93X2X3－77.08X12－103.82X22－90.83X32。另外，由表2可知，試驗(yàn)各因素對(duì)TTMP產(chǎn)量影響顯著程度由大到小依次為培養(yǎng)時(shí)間＞培養(yǎng)溫度＞水分含量；模型的回歸F值為28.021，P ＝ 0.000 9（P＜0.05），表明該模型極顯著；多元相關(guān)系數(shù)R2＝0.981，調(diào)整R2＝0.946，表明模型對(duì)試驗(yàn)實(shí)際情況擬合較好，但由于失擬較顯著（失擬P ＝0.015 3），需對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

2.2.3 響應(yīng)面圖及等高線圖分析

由響應(yīng)曲面圖和等高線圖（圖5～7）可知，培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)時(shí)間交互作用、水分含量與培養(yǎng)時(shí)間交互作用、水分含量與培養(yǎng)時(shí)間交互作用均不顯著，與表2中交互項(xiàng)P值的分析結(jié)果一致。

圖5 培養(yǎng)溫度與時(shí)間及其交互作用對(duì)TTMP產(chǎn)量影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour of effect showing the interactive effect of culture temperature and time on the yield of TTMP

由圖5可知，響應(yīng)曲面的坡度較為陡峭，表明TTMP產(chǎn)量對(duì)培養(yǎng)時(shí)間和溫度的變化較為敏感。在培養(yǎng)時(shí)間不變的條件下，隨著培養(yǎng)溫度水平的逐漸提高，TTMP產(chǎn)量呈先上升后下降的變化趨勢(shì)；在培養(yǎng)溫度不變的條件下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的逐漸增加，TTMP產(chǎn)量呈先上升后下降的趨勢(shì)，且變化較大。從等高線可看出培養(yǎng)時(shí)間變化對(duì)TTMP產(chǎn)量的影響比培養(yǎng)溫度變化對(duì)TTMP產(chǎn)量的影響更大。等高線呈圓形，表明兩因素之間的交互作用強(qiáng)度較弱，影響不顯著。

由圖6可知，響應(yīng)曲面的坡度較為陡峭，表明TTMP產(chǎn)量對(duì)培養(yǎng)時(shí)間和水分含量的變化較為敏感。在水分含量不變的條件下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的逐漸增加，TTMP產(chǎn)量先上升后下降；在培養(yǎng)時(shí)間不變的條件下，隨著水分含量的逐漸增大，TTMP產(chǎn)量先上升后下降。從等高線可看出培養(yǎng)時(shí)間變化對(duì)TTMP產(chǎn)量的影響比水分含量變化對(duì)TTMP產(chǎn)量的影響大。等高線呈圓形，表明兩因素之間的交互作用強(qiáng)度較弱，影響不顯著。

圖6 水分含量和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)TTMP產(chǎn)量交互作用影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour showing the interactive effect of solid-to-liquid ratio and culture time on the yield of TTMP

圖7 水分含量和培養(yǎng)溫度對(duì)TTMP產(chǎn)量交互作用影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.7 Response surface and contour showing the interactive effect of solid-to-liquid ratio and culture temperature on the yield of TTMP

由圖7可知，響應(yīng)曲面的坡度較為陡峭，表明TTMP產(chǎn)量對(duì)培養(yǎng)溫度和水分含量的變化較為敏感。在水分含量不變的條件下，隨著培養(yǎng)溫度的逐漸提高，TTMP產(chǎn)量先上升后下降；在培養(yǎng)溫度不變的條件下，隨著水分含量的逐漸增大，TTMP產(chǎn)量先上升后下降。從等高線可看出培養(yǎng)溫度變化對(duì)TTMP產(chǎn)量的影響比水分含量變化對(duì)TTMP產(chǎn)量的影響大。等高線呈圓形，表明兩因素之間的交互作用強(qiáng)度較弱，影響不顯著。

通過(guò)Design Expert（v8.0.1.6）軟件分析，枯草芽孢桿菌S0507產(chǎn)TTMP的最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)時(shí)間33.84 h、培養(yǎng)溫度41.75 ℃、水分含量59.63%，此條件下TTMP產(chǎn)量的理論值為335.49 mg/kg。

2.2.4 回歸模型的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為檢測(cè)所得結(jié)果的可靠性，對(duì)上述優(yōu)化條件進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，即麩皮與花生粉質(zhì)量比為7∶3、接種量為2%、培養(yǎng)時(shí)間為33.84 h、培養(yǎng)溫度41.75 ℃、水分含量59.63%，50 g的麩皮固態(tài)培養(yǎng)基，共培養(yǎng)時(shí)間共48 h，實(shí)際測(cè)得的平均TTMP產(chǎn)量為332.70 mg/kg，理論值與實(shí)驗(yàn)值的相對(duì)偏差為0.84%，證明應(yīng)用響應(yīng)曲面法優(yōu)化枯草芽孢桿菌S0507產(chǎn)TTMP的培養(yǎng)條件是可行的。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)單因素試驗(yàn)分析了培養(yǎng)條件對(duì)TTMP產(chǎn)量的影響，并結(jié)合Box-Behnken設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析，建立了枯草芽孢桿菌S0507發(fā)酵條件的二次多項(xiàng)式模型，并經(jīng)顯著性檢驗(yàn)證明了該模型具有可靠性。所得二次回歸方程為：Y＝ 320.39－58.24X1＋42.92X2－11.55X3＋11.37X1X2－6.45X1X3－0.93X2X3－77.08X12－103.82X22－90.83X32。該方程回歸系數(shù)極顯著，調(diào)整R2較高，實(shí)際擬合度較好。對(duì)方程進(jìn)行優(yōu)化，得枯草芽孢桿菌S0507最佳發(fā)酵條件：低溫培養(yǎng)時(shí)間為33.84 h、培養(yǎng)溫度為41.75 ℃、水分含量為59.63%、麩皮與花生粉質(zhì)量比為7∶3。在此條件下，TTMP實(shí)際產(chǎn)量為332.70 mg/kg，理論值（335.49 mg/kg）與實(shí)驗(yàn)值的相對(duì)偏差為0.84%，表明應(yīng)用響應(yīng)曲面法優(yōu)化枯草芽孢桿菌S0507產(chǎn)TTMP的培養(yǎng)條件是可行的。

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Response Surface Methodology for Optimization of Culture Conditions for the Production of Tetramethylpyrazine by Bacillus subtilis S0507

ZHU Sai-feng1, WU Jian-feng2, ZHAO Xi-rong1,*

(1. School of Chemical Engineering and Life Science, Huaiyin Institute of Technology, Huai’an 223003, China; 2. Jiangsu King’s Luck Brewery Joint-Stock Co. Ltd., Lianshui 223411, China)

Tetramethylpyrazine (TTMP) was prepared from Bacillus subtilis S0507 under solid-state fermentation. Response surface methodology (RSM) was applied to optimize the culture conditions. On the basis of the results of one-factor-at-atime experiments, a Box-Behnken design (BBD) was used to investigate the interactive effect of culture temperature, time and solid-to-liquid ratio (water content of the solid medium) on TTMP production, and the experimental data obtained were analyzed with Design-Expert v8.0.1.6 software. The optimal culture conditions as determined by response surface analysis were 33.84 h, 41.75 ℃ and water content of 59.63%. The measured yield of TTMP under the optimized conditions was 332.70 mg/kg, showing a relative deviation of 0.84% in comparison with the theoretically predicted value of 335.49 mg/kg. Thus, response surface methodology is feasible to optimize the culture conditions for TTMP production by Bacillus subtilis S0507.

tetramethylpyrazine; Bacillus subtilis; response surface methodology; gas chromatography (GC)

TS201.3

A

1002-6630（2014）09-0218-06

10.7506/spkx1002-6630-201409043

2013-06-25

祝賽峰（1990—），女，本科，研究方向?yàn)閭鹘y(tǒng)白酒中有益組分的開發(fā)和利用。E-mail：1053127348@qq.com

*通信作者：趙希榮（1961—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樯锎蠓肿拥母男耘c利用。E-mail：zhaoxirong1961@163.com