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        杏鮑菇污染菌的分離、鑒定及其特性

        2014-01-20 10:52:42姚璐曄沈金波裴丹丹孫丹鳳
        食品科學(xué) 2014年9期
        關(guān)鍵詞:消毒劑單胞菌生理

        姚璐曄,沈金波,戴 璐,裴丹丹,孫丹鳳,冀 宏

        杏鮑菇污染菌的分離、鑒定及其特性

        姚璐曄,沈金波,戴 璐,裴丹丹,孫丹鳳,冀 宏

        (常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,江蘇 常熟 215500)

        從夏季被細(xì)菌污染的杏鮑菇上分離純化得到2株病害菌(CTE722-B、CTE722-C),結(jié)合顯微結(jié)構(gòu)和生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以及對(duì)它們16S rDNA序列的分析確定這兩株菌的系統(tǒng)發(fā)育地位;通過(guò)抑菌圈實(shí)驗(yàn)考察幾種工廠常用消毒劑對(duì)病害菌的抑菌影響。結(jié)果表明:菌株CTE722-B鑒定為惡臭假單胞菌屬(Pseudomonas putida),CTE722-C為邊緣假單胞菌屬(Pseudomonas marginalis)。消毒劑菇保、甲酚皂、苯扎溴銨消毒液在短時(shí)間內(nèi)對(duì)這兩種細(xì)菌都有較好的抑菌效果;但因其具有揮發(fā)性,故防治效果不理想。從污染菇體分離得到的2株病害菌CTE722-B和CTE722-C被鑒定為假單胞菌屬,因常用消毒劑只在短時(shí)間內(nèi)對(duì)其有抑菌性,防治效果較差。

        杏鮑菇;病害菌;假單胞菌;特性

        隨著食用菌周年生產(chǎn)、多品種栽培的實(shí)現(xiàn)及栽培規(guī)模的不斷擴(kuò)大,食用菌病原病害的發(fā)生亦日趨嚴(yán)重。我國(guó)每年由病害菌造成的損失一般在10%以上,嚴(yán)重的地方可達(dá)90%[1]。食用菌的病原病害是指食用菌由于受到其他有害微生物寄生而引起的病害,也稱為侵染性病害。引起食用菌病害的微生物稱為病原菌,主要以細(xì)菌為主,包括拖拉氏假單胞菌(Pseudomonas tolasii)[2]、pv.agaricicola[3]、產(chǎn)堿假單胞菌(P. alcaligenes)[4]、熒光假單胞菌(P. fluorescens)[5]、洋蔥假單胞菌(P. cepaica)[6]和蘑菇假單胞菌(P. agarici)[7]。我國(guó)研究者對(duì)部分食用菌的細(xì)菌性病害也有深入研究,如關(guān)于半裸鐮刀菌(Fusarium semitectum)的報(bào)道,該菌侵染蘑菇子實(shí)體后,一般表現(xiàn)為生長(zhǎng)發(fā)育受阻,嚴(yán)重的長(zhǎng)大會(huì)變成僵菇或萎縮菇[8]。但這些研究都因缺乏后續(xù)的研究,尚未提出可靠有行的防治方法;而在實(shí)際生產(chǎn)中依然只能根據(jù)以往的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)出防治措施,造成理論研究與實(shí)際生產(chǎn)之間的脫節(jié)。

        本研究以昆山一家杏鮑菇生產(chǎn)廠多發(fā)于夏季的細(xì)菌污染菇為樣本,對(duì)其進(jìn)行分離純化培養(yǎng),并依據(jù)菌落特征、生理生化實(shí)驗(yàn)及分子生物學(xué)手段對(duì)分離得到的病原菌進(jìn)行種屬的鑒定,并研究了常用消毒劑對(duì)其的抑菌效果。

        1 材料與方法

        1.1 材料、培養(yǎng)基與試劑

        杏鮑菇 昆山振興食用菌有限公司提供。

        牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏3、NaCl 5、蛋白胨10,pH 7.2~7.4。

        菇保(二氯異尿酸鈉產(chǎn)品)、甲酚皂、苯扎溴銨消毒液及高錳酸鉀 昆山振興食用菌有限公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        M124A電子天平 伯拉莫貝林(上海)精密儀器有限公司;FE20便攜式(數(shù)顯)pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;CJ-2S超凈工作臺(tái) 天津泰斯特儀器有限公司;ZQWY-200G振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司;PQX-280A-22HM人工氣候箱 寧波萊福科技有限公司;Centrifuge 5418R高速冷凍離心機(jī)、移液槍 德國(guó)Eppendorf公司;DYY-6C電泳儀 北京六一儀器廠。

        1.3 方法

        1.3.1 病害菌的分離純化

        取10 g病態(tài)杏鮑菇的部分組織加入90 mL無(wú)菌生理鹽水,振蕩20 min,稀釋,取0.2 mL稀釋液涂布在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上,30 ℃培養(yǎng)24 h,挑取一環(huán)單菌落,保存在牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上備用。

        1.3.2 病害菌的生理生化鑒定

        對(duì)經(jīng)分離純化得到的菌株進(jìn)行顯微結(jié)構(gòu)、染色觀察及相關(guān)生理生化鑒定[9-13]。

        1.3.3 病害菌的分子生物學(xué)鑒定

        提取菌株的16S rDNA,使用TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit(No. D310),進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段。反應(yīng)條件具體為:94 ℃、5 min ;94 ℃ 1 min、55 ℃ 1 min、72 ℃ 1.5 min,30 次循環(huán);72 ℃、5 min 。反應(yīng)結(jié)束,取5 μL反應(yīng)液進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳,切膠回收目的片段。送于上海寶生物公司進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)。選取同源性比較高的典型菌株的16S rDNA基因序列作為參比對(duì)象,用CLUSTAL X軟件進(jìn)行多序列比對(duì)并計(jì)算目標(biāo)菌株與參比菌株之間的序列相似性[14-15],采用鄰位相接法(Neighbor-Joining)[16-17],應(yīng)用MEGA 4.0軟件構(gòu)建目標(biāo)菌株與參比菌株之間的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[17]。

        1.3.4 消毒劑抑菌效果實(shí)驗(yàn)

        取0.2 mL菌懸液涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上,用無(wú)菌鑷子將含消毒劑(菇保 0.2 g/mL、甲酚皂 10%、苯扎溴銨消毒液 0.071 mL/mL)的濾紙片(濾紙片直徑10 mm)置于平板上,30 ℃培養(yǎng)24 h,用卡尺測(cè)量抑菌圈大小。以所測(cè)抑菌圈的平均直徑(mm)來(lái)表示藥劑對(duì)細(xì)菌的抑菌力。抑菌效果用下式[18]表示。

        在實(shí)際生產(chǎn)中,每天都會(huì)使用消毒劑對(duì)操作空間、工人等進(jìn)行消毒,但仍出現(xiàn)了細(xì)菌污染現(xiàn)象。對(duì)此實(shí)驗(yàn)將消毒劑敞開(kāi)放置不同時(shí)間之后,考察其抑菌效力。具體過(guò)程如下:分別將消毒劑敞口放置0.5、1、1.5、2 h后,用無(wú)菌鑷子將含放置不同時(shí)間的消毒劑的濾紙片置于事先涂布的平板上,30 ℃培養(yǎng)24 h,用卡尺測(cè)量抑菌圈大小。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 污染杏鮑菇樣本的性狀

        圖1 菌絲包(A)和菇體污染樣本(B)Fig.1 Polluted mycelia (A) and fruit bodies (B) of Pleurotus eryngii

        如圖1所示,污染杏鮑菇樣本在菌絲生長(zhǎng)階段,在料袋上出現(xiàn)零星的黃色水珠,黏度不大,這一現(xiàn)象導(dǎo)致菌絲長(zhǎng)滿袋的時(shí)間延長(zhǎng)5~7 d;且這現(xiàn)象一般出現(xiàn)在袋口附近,緩慢向下蔓延至整個(gè)料包的1/4為止。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的料包在菌絲長(zhǎng)滿之后進(jìn)入出菇環(huán)節(jié),經(jīng)過(guò)正常的消毒環(huán)節(jié)后,長(zhǎng)出子實(shí)體,但隨著子實(shí)體的增大,菇體會(huì)出現(xiàn)大量黃色黏稠狀水珠,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),被污染的菇體最終會(huì)腐爛,而與之接觸的健康菇體也會(huì)被感染,出現(xiàn)相同的癥狀。

        在菌絲生長(zhǎng)階段,若在無(wú)菌條件下去除黃色水珠,會(huì)大幅度降低后期菇體的污染情況以及推遲出現(xiàn)黃色黏稠液體的時(shí)間。因此斷定,菌絲生長(zhǎng)階段出現(xiàn)的黃色水珠與后期在子實(shí)體上的黃色液體為同一菌株的胞外分泌物。

        2.2 污染病害菌的分離

        圖2 平板培養(yǎng)的兩種菌株Fig.2 The two strains cultured on plates

        分別挑取菌絲料包上的水珠和污染菇體,進(jìn)行涂布培養(yǎng)。如圖2所示,兩個(gè)樣本的培養(yǎng)結(jié)果類似,均出現(xiàn)了兩種細(xì)菌,證實(shí)這一污染現(xiàn)象是由兩種微生物引起,分別命名為CTE722-B和CTE722-C;只是兩者比例有差異,前者CTE722-B較多,CTE722-C較少,后者則反之。在培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,CTE722-B為半透明、淡黃色的圓形菌落,表面隆起,邊緣略粗糙;CTE722-C為半透明、乳白色的圓形菌落,邊緣整齊光滑;CTE722-B的菌落直徑較CTE722-C的大。

        2.3 病害菌的個(gè)體形態(tài)特征

        圖3 CTE722-B(A)和CTE722-C(B)的革蘭氏染色結(jié)果(×1 000)Fig.3 Gram staining of CTE722-B (A) and CTE722-C (B)(×11 000000)

        通過(guò)普通光學(xué)顯微鏡對(duì)病害菌的菌體形態(tài)進(jìn)行觀察,結(jié)果如圖3所示,CTE722-B為桿菌,不呈螺旋形,不產(chǎn)芽孢,細(xì)胞以單個(gè)排列,革蘭氏染色陰性;CTE722-C為短桿菌,不產(chǎn)芽孢,細(xì)胞單個(gè)排列,革蘭氏染色陰性。

        2.4 病害菌的生理生化實(shí)驗(yàn)

        2.4.1 菌株CTE722-B的生理生化特征

        表1 菌株CTE722-B與假單胞菌屬部分菌株的生理生化特征Table 1 Physiological properties of strain CTE722-B and some species of the genus Pseudomonas

        由表1可知,病害菌CTE722-B能夠氧化利用葡萄糖產(chǎn)酸,不能發(fā)酵乙醇產(chǎn)酸,接觸酶和氧化酶反應(yīng)均為陽(yáng)性,兼性厭氧。結(jié)合細(xì)胞形態(tài)、革蘭氏染色等結(jié)果,參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[11-12],初步判斷病害菌CTE722-C屬于假單胞菌屬(Pseudomonas)的細(xì)菌。參照上述細(xì)菌分類鑒定手冊(cè)對(duì)假單胞菌的鑒定方法,進(jìn)行了其他生理生化實(shí)驗(yàn),并和Pseudomonas的細(xì)菌進(jìn)行比較。病害菌CTE722-B生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果和惡臭假單胞菌(P. putida)基本一致,結(jié)合細(xì)胞形態(tài)、革蘭氏染色等結(jié)果,初步判斷病害菌CTE722-B 是一株惡臭假單胞菌(P. putida)。

        2.4.2 菌株CTE722-C的生理生化特征

        表2 菌株CTE722-C與假單胞菌屬部分菌株的生理生化特征Table 2 Physiological properties of strain CTE722-C and some species of the genus Pseudomonas

        由表2可知,病害菌CTE722-C能夠氧化利用葡萄糖產(chǎn)酸,不能發(fā)酵乙醇產(chǎn)酸,接觸酶和氧化酶反應(yīng)均為陽(yáng)性,兼性厭氧。結(jié)合細(xì)胞形態(tài)、革蘭氏染色等結(jié)果,參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[11-12],初步判斷病害菌CTE722-C屬于假單胞菌屬(Pseudomonas)的細(xì)菌。參照上述細(xì)菌分類鑒定手冊(cè)對(duì)假單胞菌的鑒定方法,進(jìn)行了其他生理生化實(shí)驗(yàn),并和Pseudomonas的細(xì)菌進(jìn)行比較。

        從表2中可以看出,病害菌CTE722-C生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果和邊緣假單胞菌(P. marginalis)基本一致,結(jié)合細(xì)胞形態(tài)、革蘭氏染色等結(jié)果,初步判斷病害菌CTE722-C是1株邊緣假單胞菌(P. marginalis)。

        2.5 16S rDNA序列分析

        圖4 菌株CTE722-B和CTE722-C的16S rDNA電泳圖Fig.4 Electrophoresis patterns of 16S rDNA products from strains CTE722-B and CTE722-C

        如圖4所示, 通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離后,得到PCR產(chǎn)物,切膠回收片段進(jìn)行DNA測(cè)序。將菌株CTE722-B的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的細(xì)菌16S rDNA序列進(jìn)行BLAST同源性比對(duì),結(jié)果發(fā)現(xiàn)CTE722-B的16S rDNA序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中Pseudomonas屬細(xì)菌的16S rDNA序列自然聚類。在16 個(gè)最相近的系列中(同源性99%~100%),假單胞菌(Pseudomonas)占12 個(gè),其余4 個(gè)為未鑒定細(xì)菌。同理,將菌株CTE722-C的16S rDNA序列與相關(guān)序列進(jìn)行同源性比對(duì),同樣有16 個(gè)最相近的序列(同源性99%~100%),假單胞菌(Pseudomonas)占15 個(gè),其余1 個(gè)為未鑒定細(xì)菌。選取合適的序列與菌株CTE722-B、CTE722-C用MEGA4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),結(jié)果如圖5所示。CTE722-B與P. putida(登記號(hào):AB680572)聚為一群,CTE722-C與P. marginais(登記號(hào):JQ438826)聚為一群,再次表明CTE722-B屬于P. putida,CTE722-C屬于P. marginais。

        圖5 基于16S rDNA的菌株CTE722-B和CTE722-C的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of strains CTE722-B and CTE722-C based on their 16S rDNA sequences

        2.6 不同消毒劑對(duì)病害菌的抑菌效果

        如表3所示,幾種常用的消毒劑中,高錳酸鉀對(duì)菌株CTE722-B、CTE722-C無(wú)抑菌作用,其余3種消毒劑對(duì)病害菌有抑菌效果,菇保效果最佳??疾旆胖靡欢螘r(shí)間后消毒劑的抑菌效力,結(jié)果如圖6~8所示。隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)3 種消毒劑對(duì)病原菌的抑菌效果逐步降低;在放置的2 h內(nèi),3 種消毒劑的抑菌效果都出現(xiàn)了顯著下降;其中甲酚皂和苯扎溴銨消毒液在放置2 h后,抑菌效果僅為10%左右,幾乎沒(méi)有抑菌作用。0.2 g/mL的菇寶溶液對(duì)病原菌有顯著的抑菌效果,雖然放置時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致抑菌效果下降,但在2 h仍能保持30%的抑菌效果,這一特性對(duì)于工廠消毒是有利的。

        表3 3 種消毒劑平板抑菌效果Table 3 Bacteriostatic effects of three sanitizers

        圖6 菇保不同放置時(shí)間對(duì)抑菌效力的影響Fig.6 Effect of air-exposure time of dichloroisocyanuric acid sodium salt before use on bacteriostasis

        圖7 甲酚皂不同放置時(shí)間對(duì)抑菌效力的影響Fig.7 Effect of air-exposure time of cresol soap before use on bacteriostasis

        圖8 苯扎溴銨消毒液不同放置時(shí)間對(duì)抑菌效力的影響Fig.8 Effect of air-exposure time of benzalkonium bromide before use on bacteriostasis

        3 結(jié) 論

        本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象為引起杏鮑菇生產(chǎn)廠(昆山正興食用菌有限公司)夏季常見(jiàn)污染現(xiàn)象的病害菌。通過(guò)分離純化得到兩株病害菌(CTE722-B、CTE722-C);根據(jù)菌體形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析結(jié)果以及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)特征,根據(jù)多相分類原則,可將病害菌CTE722-B鑒定為惡臭假單胞菌種(P. putida)的菌株,CTE722-C為邊緣假單胞菌種(P. marginalis)。

        考察該工廠常用的消毒劑,菇保(二氯異尿酸鈉產(chǎn)品)、甲酚皂、苯扎溴銨消毒液及高錳酸鉀對(duì)菌株CTE722-B、CTE722-C的抑菌效果。結(jié)果表明質(zhì)量濃度為0.2 g/mL的菇保溶液抑菌效果最佳。菇寶的主要成分是二氯異氰尿酸納,常采用燃燒產(chǎn)生煙霧的方式對(duì)空氣環(huán)境及物體表面進(jìn)行消毒。在工廠的制種車間使用時(shí),一般是在消毒后的0.5 h后完成無(wú)菌操作,這一操作要求與實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致;但在對(duì)于一般廠房的消毒,常采用甲酚皂和苯扎溴銨消毒液輪流使用。因此即使在嚴(yán)格的操作流程下,生產(chǎn)期間仍出現(xiàn)了不同規(guī)模的染菌現(xiàn)象?;诒敬螌?shí)驗(yàn)結(jié)果,建議工廠可使用菇寶對(duì)菌絲發(fā)生室及菇房進(jìn)行消毒,從而降低由惡臭假單胞菌種(P. putida)和邊緣假單胞菌種(P. marginais)造成的污染情況。但由于菇寶揮發(fā)的氣味刺激性較強(qiáng),長(zhǎng)期在開(kāi)放的環(huán)境下使用會(huì)造成污染,因此尋求更合適的防治方法是必需的,而本研究?jī)?nèi)容也將為后續(xù)防治方法的探尋提供理論依據(jù)。

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        Isolation, Identification and Characterization of Contaminant Bacteria from Pleurotus eryngii

        YAO Lu-ye, SHEN Jin-bo, DAI Lu, PEI Dan-dan, SUN Dan-feng, JI Hong

        (School of Biology and Food Engineering, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500, China)

        This study aimed to identify and characterize the pathogenic bacteria which caused pollution in Pleurotus eryngii. Two strains named CTE722-B and CTE722-C were isolated from Pleurotus eryngii polluted in summer collected from a mushroom factory. According to their microstructure, physiological, biochemical properties and 16S rDNA sequences, the phylogenetic positions of the two strains were defined. By measuring the diameter of inhibition zone, the efficacy of sanitizers commonly used in the food industry against them was investigated. The results showed that CTE722-B and CTE722-C were identified as Pseudomonas putida and Pseudomonas marginais, respectively. Although the growth of two strains was restrained within a short time after adding dichloroisocyanuric acid sodium salt, cresol soap or benzalkonium bromide into the medium, the antibacterial efficacy of these sanitizers was poor due to the high volatility.

        Pleurotus eryngii; pathogenic bacteria; Pseudomonas; characteristics

        Q936

        A

        1002-6630(2014)09-0213-05

        10.7506/spkx1002-6630-201409042

        2013-06-24

        蘇州應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目 (SYN201007;SYN201212);江蘇省高等學(xué)校大學(xué)生實(shí)踐創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(201210333014);常熟理工學(xué)院重點(diǎn)畢業(yè)論文資助項(xiàng)目(LG27)

        姚璐曄(1983—),女,實(shí)驗(yàn)師,碩士研究生,研究方向?yàn)槭秤镁N及其病害菌。E-mail:yaoluye@cslg.com

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