賀楊揚，曾 偉，王青龍，王大蕓，陳桂光，梁智群

響應(yīng)面法優(yōu)化枯草芽孢桿菌產(chǎn)γ-聚谷氨酸發(fā)酵工藝

賀楊揚，曾 偉，王青龍，王大蕓，陳桂光，梁智群*

（廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西 南寧 530004）

以1株谷氨酸依賴型γ-聚谷氨酸（poly-γ-glutamic acid，γ-PGA）產(chǎn)生菌Bacillus subtilis GXA-28為研究對象，利用響應(yīng)面法系統(tǒng)優(yōu)化其γ-聚谷氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基成分。通過單因素試驗、Plackett-Burman試驗、最陡爬坡試驗以及Box-Behnken試驗構(gòu)建響應(yīng)方程，利用該方程預(yù)測得到最優(yōu)培養(yǎng)基：蔗糖33.65 g/L、酵母膏0.4 g/L、NH4Cl 1.6 g/L、谷氨酸鈉15 g/L、 KH2PO40.4 g/L、K2HPO4·3H2O 1.68 g/L、MgSO4·7 H2O 0.1 g/L、MnSO4·H2O 0.04 g/L。利用優(yōu)化培養(yǎng)基，在40.2℃、160 r/min條件下?lián)u瓶發(fā)酵22 h，γ-PGA產(chǎn)量達到16.63 g/L，底物谷氨酸鈉轉(zhuǎn)化率比優(yōu)化前提高了20%，達到100%。

γ-聚谷氨酸；枯草芽孢桿菌；響應(yīng)面分析；發(fā)酵培養(yǎng)基

γ-聚谷氨酸（poly-γ-glutamic acid，γ-PGA）是自然界中微生物來源的一種強水溶性多聚高分子化合物，它具有良好的生物可降解性、生物相容性、可食用性、低免疫原性、保濕性[1]，對人體和環(huán)境無毒無公害，可廣泛應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域[2]。隨著γ-PGA在很多新領(lǐng)域中的應(yīng)用拓展，其相關(guān)研究越來越受到人們的關(guān)注，尤其是在γ-PGA產(chǎn)生菌選育、發(fā)酵工藝優(yōu)化及生物合成機理方面[1]。目前由于受到發(fā)酵工藝條件、生產(chǎn)成本及菌株生產(chǎn)能力等限制，國內(nèi)尚未見大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的相關(guān)報道。

γ-PGA最早由Ivanovics等于1937年在炭疽芽孢桿菌莢膜中發(fā)現(xiàn)[1]。1942年Bovarnick等[3]首次發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌能夠分泌胞外γ-PGA，隨后發(fā)現(xiàn)短小芽孢桿菌及地衣芽孢桿菌等也能分泌胞外γ-PGA。目前日本等國家已經(jīng)采用發(fā)酵法實現(xiàn)了γ-PGA工業(yè)化生產(chǎn)，產(chǎn)量在25～50 g/L[4]。國內(nèi)相關(guān)課題組報道γ-PGA實驗室發(fā)酵產(chǎn)量約30～40 g/L，底物轉(zhuǎn)化率約70%。發(fā)酵過程中由于發(fā)酵液黏度較高，嚴重影響其溶氧水平，進而影響菌體生長和γ-PGA產(chǎn)量。因此，建立完善的、系統(tǒng)的、大規(guī)模的生產(chǎn)γ-PGA的工藝是今后國內(nèi)亟待解決的課題之一。

本實驗利用1株耐高溫谷氨酸依賴型菌株Bacillus subtilis GXA-28[5]為研究對象，以優(yōu)化其發(fā)酵培養(yǎng)基成分為目標，采用Plackett-Burman（PB）試驗[6]篩選出顯著影響γ-PGA產(chǎn)量的因素，爬坡試驗確定顯著因子中心值，Box-Behnken設(shè)計[7]構(gòu)建響應(yīng)方程，利用該方程預(yù)測得到最優(yōu)培養(yǎng)基。

1 材料與方法

1.1 菌株

本實驗室自主篩選枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）GXA-28，菌株保藏編號CCTCC M2012347。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖10、酵母膏5、谷氨酸鈉5、KH2PO40.5、MgSO4·7 H2O 0.1， pH 6.5。

斜面培養(yǎng)基成分同種子培養(yǎng)基，加瓊脂粉15 g/L，pH 6.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖30、酵母膏2.5、谷氨酸鈉20、KH2PO40.5、MgSO4·7 H2O 0.1，pH 6.5。

1.3 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：取1 環(huán)斜面菌種接于種子培養(yǎng)基中，42 ℃、160 r/min，恒溫振蕩培養(yǎng)16 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：按2%接種量吸取種子液接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，42 ℃、160 r/min，恒溫振蕩培養(yǎng)22 h。

1.4 測定方法

發(fā)酵液中γ-PGA質(zhì)量濃度測定：參照文獻[8]。

pH值測定：采用梅特勒-托利多320酸度計測定。

菌體量測定：發(fā)酵液經(jīng)蒸餾水稀釋10倍，660 nm波長處測定吸光度。

殘?zhí)菧y定：采用二硝基水楊酸法[9]。

1.5 發(fā)酵條件優(yōu)化

1.5.1 單因素試驗

檢測微生物培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分對菌體的生長和產(chǎn)物的積累的影響，主要有碳源、氮源、谷氨酸鈉、金屬離子等。本試驗選用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、乳糖、檸檬酸、木糖、甘油、白砂糖、可溶性淀粉作為碳源，得到最佳碳源后對其進行質(zhì)量濃度優(yōu)化，選取梯度為：10、20、30、40、50、60、70 g/L。選取8 種有機氮源：牛肉膏、蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母膏、胰蛋白胨、干酪素、玉米粉、黃豆粉和8種無機氮源：NaNO3、KNO3、NH4Cl、(NH4)2CO3、NH4NO3、NH4HCO3、(NH4)2SO4、尿素。得到最佳氮源后對其質(zhì)量濃度進行優(yōu)化，選取梯度依次為：2.5、5、7.5、10、20、30、40 g/L。對底物谷氨酸鈉進行優(yōu)化，選取梯度依次為：10、20、30、40、50、60、70 g/L。通過比較MnSO4·H2O、FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4、K2HPO4·3H2O、CaCl2、ZnCl2、FeCl3·6H2O、CoCl2·6H2O、(NH4)6MoO24·H2O對γ-PGA產(chǎn)量的影響，選出影響最顯著的金屬離子。同時發(fā)酵條件，如溫度、轉(zhuǎn)速、裝液量、pH值等對γ-PGA產(chǎn)量也有一定影響。將溫度依次設(shè)為：32、34、36、38、40、42、44、46 ℃。轉(zhuǎn)速依次設(shè)為：120、140、160、180、200、220 r/min。裝液量依次設(shè)為：25、50、75、100 mL（250 mL三角瓶）。pH值梯度為3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5。將各種影響因素在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的條件上逐一改變，確定每個因素的最佳范圍。

1.5.2 PB試驗設(shè)計

通過單因素試驗選出8 個因素：葡萄糖、酵母膏和NH4Cl、谷氨酸鈉、MgSO4·7 H2O、KH2PO4、MnSO4·H2O、K2HPO4·3H2O、溫度，依次設(shè)計為A、B、C、D、E、F、G、H。每個因素2 個水平，高水平（＋）和低水平（－）。

1.5.3 最陡爬坡試驗

根據(jù)PB設(shè)計試驗結(jié)果選出3 個最顯著影響 γ-PGA產(chǎn)量的因素：蔗糖、K2HPO4·3H2O和溫度，根據(jù)其正負效應(yīng)設(shè)定步長及變化方向，快速逼近最佳響應(yīng)面區(qū)域，其他因素均取低水平。

1.5.4 Box-Behnken設(shè)計

運用Box-Behnken中心組合設(shè)計原理，以最陡爬坡試驗得到的中心點對3 個顯著因素進行Box-Behnken設(shè)計，各取3 個水平，高水平（＋）、中間水平（0）和低水平（－）。根據(jù)Design-Expert 8.0軟件設(shè)計三因素三水平共17 組試驗進行響應(yīng)面分析。17 組試驗分為兩類：一類是析因點，共12 個；一類是零點，為區(qū)域的中心點。零點重復(fù)5 次，用于估計實驗誤差。

統(tǒng)計學(xué)分析每個變量之間的作用以及它們的交互作用，采用下列二次方程進行產(chǎn)量預(yù)測。

式中：Y表示響應(yīng)值，即γ-PGA產(chǎn)量；Xi和Xj表示獨立變量；β0為一個固定常數(shù)；βi、βii和βij分別表示線性相關(guān)系數(shù)、平方系數(shù)和交互系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素優(yōu)化

在單因素試驗中，通過比較10 種碳源對γ-PGA產(chǎn)量的影響，選出了最佳碳源為蔗糖，其最適質(zhì)量濃度為30 g/L。選擇8 種有機氮源和8 種無機氮源進行實驗，得到最佳有機氮源為酵母膏，最佳無機氮源為NH4Cl，其最適質(zhì)量濃度均為2.5 g/L。由于有機氮源成本較高，所以將無機氮源NH4Cl替代部分有機氮源，在不影響產(chǎn)量的情況下得到兩者的最佳質(zhì)量配比為1∶4。本實驗所用GXA-28是1 株谷氨酸依賴型菌株，底物質(zhì)量濃度對γ-PGA產(chǎn)量有很 大的影響，經(jīng)過實驗確定最佳底物質(zhì)量濃度為20 g/L。通過比較不同金屬離子對γ-PGA產(chǎn)量的影響，結(jié)果表明MgSO4·7H2O和KH2PO4在GXA-28發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA中是必需的，添加0.1 g/L MnSO4·H2O、0.1 g/L CaCl2和2 g/L K2HPO4·3H2O對其產(chǎn)量有促進，而低質(zhì)量濃度的FeSO4·7H2O、ZnCl2、FeCl3·6H2O、CoCl2·6H2O和(NH4)6MoO24·H2O對γ-PGA產(chǎn)量均有抑制作用。

2.2 PB試驗設(shè)計

由于Ca2+與SO42-容易形成微溶物，所以在PB設(shè)計中將不選用CaCl2。PB試驗結(jié)果和方差分析如表1、2所示。

表1 PB試驗設(shè)計及結(jié)果Table 1 Plackett-Burman experimental design and results

表2 PB試驗設(shè)計的效應(yīng)評價Table 2 Analysis of variance for the experimental results of Plackett-Burman design

“Prob＞F”小于0.05，說明該因素是顯著的，模型 Prob＞F小于0.05，說明實驗?zāi)Ｐ褪秋@著的。A、B、C、E、F和H是正影響，D和G是負影響。本實驗選擇“Prob>F”小于0.05的3個因素A、G、H（即蔗糖、K2HPO4·3H2O、溫度）為顯著因素。

2.3 最陡爬坡試驗

由PB設(shè)計結(jié)果可知，蔗糖和溫度是正影響，K2HPO4·3H2O 是負影響，爬坡方向及步長根據(jù)其正負性確定，如表3所示。結(jié)果表明，γ-PGA最大產(chǎn)量出現(xiàn)在試驗組2。但考慮到Box-Behnken試驗設(shè)計的可操作性，蔗糖和溫度的中心點確定為32.5 g/L和43 ℃，K2HPO4·3H2O的中心點確定為1.5 g/L。

表3 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Steepest ascent experimental design and results

2.4 Box-Behnken試驗設(shè)計

表4 Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 Box-Behnken design and results

對Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果如表4所示，對結(jié)果進行回歸分析，得到如下方程：Y1＝15.31－0.054A＋0.86B－4.27C＋1.99AB－ 0.40AC－0.022BC－2.84A2－2.94B2－3.79 C2。相關(guān)系數(shù)R2＝0.918 4，說明方程的擬合度很好，可以用該方程進行實驗結(jié)果預(yù)測。

根據(jù)表5方差分析數(shù)據(jù)可知，二次項對響應(yīng)值的影響是十分顯著的，交互項的影響不顯著。模型的F值0.004 6遠小于0.05，說明該模型是顯著的。一般認為，相關(guān)系數(shù)R2大于0.9說明預(yù)測值能與實驗值有較高的相關(guān)度。本實驗中R2為0.918 4，說明僅有大概8%的γ-PGA產(chǎn)量不能由該模型預(yù)測。回歸方程表明蔗糖33.64 g/L、K2HPO4·3H2O 1.68 g/L、溫度40.18℃時，γ-PGA產(chǎn)量預(yù)測值可達16.67 g/L。對預(yù)測結(jié)果進行4次重復(fù)實驗，得到γ-PGA產(chǎn)量平均值為16.63 g/L，實驗值與預(yù)測值擬合度高，說明回歸方程能夠比較真實的預(yù)測各因素對γ-PGA產(chǎn)量的影響。

表5 Box-Behnken試驗方差分析Table 5 Analysis of variance for the experimental results of Box-Behnken design

回歸方程作出的響應(yīng)面圖及等高線圖如圖1所示。等高線圖可直觀反映各因素之間的交互作用強弱，橢圓表示兩因素交互作用明顯，圓形則表示交互作用較小或沒有交互作用。

圖1 溫度、蔗糖和K2HPO4·3H2O添加量對γ-PGA產(chǎn)量的影響Fig.1 Effects of sucrose, temperature and K2HPO4·3H2O on the yield of γ-PGA

2.5 B. subtilis GXA-28發(fā)酵過程曲線

圖2 2 B. subtilis GXA-28發(fā)酵過程曲線Fig.2 Fermentation profiles of B. subtilis GXA-28

發(fā)酵過程中，pH值、菌體量、γ-PGA產(chǎn)量及殘?zhí)橇咳鐖D2所示。菌體生長延滯期較短，4 h后即進入對數(shù)生長期；16～28 h處于穩(wěn)定期；30 h后菌體量急速減少，這可能是由于培養(yǎng)基中營養(yǎng)消耗殆盡引起菌體自溶導(dǎo)致的。殘?zhí)橇吭?0 h后處于一個穩(wěn)定的低水平也說明了這一點。γ-PGA合成和菌體生長呈典型偶聯(lián)型，22 h達到最大值；30 h后開始出現(xiàn)降解，這是由于菌體生長后期分泌γ-PGA降解酶引起的。葡萄糖作為速效碳源，在菌體對數(shù)生長期被快速利用，20 h即達到一個較低水平。pH值在整個發(fā)酵過程中變化不大，35 h后略有上升。

3 結(jié) 論

利用PB設(shè)計對蔗糖、酵母膏和NH4Cl、谷氨酸鈉、MgSO4·7H2O、KH2PO4、MnSO4·H2O、K2HPO4·3H2O、溫度8 個因素進行了二水平12 次試驗，從中選出了3 個主要影響因素：蔗糖、K2HPO4·3H2O和溫度。通過最陡爬坡試驗確定了中心點，進一步用Box-Behnken設(shè)計對主要因素進行三因素三水平的17次試驗，確定3 個主要因素的最優(yōu)值，構(gòu)建響應(yīng)方程預(yù)測γ-PGA最高產(chǎn)量為16.67 g/L。將得到的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基進行4 次驗證實驗，γ-PGA平均產(chǎn)量為16.63 g/L，實驗值與預(yù)測值擬合度高，說明響應(yīng)方程能夠比較真實地預(yù)測各因素對γ-PGA產(chǎn)量的影響。

近年來，國內(nèi)外關(guān)于γ-PGA優(yōu)化發(fā)酵工藝優(yōu)化的研究十分活躍。Kubota等[4]利用B. subtilis F-2-01發(fā)酵制備γ-PGA，其產(chǎn)量可達到50 g/L，底物轉(zhuǎn)化率為71.43%，該菌株發(fā)酵工藝被日本明治公司成功用于工業(yè)化生產(chǎn)制備γ-PGA。B. subtilis IFO 3335[10]和B. licheniformis ATCC9945A[11]作為γ-PGA合成代謝途徑以及合成酶相關(guān)基因研究的模式菌株，其γ-PGA產(chǎn)量分別達到20 g/L和23 g/L，底物轉(zhuǎn)化率分別為40%和23%。Bajaj等[12]對B. licheniformis NCIM 2324發(fā)酵工藝進行優(yōu)化后，γ-PGA產(chǎn)量達到26.12 g/L，底物轉(zhuǎn)化率為41.9%。Shi Feng等[13]對B. subtilis ZJU-7進行優(yōu)化后，γ-PGA產(chǎn)量為54 g/L，底物轉(zhuǎn)化率為38.6%。Xu Hong等[14]優(yōu)化B. subtilis NX-2發(fā)酵培養(yǎng)基菌株，得到γ-PGA產(chǎn)量為41 g/L，底物轉(zhuǎn)化率為41%。Wei Xuetuan等[15]對菌株B. licheniformis WX-02進行優(yōu)化，其γ-PGA產(chǎn)量為13 g/L，轉(zhuǎn)化率為35.2%。本實驗所采用的菌株B. subtilis GXA-28，優(yōu)化后γ-PGA產(chǎn)量達到16.63 g/L，高出優(yōu)化前20%，優(yōu)化后底物谷氨酸鈉的轉(zhuǎn)化率達到了100%，高于上述相關(guān)報道γ-PGA底物轉(zhuǎn)化率30%～60%。

相對于傳統(tǒng)的單因素試驗和正交試驗，響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的實驗次數(shù)少、周期短，不僅能夠?qū)τ绊懸蛩刈鞒稣_的評價，還能夠充分體現(xiàn)幾個主要影響因素的交互作用，從而快速有效地得到最佳條件。目前國內(nèi)在利用響應(yīng)面法優(yōu)化生物反應(yīng)過程方面、物質(zhì)提取方面取得良好的結(jié)果[16-20]，由此表明采用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵工藝是提高產(chǎn)量的有效途徑。

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Optimization of Medium Composition and Fermentation Conditions by Response Surface Methodology for the Production of Poly-γ-Glutamic Acid by Bacillus subtilis

HE Yang-yang, ZENG Wei, WANG Qing-long, WANG Da-yun, CHEN Gui-guang, LIANG Zhi-qun*
(State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources, College of Life Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530004, China)

Poly-γ-glutamic acid, as a high molecular polymer produced by microorganism, is widely used in industry, agriculture, food, medicine and cosmetics. This study aimed to use response surface methodology for a systematic optimization of fermentation medium composition for the production of poly-γ-glutamic acid by a glutamic aciddependent strain of Bacillus subtilis GXA-28. A response surface regression equation was established based on the results of one-factor-at-a-time, Plackett-Burman, steepest ascent and Box-Behnken experimental designs. The optimal medium formulation, as predicted from the equation, consisted of 33.65 g/L sucrose, 0.4 g/L yeast extract, 1.6 g/L NH4Cl, 15 g/L monosodium glutamate, 0.4 g/L KH2PO4, 1.68 g/L K2HPO4·3H2O, 0.1 g/L MgSO4·7H2O and 0.04 g/L MnSO4·H2O. The yield of poly-γ-glutamic acid reached 16.63 g/L, which was 20% higher than before the optimization, and the conversion rate of the substrate glutamate reached 100% by using the optimized medium at 40.2 ℃ with shaking at a speed of 160 r/min for 22 h.

poly-γ-glutamic acid; Bacillus subtilis; response surface analysis; fermentation medium

TS201.3

A

1002-6630（2014）09-0147-05

10.7506/spkx1002-6630-201409030

2013-06-23

國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項目（21062001）；廣西研究生教育創(chuàng)新計劃資助項目（YCBZ2012004）

賀楊揚（1989—），女，碩士研究生，研究方向為微生物工程。E-mail：15977108825@163.com

*通信作者：梁智群（1959—），男，教授，博士，研究方向為食品生物化學(xué)。E-mail：zqliang@gxu.edu.cn