熊 濤，唐曉星，黃 濤，李 嘯

產(chǎn)蛋白酶兼性厭氧菌株的篩選、酶學性質(zhì)及發(fā)酵豆粕應用探究

熊 濤，唐曉星，黃 濤，李 嘯

（南昌大學生命科學與食品工程學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

為篩選得到1 株或幾株深層發(fā)酵豆粕效果較好的菌株，以透明圈法從自然發(fā)酵的豆豉中篩選出4 株兼性厭氧且產(chǎn)蛋白酶菌株，同時發(fā)現(xiàn)菌株B-1、B-12在厭氧條件下產(chǎn)蛋白酶能力好于好氧條件，對此現(xiàn)象較明顯且平板水解圈直徑較大的菌株B-1進行形態(tài)學、生理生化和分子生物學實驗，鑒定為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌。進一步對菌株B-1的蛋白酶酶學性質(zhì)進行研究后發(fā)現(xiàn)，酶活力在pH 6.0～9.0的范圍內(nèi)能夠維持一個較高的水平，酶反應和酶穩(wěn)定 最適條件為pH 7.0和40 ℃，加入Mn2+對酶反應的促進作用較大。將甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌B-1以6%的接種量接種于豆粕固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中堆積（20 cm）發(fā)酵，以枯草芽孢桿菌A-12好氧淺層發(fā)酵和未發(fā)酵豆粕作為對照，發(fā)酵結(jié)束后測得豆粕中小肽含量和水解度分別高達28.37%和29.55%，比枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵對照組分別高出了9.04%和16.07%，與未發(fā)酵豆粕相比，菌株B-1發(fā)酵后豆粕的小肽含量和水解度也分別提高了27.22%和29.13%。

蛋白酶；兼性厭氧；甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌；鑒定；酶學性質(zhì)；發(fā)酵豆粕

豆粕是我國飼料工業(yè)中的主要植物蛋白原料，其粗蛋白質(zhì)含量高達43%以上[1]；但豆粕中含有的多種抗營養(yǎng)因子如胰蛋白酶抑制因子、大豆凝集素、大豆抗原蛋白、尿酶、植酸等，抑制了幼齡動物對蛋白質(zhì)分子的有效吸收，進而對其健康產(chǎn)生一定不良影響[2-4]。采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)豆粕不僅可以降解抗營養(yǎng)因子、分解大分子蛋白質(zhì)為小肽和氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，還可以在發(fā)酵過程中對某些苦味肽基團進行移接、重排等修飾，改善其口感[5]，提高豆粕品質(zhì)。

如今，豆粕的發(fā)酵大多采用好氧 淺層發(fā)酵方式，與深層發(fā)酵相比，不僅占地面積大、發(fā)酵生產(chǎn)效率低，而且只能采用淺層架式生產(chǎn)難以實現(xiàn)機械化[6-7]，因而，篩選出性能良好的兼性厭氧產(chǎn)蛋白酶菌株用于深層發(fā)酵不僅能夠節(jié)約生產(chǎn)成本和資源、而且能夠提高發(fā)酵豆粕的生產(chǎn)效率。本實驗以兼性厭氧、產(chǎn)蛋白酶為條件在自然發(fā)酵的豆豉中篩選得到1 株甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌，其在國內(nèi)外的報道中主要用于作物病害的防治[8-10]、生物表面活性劑[11]、產(chǎn)氨肽酶的研究[12]等方面，本研究中將甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌應用于豆粕發(fā)酵，與現(xiàn)今常用的枯草芽孢桿菌好氧淺層發(fā)酵相比，發(fā)現(xiàn)其在豆粕堆積（20 cm）發(fā)酵過程中，小肽產(chǎn)量和水解度顯著提高，以期為豆粕深層發(fā)酵提供優(yōu)良菌種。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

自 然發(fā)酵豆豉。

三氯乙酸 天津市大茂化學試劑廠；福林-酚試劑上海君瑞生物技術有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

PHS-2F型紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；k05A自動定氮儀 上海晟聲自動化分析儀器有限公司；雷磁Phs-25型數(shù)顯pH測定儀 上海精密科學儀器有限公司；LXJ-IIB型離心機 上海安亭科學儀器廠；YQX-Ⅱ型厭氧培養(yǎng)箱 金壇市盛藍儀器制造有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基：取4.0 g干酪素于100 mL蒸餾水中，加少許NaOH溶解，115 ℃滅菌20 min；另取牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、氯化鈉5.0 g、瓊脂20.0 g溶于900 mL蒸餾水中，121 ℃滅菌20 min；待冷卻至45～50 ℃，在無菌操作條件下將它們混合，調(diào)節(jié)pH值為7.0。

菌種活化培養(yǎng)基：牛肉膏-蛋白胨固體培養(yǎng)基[13]。

種子培養(yǎng)基：牛肉膏-蛋白胨液體培養(yǎng)基[13]。

液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基：玉米粉20.0 g/L、牛肉膏10.0 g/L、磷酸二氫鈉 2.0 g/L，調(diào)節(jié)pH值為6.0。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：豆粕（30 目）50.0 g、麩皮2.0 g、葡萄糖1.0 g、自來水50 mL，121 ℃滅菌20 min。

1.4 方法

1.4.1 兼性厭氧產(chǎn)蛋白酶菌株的平板篩選

取5 g樣品于100 mL生理鹽水中，振蕩混合均勻，將樣品懸液按照每級稀釋10倍的次序制得10-1～10-77 個濃度，分別從10-3、10-4、10-5、10-6和10-75 個濃度中吸取100 μL稀釋液加至篩選培養(yǎng)基涂布，每個稀釋度做3 個重復，挑取可產(chǎn)生水解圈菌落，劃線于篩選培養(yǎng)基，37 ℃分別好氧與厭氧培養(yǎng)48 h，測量菌落直徑（d，mm）和其產(chǎn)生的水解圈直徑（D，mm），挑選出（D/d）較大且兼性厭氧生長的菌株進行鑒定。

1.4.2 鑒定

菌落形態(tài)及個體形態(tài)觀察[14]：將菌株劃線接種于牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基，觀察菌落形狀、質(zhì)地、顏色、菌落邊緣等菌落特征、并取幼齡菌株染色，在油鏡下觀察記錄菌株的形態(tài)學特征。

生理生化實驗[14-15]：參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》，對篩選得到的菌株進行接觸酶實驗、葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣實驗、V-P反應、甲基紅反應等生理生化實驗。

分子生物學實驗：使用細菌基因組試劑盒提取細菌基因組DNA，細菌16S rRNA基因的通用引物是正向5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向5’-ACGGCTACCTTGTTACGA-3’。聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）反應體系包括：上下游引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL，Taq酶0.2 μL，無菌去離子水補充至50 μL。PCR擴增條件為：94 ℃、5 min；94 ℃、1 min，55 ℃、1 min，72 ℃、1.5 min，共30 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應[16]。擴增產(chǎn)物回收后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行雙向測序，將所得16S rRNA基因序列在GenBank中進行比對，使用MEGA5.2軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4.3 篩選菌株的蛋白酶酶學性質(zhì)研究

1.4.3.1 粗酶液的提取

準確稱取發(fā)酵豆粕5.0 g，加入蒸餾水定容至100 mL，在40 ℃條件下浸提1 h，其間用玻璃棒攪拌，4 500 r/min離心15 min，取上清液待測。

1.4.3.2 蛋白酶活力的測定

采用福林-酚法[17]，以每毫升發(fā)酵液在40 ℃條件下，1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸作為1 個酶活力單位（U）。

1.4.3.3 酶反應的最適pH值

將粗酶液分別用pH值為3.0～10.0的緩沖液適當稀釋，40 ℃條件下與2 g/100 mL酪蛋白精確反應10 min；福林-酚法測酶活力。

1. 4.3.4 酶反應的pH穩(wěn)定性

將粗酶液分別用pH值為3.0～10.0的緩沖液適當稀釋、40 ℃水浴保溫60 min后，與2 g/100 mL酪蛋白精確反應10 min，福林-酚法測酶活力。

1.4.3.5 酶反應的最適溫度

將粗酶液用pH值為7.0的磷酸緩沖液適當稀釋后分別置于30、40、50、60、70 ℃的條件下，與2 g/100 mL酪蛋白精確反應10 min，福林-酚法測酶活力。

1.4.3.6 酶反應的溫度穩(wěn)定性

將粗酶液用pH值為7.0的磷酸緩沖液適當稀釋后分別置于30、40、50、60、70 ℃的條件下精確保溫10、20、30、40、50、60 min，與2 g/100 mL酪蛋白精確反應10 min，福林-酚法測酶活力。

1.4.3.7 金屬離子、NH4+對酶反應的影響

將粗酶液用pH 7.0的磷酸緩沖液適當稀釋，再在其中加入各種金屬離子（K+、Fe2+、Gu2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+）和NH4+，使其終濃度均達到0.01 mol/L，然后與2 g/100 mL酪蛋白精確反應10 min，福林-酚法測酶活力。

1.4.4 菌株發(fā)酵豆粕各項指標測定

將甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌B-1以6%的接種量接入堆積高度為20 cm的豆粕中進行固態(tài)發(fā)酵，以實驗室保藏的枯草芽孢桿菌A-12好氧淺層發(fā)酵及未發(fā)酵豆粕作為對照。在37 ℃條件下，甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌B-1發(fā)酵豆粕96 h成熟后分別測得的粗蛋白、小肽含量和水解度。

發(fā)酵豆粕粗蛋白含量的測定[18]：采用國家標準GB/T6432—1994《飼料中粗蛋白的測定方法》中的凱氏定氮法。

發(fā)酵豆粕小肽含量的測定[19]：采用QB/T 2653—2004《大豆肽粉》行業(yè)標準。

發(fā)酵豆粕水解度的測定[20]：采用甲醛固定法和凱氏定氮法測定發(fā)酵豆粕中游離－NH2的含量（μmol/mL）和總氮（N）含量，根據(jù)下式計算發(fā)酵豆粕的水解度。

式中：6.25×N為1.00 mL水解液中蛋白質(zhì)含量/（mg/mL）；0.33為原料大豆蛋白中－NH2的含量/（mmol/g）；7.8為每克大豆蛋白質(zhì)中的肽鍵毫摩爾數(shù)/（mmol/g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選結(jié)果

好氧與厭氧條件下菌株的生長情況和產(chǎn)蛋白酶能力如表1、2所示，菌株B-1、B-3

、B-7、B-12為兼性厭氧產(chǎn)蛋白酶菌株，在這4株菌株中，B-7在好氧情況下平板劃線D/d最大，為3.87，其次為B-1、B-3、B-12；但是在厭氧培養(yǎng)條件下，B-1平板劃線的D/d值高達7.16，其次為B-12、B-7、B-3；其中菌株B-1、B-12在厭氧條件下產(chǎn)生的水解圈直徑與菌落直徑紙比大于好氧條件下的直徑比，而菌株B-1的此現(xiàn)象最為明顯，如圖1所示，其在厭氧條件下D/d值為好氧條件下的1.9倍，猜測厭氧條件有利于菌株蛋白酶的產(chǎn)生，但是，厭氧培養(yǎng)條件下的菌落直徑比好氧條件下略小。綜上好氧與厭氧條件下的D/d值，選取菌株B-1為最優(yōu)菌株。

表1 產(chǎn)蛋白酶菌株好氧篩選Table 1 Screening of the protease-producing strains under aerobic conditions

表2 產(chǎn)蛋白酶菌株厭氧篩選Table 2 Screening of the protease-producing strains under anaerobic conditions

圖1 菌株B-1在好氧（a）、厭氧（b）培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的透明圈Fig.1 Transparent inhibition zones of bacterial strain B-1 under aerobic (a) and anaerobic (b) conditions

2.2 菌株B-1的鑒定結(jié)果

2.2.1 菌株B-1的形態(tài)學特征

圖2 菌株B-1的芽孢染色（a）及革蘭氏染色（b）Fig.2 Spore staining (a) and Gram staining (b) of strain B-1

表3 菌株B-1的生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain B-1

菌株B-1的生理生化實驗結(jié)果見表3，根據(jù)《伯杰細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》中芽孢桿菌屬的特征描述，確定菌株B-1屬于芽孢桿菌屬。

2.2.3 菌株B-1的分子生物學實驗

圖3 菌株B-1的16S rRNA 的PCR擴增結(jié)果Fig.3 PCR amplification of 16S rRNA gene from strain B-1

圖4 依據(jù)16S rRNA序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of B-1 based on 16S rRNA sequences with MEGA5.2 software

菌株B-1的16S rRNA的PCR擴增結(jié)果如圖3所示，通過與Marker的對照可知，16S rRNA的片段大小在1 500 bp左右，與預期結(jié)果相同；對菌株B-1進行16S rRNA基因序列分析，將此序列在網(wǎng)站Eztaxon server 2.1（http://147.47.212.35:8080/）與標準菌株進行比對，分析結(jié)果顯示與甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）的同源性最近，高達100%；選取與此序列同源性在99%及以上的14株菌株，使用MEGA5.2軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹（鄰接法），見圖4，菌株B-1與甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌屬于同一個分支，且生理生化特征與Bacillus methylotrophicus相符，結(jié)合個體、菌落形態(tài)、生理生化實驗和分子生物學實驗，鑒定為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌。

2.3 菌株B-1的酶學性質(zhì)

2.3.1 最適pH值

圖5 酶反應的最適pH值Fig.5 Optimal pH for the enzyme reaction

在不同pH值緩沖液中測得的酶活力如圖5所示，酶活力在pH 6.0～9.0的范圍內(nèi)能夠維持一個較高的水平，且在pH值為7.0時達到最高，為118.0 U/mL，由此可見，甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌B-1在中性條件下酶活力達到最大，同時，在偏酸性和偏堿性的環(huán)境中蛋白酶活力也較高。

2.3.2 pH值穩(wěn)定性

圖6 pH值對蛋白酶穩(wěn)定性的影響Fig. 6 Effect of pH on the stability of the protease

將粗酶液用不同pH值的緩沖液稀釋后，置于40℃水浴保溫60 min，福林-酚法測得的剩余酶活力如圖6所示，在pH 6.0～7.0范圍內(nèi)，酶活力保持在80%以上，但在過酸和過堿的環(huán)境下酶活力則會迅速降低，由此可見，在中性環(huán)境中此蛋白酶具有較好的穩(wěn)定性。

2.3.3 最適溫度

圖7 酶反應的最適溫度Fig.7 Optimal temperature for the enzyme reaction

在不同溫度的水浴條件下測得的酶活力如圖7所示，從30 ℃開始，酶活力逐漸升高，到達40 ℃時，酶活力達到最大，然后開始緩慢下降，溫度到達50 ℃時，酶活力開始迅速下降，70 ℃時，酶蛋白幾乎完全失活。

2.3.4 蛋白酶的熱穩(wěn)定性

圖8 蛋白酶的熱穩(wěn)定性Fig.8 Effect of temperature on the stability of the protease

將粗酶液用pH 7.0的磷酸緩沖液稀釋，置于不同的溫度條件下，分別保溫0、10、20、30、40、50、

60 min，測得的剩余酶活力如圖8所示，40 ℃保溫

60 min后，剩余酶活力仍然在80%以上，30、50 ℃時酶活力隨保溫時間的延長呈逐漸下降趨勢，60 min時，剩余酶活力在30%以下；60、70 ℃時保溫10 min內(nèi)相對酶活力降至10%以下。

2.3.5 金屬離子、NH4+對酶反應的影響+對酶反應的影響Fig.9 Effect of metal and ammonium ions on the enzyme reaction

圖9 金屬離子、NH4

如圖9所示，金屬離子和NH4+對酶的催化反應均有不同程度的促進作用，其中加入Mn2+對酶反應的影響最為明顯，相對酶活力為同條件下無離子添加酶活力的

279.1 %；另外，K+、Mg2+、NH4+的促進作用也很明顯，相對酶活力均達到了200%以上，由此推測其產(chǎn)生的蛋白酶為金屬酶。

2.4 發(fā)酵初步實驗

圖10 未發(fā)酵豆粕與菌株A-12、B-1發(fā)酵豆粕的粗蛋白含量（a）、小肽含量（b）和水解度（cc）Fig.10 Comparison of crude protein (a) and small peptide contents (b) and hydrolysis degree (c) between unfermented soybean meal and that fermented by strain A-12 or B-1

37 ℃甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌B-1發(fā)酵豆粕96 h成熟后分別測得的粗蛋白、小肽含量和水解度如圖10a～c所示，其中，兩株菌A-12、B-1發(fā)酵豆粕的粗蛋白含量分別為56.90%和53.39%，比起未發(fā)酵豆粕分別提高了11.04%和7.53%；枯草芽孢桿菌A-12發(fā)酵豆粕粗蛋白產(chǎn)量略高于甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌發(fā)酵豆粕的粗蛋白含量；甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌B-1發(fā)酵豆粕的小肽含量和水解度高達28.37%和29.55%，比起枯草芽孢桿菌A-12發(fā)酵豆粕分別高出了9.04%和16.07%，與未發(fā)酵豆粕相比，菌株B-1發(fā)酵后豆粕的小肽含量和水解度分別提高了27.22%和29.13%。

3 結(jié) 論

從自然發(fā)酵的豆豉中篩選出1 株兼性厭氧產(chǎn)蛋白酶菌株B-1，經(jīng)形態(tài)學、生理生化、分子生物學實驗鑒定為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌，進一步對其酶學性質(zhì)進行研究后發(fā)現(xiàn)，40 ℃、pH 7.0時酶活力和酶的穩(wěn)定性最高，Mn2+對酶反應促進作用最為明顯，相對酶活力為279.1%。將甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌接種于豆粕進行固態(tài)發(fā)酵（堆積20 cm），測得豆粕中小肽含量和水解度分別高達28.37%和29.55%，比枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵對照組分別高出了9.04%和16.07%，與未發(fā)酵豆粕相比，菌株B-1發(fā)酵后豆粕的小肽含量和水解度分別提高了27.22%和29.13%。研究發(fā)現(xiàn)，比起常用菌株枯草芽孢桿菌，甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌B-1在發(fā)酵過程中能夠更有效、高效地分解豆粕中的大分子蛋白質(zhì)為營養(yǎng)物質(zhì)，且因其兼性厭氧，比起嚴格好氧菌，甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌B-1對發(fā)酵場地、設施要求較低，可節(jié)約發(fā)酵豆粕的生產(chǎn)成本，有利于工業(yè)化低成本高效率生產(chǎn)運作；但是，現(xiàn)階段甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌還不屬于飼料添加的許可菌株，其毒理性有待進一步研究。

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Screening of Protease-Producing Bacterium in Facultative Anaerobic Conditions, Studies on Its Enzymatic Characterization and Application for Fermenting Soybean Meal

XIONG Tao, TANG Xiao-xing, HUANG Tao, LI Xiao
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Life Sciences and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

An efficient protease–producing and facultative anaerobic bacterium B-1 was i solated from naturally fermented Douchi by transparent inhibition zone plate assay. The diameter of inhibition zones in anaerobic conditions was found to be bigger than in aerobic conditions. Based on physiological and biochemical identification and 16S rRNA sequence analysis, it was identified as Bacillus methylotrophicus. Meanwhile, this study revealed that the optimal pH and temperature for protease activity and stability from Bacillus methylotrophicus B-1 were pH 7.0 and 40 ℃, respectively. The protease activity was activated by Mn2+. In addition, Bacillus methylotrophicus B-1 and Bacillus subtilis A-12 were used at an inoculum size of 6% on raw soybean meal to study the effect of fermentation on the contents of crude protein and small peptides and hydrolysis degree. The results showed that the content of small peptides and hydrolysis degree of soybean meal fermented by Bacillus methylotrophicus B-1 were 28.37% and 29.55%, which were 9.04% and 16.07% higher than those of that fermented by Bacillus subtilis A-12, and 27.22% and 29.13% higher than those of raw soybean meal, respectively.

protease; facultative anaerobic; Bacillus methylotrophicus; identification; enzymatic properties; fermented soybean meal

TS201.3

A

1002-6630（2014）09-0162-06

10.7506/spkx1002-6630-201409033

2013-06-25

國家高技術研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2011AA100904）；國家重點實驗室目標導向項目（SKLF-ZZA-201303）；江西省教育廳高?？萍悸涞赜媱濏椖浚ㄚM財教[2011]243號）

熊濤（1970—），男，教授，博士，研究方向為益生菌發(fā)酵食品和飼料。E-mail：xiongtao0907@163.com