陳安徽，陳宏偉，邵 穎，章 娣

女貞內(nèi)生真菌清除自由基活性成分的分離純化

陳安徽，陳宏偉，邵 穎，章 娣

（徐州工程 學(xué)院食品（生物）工程學(xué)院，江蘇 徐州 22 1008）

采用組織塊分離法對女貞的內(nèi)生真菌進(jìn)行分離，對分離到的菌株進(jìn)行清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-（2,4,6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH）自由基活性研究，并對活性較強(qiáng)菌株代謝產(chǎn)物中的清除自由基成分進(jìn)行分離純化。從女貞的葉片、莖、根、枝條等組織共分離出101 株內(nèi)生真菌，研究發(fā)現(xiàn)NZ-18菌株清除自由基活性最強(qiáng)，并采用液相色譜法對NZ-18發(fā)酵液中清除自由基活性成分進(jìn)行制備。分離到一種活性較強(qiáng)的化合物1，經(jīng)高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）法和薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）法純度驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)該化合物為純品化合物經(jīng)活性驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)化合物1在樣品質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時對0.2 mg/mL的DPPH自由基清除率為94.88%。結(jié)果表明，女貞內(nèi)生真菌中存在大量的清除自由基活性菌株。

女貞；內(nèi)生真菌；自由基；成分；分離純化

女貞為木犀科女貞屬常綠喬木，亞熱帶樹種。女貞在中國主要分布在江浙、江西、安徽、山東等地，其成熟的果實(shí)曬干為中藥材女貞子。黃雯等[1]采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）法對女貞子藥材中女貞苷的含量進(jìn)行了分析；侯杰等[2]研究了炮制對女貞子中多糖和5-羥甲基糠醛含量的影響。國內(nèi)外對女貞的相關(guān)研究報道主要集中在女貞子活性成分分析，提取物相關(guān)藥理學(xué)活性研究和其他中藥材配方工藝等方面[3-11]。

近年來，隨著自由基衰老理論的提出以及大量實(shí)驗(yàn)依據(jù)，使得自由基衰老學(xué)說得到了廣大學(xué)者的支持。1984年，Hailliwell首次提出氧化損傷是引起組織損傷的原因，氧化應(yīng)激對組織損傷的惡化有明顯的促進(jìn)作用，很多疾病的主要原因之一是自由基過多[12-17]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，大約有100種疾病與自由基有關(guān)，從人類死亡率最高的心血管疾病到人類最可怕的癌癥，以及近年來對人類造成巨大威脅的艾滋病，無一不和氧自由基有著密切的關(guān)系。從植物內(nèi)生真菌中尋找新型清除自由基活性成分已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。目前關(guān)于內(nèi)生菌的概念范疇還有爭議，在現(xiàn)在的內(nèi)生菌研究中，Bills等[18-20]提出的內(nèi)生菌概念及相關(guān)研究理念被微生物學(xué)者、藥學(xué)工作者廣泛接受。本實(shí)驗(yàn)從女貞中分離內(nèi)生真菌，對分離到的內(nèi)生真菌清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-（2,4,6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH）自由基活性進(jìn)行研究，并對清除DPPH自由基活性較強(qiáng)菌株代謝產(chǎn)物中清除自由基活性成分進(jìn)行分離、純化，以期為天然自由基清除劑的開發(fā)、活性菌株和宿主植物之間的關(guān)系研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

女貞材料采集自徐州市泉山森林公園，由徐州工程學(xué)院邵穎博士鑒定。

DPPH 美國Sigma公司；甲醇 上海一試化學(xué)試劑有限公司；三氯甲烷 徐州市科翔化學(xué)試劑有限責(zé)任公司；乙酸乙酯 天津市福晨化學(xué)試劑廠；石油醚天津市福晨化學(xué)試劑廠；以上皆為分析純。甲醇（色譜純） 美國Tedia公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Spectra Max M2全波長掃描酶標(biāo)儀 美國Molecular device公司；Waters XBridge C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m） 美國Waters公司；SENCO R-502B真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申勝生物技術(shù)有限公司；WFH-203B三用紫外分析儀 上海精科實(shí)業(yè)有限公司；BSZ-100自動收集儀 上海滬西分析儀器廠；HZQ-F 160全溫振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱東聯(lián)電子公司；TL-15高速冷凍離心機(jī) 江蘇圖門離心機(jī)廠；AE200型梅特勒電子天平 上海分析儀器廠；LC3100高效液相色譜儀、P3100D二元高壓梯度恒流泵、V3100紫外-可見光檢測器、AT3100柱溫箱 安徽皖儀科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集

采集不同部位的女貞的根、枝條、果實(shí)和樹皮等組織，拍照、記錄、裝袋低溫保存。

1.3.2 菌株分離

將新鮮的植物樣本用水洗凈，浸泡于75%乙醇3～5 min消毒以去除表面附生的微生物，無菌水沖洗3～5 次，根與莖取韌皮部切成0.5 cm左右的小段（兩端均需有切口），果實(shí)橫截面切段，再轉(zhuǎn)移到加有抗生素的PDA培養(yǎng)基平板中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為22 ℃。待菌落從切口處長出后，進(jìn)一步純化，以供微生物鑒定和菌種的保藏。為驗(yàn)證材料表面消毒的效果，做對照實(shí)驗(yàn)：將上述同樣表面消毒過的部分材料不做剪切，直接置于PDA平板上作對照培養(yǎng)處理，結(jié)果若對照材料周圍均無任何真菌長出，證明表面消毒徹底，從而保證了所分離出的真菌是植物的內(nèi)生真菌而不是空氣中或組織塊表面附生的微生物。

1.3.3 分離培養(yǎng)基及初篩樣品的制備

取馬鈴薯200 g（去皮，切成小塊煮沸20 min，紗布過慮），葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，以蒸餾水定容到1 L。每個500 mL三角瓶裝200 mL培養(yǎng)液。121 ℃高壓滅菌20 min，冷卻后用接入一級斜面種子，放入（22±0.5）℃，轉(zhuǎn)速為120 r/min的全控溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。10 d后將培養(yǎng)好的菌株發(fā)酵醪液在6 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 min，收集上清液，菌絲體丟棄。發(fā)酵液采用低溫真空濃縮處理，濃縮至原體積的1/5后，加入95%乙醇使乙醇終體積分?jǐn)?shù)為65%，置于4 ℃冰箱靜置醇沉12 h，后于6 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心3 min，收集上清液并濃縮至原體積的1/10后，用乙酸乙酯連續(xù)萃取3 次，合并萃取液，濃縮脫除乙酸乙酯溶劑后用甲醇配成10 mg/mL的待測樣品。

1.3.4 DPPH自由基清除率測定[21-22]

加不同質(zhì)量濃度樣品溶液A 100 μL和0.2 mg/mL DPPH試液100 μL于96 孔酶標(biāo)板中，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。樣品加入后振蕩30 s，在37 ℃、517 nm波長處測定其吸光度（Ap）；37 ℃保溫，20 min后再測定一次。測定不加DPPH的樣品空白吸光度（Ac）和加DPPH但不加樣品（以90%甲醇100 μL代替樣品）的吸光度（Amax）。最后按下列公式計(jì)算。

1.3.5 活性指導(dǎo)下的分離

活性提取物的確定：將篩選出的活性菌株發(fā)酵液萃取物，配成0.5 mg/mL的溶液，用1.3.4節(jié)方法進(jìn)行活性測定，活性提取物進(jìn)樣5 ?L，采用高效制備液相色譜法進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化。

洗脫速率：分析時為1 mL/min，制備時為4 mL/min；檢測波長：制備時采用210 nm波長，驗(yàn)證純度時采用210 nm和254 nm兩種波長。

樣品收集及純度鑒定：按峰收集時對無峰的餾分也要收集以免目標(biāo)組分流失。收集到的各個組分用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40～48 ℃減壓濃縮，進(jìn)行活性測定，確定活性物質(zhì)的保留時間，然后用HPLC和薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）方法進(jìn)行純度分析。在HPLC分析中發(fā)現(xiàn)在同一色譜條件下，不同物質(zhì)出峰時間不同，同一物質(zhì)在不同色譜條件條件下產(chǎn)生的色譜峰面積大小、保留時間也不相同，經(jīng)HPLC方法證明是純物質(zhì)必須在兩種以上色譜條件下分析后，當(dāng)均呈現(xiàn)單一吸收峰時，方可認(rèn)為此物質(zhì)為單一物質(zhì)；TLC分析也發(fā)現(xiàn)是純物質(zhì)必須在兩種以上展開劑中展開，且經(jīng)兩種以上顯色劑顯色方法顯色后，當(dāng)均呈現(xiàn)單一斑點(diǎn)時，方可認(rèn)為此物質(zhì)為單一物質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)綜合HPLC和TLC分析方法驗(yàn)證活性物質(zhì)的純度。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌的分離結(jié)果

表1 不同部位內(nèi)生真菌菌株比較Table 1 Comparison of the distribution of endophytic fungi in different different parts of Ligustrum lucidum idum

由表1可知，女貞各部位材料共分離出101 株內(nèi)生真菌，按照分離純化的先后順序分別進(jìn)行標(biāo)記編號（NZ-1、NZ-2、……、NZ-101），其中從果實(shí)中分離出8 株（占分離總數(shù)的7.9%），莖中分離出25 株（占分離總數(shù)的24.8%），根中分離出30 株（占分離總數(shù)的29.7%），葉中分離出38 株（占分離總數(shù)的37.6%）。

女貞內(nèi)生真菌數(shù)量在不同組織部位中差異明顯，可能是由于女貞不同組織部位的微環(huán)境（如水分含量、營養(yǎng)物質(zhì)的質(zhì)量濃度、通氣情況、空氣濕度、酶和化學(xué)成分）不同造成的。

2.2 活性菌株的篩選

將101株供試菌株發(fā)酵液樣品按照1.3.3節(jié)中所述方法處理后，經(jīng)1.3.4節(jié)中所述DPPH自由基清除率測定方法進(jìn)行分析，結(jié)果表明，所有供試菌株代謝產(chǎn)物均具有一定的清除DPPH自由基清除活性，但是不同菌株的活性大小不同，如菌株NZ-18的樣品在質(zhì)量濃度為10 mg/mL時，對0.2 mg/mL的DPPH自由基清除率為58.3%，而NZ-38菌株僅為13.2%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示（僅列出清除率超過40%的菌株）。

表2 不同供試菌株次生代謝產(chǎn)物自由基清除率Table 2 Free radical scavenging rates of secondary metabolites from different endophytic fungal strains

由表2可知，分離的14 株對0.5 mg/mL DPPH自由基清除率超過40%的菌株中，3 株來自根，4 株來自葉片，7 株來自莖部。這可能是由于莖部營養(yǎng)物質(zhì)較為充分并且適合微生物生長，再加上莖部組織暴露于空氣當(dāng)中晝夜溫差較為顯著，導(dǎo)致微生物的次生代謝產(chǎn)物較為豐富。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)NZ-18對自由基的清除率（58.3%），顯著高于其他菌株（P＜0.05），故對該菌株代謝產(chǎn)物中清除DPPH自由基活性成分進(jìn)行分離。

2.3 活性物質(zhì)的分離制備

圖1 NZ-18發(fā)酵液提取物的HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of ethyl acetate extract from fermentation broth of NZ-18

由圖1可知，菌株NZ-18的發(fā)酵液乙酸乙酯提取物中成分較為復(fù)雜，主要洗脫峰有10 個，分別收集各洗脫液，濃縮至原體積的1/20后進(jìn)行活性驗(yàn)證，結(jié)果如表3所示，多個保留時間處的洗脫液有清除DPPH自由基活性，但是僅有保留時間為30.618 min處的洗脫液清除DPPH自由基活性最強(qiáng)，對0.05 mg/mL DPPH自由基清除率達(dá)到83.5%。為保證純度，主要收集保留時間為色譜峰的中段較純部分，峰兩邊單獨(dú)收集備用。連續(xù)進(jìn)樣15 次，收集保留時間為30.618 min處色譜峰中段部分洗脫液，合并后標(biāo)記為化合物1，以便進(jìn)行進(jìn)一步的活性測定和純度鑒定。

表3 不同洗脫組分對DPPH自由基清除率Table 3 DPPH radical scavenging rates of different elution fractions

2.4 制備樣品的純度及活性驗(yàn)證

將高效液相制備色譜制備的化合物1，配制成約0.5 mg/mL的樣品溶液，然后進(jìn)樣5 ?L以按照1.3.5節(jié)所述色譜條件下進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果如圖2所示。

圖2 化合物1在210 nm（A）和254 nm（B）波長處的HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatogram of compound 1

由圖2A、B可知，化合物1在不同色譜條件下，HPLC圖譜上僅一目標(biāo)峰，且除此主峰外，無其他吸收峰出現(xiàn)，由此可知化合物1純度較高。另外，化合物1在圖2A的保留時間為30.881 min，與圖1中發(fā)酵液乙酸乙酯提取物中活性成分的保留時間30.618 min，幾乎完全一致，這說明樣品制備過程中化合物1的性質(zhì)未發(fā)生變化。

圖3 化合物1薄層色譜分析圖譜Fig.3 TLC assay of compound 1

為了進(jìn)一步確定化合物1的純度，進(jìn)行薄層展開，當(dāng)均呈現(xiàn)單一斑點(diǎn)時，方可認(rèn)為化合物1為單一物質(zhì)。圖3A為展開劑V（氯仿）∶V（甲醇）∶V（水）=60∶35∶5條件下的薄層色譜圖，圖3B為展開劑V（氯仿）∶V（乙酸乙酯）∶V（甲醇）=5∶2∶3條件下的薄層色譜圖。

由圖3A、B可知，化合物1在不同展開劑、不同顯色條件下均為單一的斑點(diǎn)，HPLC分析圖譜分析結(jié)果與薄層分析結(jié)果一致，因此說明化合物1為單一純品化合物。化合物1用DPPH顯色后都顯有黃色斑點(diǎn)，因此具有有清除自由基作用。將化合物1配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的樣品，DPPH用甲醇配成質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的試劑，按照1.3.4節(jié)所述方法進(jìn)行清除自由基活性的定量測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)化合物1對自由基的清除率為94.88%。

3 結(jié)論

采用組織塊分離法對女貞的內(nèi)生真菌進(jìn)行分離，并對菌株代謝產(chǎn)物中清除DPPH自由基進(jìn)行活性研究。從女貞的葉片、莖、根、枝條等組織共分離出101 株內(nèi)生真菌。其中從果實(shí)中僅分離出8 株內(nèi)生真菌數(shù)量最少，從葉中分離的內(nèi)生真菌數(shù)量最多為38 株，占總分離總數(shù)的37.6%，導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因可能是由于植物在生長的過程中，不同部位的微環(huán)境不同造成的。對分離到的內(nèi)生真菌進(jìn)行進(jìn)行清除DPPH自由基活性研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多數(shù)微生物具有一定的清除自由基活性，但是僅有一株分離自女貞頸部組織NZ-18菌株清除自由基活性最強(qiáng)。采用液相色譜法對NZ-18發(fā)酵液中清除自由基活性成分進(jìn)行了分離制備，得到一種活性較強(qiáng)的化合物1，經(jīng)HPLC法和TLC法純度驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在HPLC色譜圖中化合物在不同流動相、不同檢測波長條件下，色譜圖中僅出現(xiàn)一主峰；在TLC分析發(fā)現(xiàn)在不同展開劑、不同顯色劑條件下，薄層色譜板上均出現(xiàn)一斑點(diǎn)，綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明化合物1在為純品化合物。經(jīng)活性驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)化合物1在質(zhì)量濃度0.5 mg/mL時，對0.2 mg/mL的DPPH自由基清除率高達(dá)94.88%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明女貞內(nèi)生真菌中存在大量的清除自由基活性菌株，為天然自由基清除劑的開發(fā)提供了新的資源，同時也為進(jìn)一步研究活性菌株和宿主植物之間的關(guān)系提供科學(xué)研究依據(jù)。

[1] 黃雯, 蘇子仁, 畢文川, 等. HPLC法測定女貞子藥材中女貞苷的含量[J]. 藥物分析雜志, 2009, 29(5): 824-826.

[2] 侯杰, 張學(xué)蘭. 炮制對女貞子中多糖和5-羥甲基糠醛含量的影響[J].中成藥, 2009, 31(4): 572-5751.

[3] 蔣葉娟, 姚衛(wèi)峰, 張麗, 等. 女貞子化學(xué)成分的UPLC-ESI-Q-TOFMS分析[J]. 中國中藥雜志, 2012, 37(15): 2304-2308.

[4] 李磷, 邱蓉麗, 程革, 等. 女貞子多糖抗腫瘤作用研究[J]. 中國藥理學(xué)通報, 2008, 24(12): 1619-1622.

[5] 曹蘭秀, 周永學(xué), 頓寶生, 等. 女貞子總黃酮對高脂模型大鼠脂代謝的影響[J]. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報, 2009, 30(20): 2129-2132.

[6] GUO Na, YU Youhua, ABLAJAN K, et al. Seasonal variations in metabolite profiling of the fruits of Ligustrum lucidum Ait[J]. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2011, 25(12): 1701-1714.

[7] CHEN Gang, ZHANG Luyan, WU Xingliang, et al. Determination of mannitoland threesugars in Ligustrum lucidum Ait by capillary electropho-resis with electrochemical detection[J]. Analytica Chimica Acta, 2005, 530 (1): 15-21.

[8] 王俊文, 白瑋緯, 李軍超, 等. 一種測定女貞子中齊墩果酸和熊果酸的新方法[J]. 西北植物學(xué)報, 2011, 31(9): 1894-1899.

[9] LIU Haixing, SHI Yuhua, WANG Dexian, et al. MECC determination of ole-anolic acid and ursolic acid isomers in Ligustrum lucidum Ait[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2003, 32(3): 479-485.

[10] 張廷芳, 段營輝, 屠鳳娟, 等. 女貞子中一個新的裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類成分[J]. 中草藥, 2012, 43(1): 42-44.

[11] 吳地堯, 胡魁偉, 康琛. 女貞子藥材中甘露醇的含量測定[J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2008, 14(7): 8210.

[12] 趙鐸, 王偉. 女貞子對脊髓損傷大鼠HSP70的表達(dá)及自由基的影響[J].新中藥, 2012, 44(10): 125-127.

[13] YURI M. Oxidative stress, radiation-adaptive responses and aging[J]. Journal of Radiation Research, 2004, 45(3): 357-372.

[14] NYSTROM T. The free-radical hypothesis of aging goes prokaryotic[J]. Cellular and Molecular Life Sciences, 2003, 60(7): 1333-1341.

[15] 陳瑾欣, 陳建業(yè). 自由基與衰老關(guān)系的研究進(jìn)展[J]. 川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2004, 19(1): 207-209.

[16] JUNQUEIRA V B, BURROS S B, CHAN S S, et al. Aging and oxidative stress[J]. Molecular Aspects of Medicine, 2004, 25(2): 5-16.

[17] 高良才, 陳婉容. 自由基與衰老[J]. 生物學(xué)教學(xué), 2001, 26(1): 8-10.

[18] BILLS G F, POLISHOOK J D. Recovery of endophytic fungi from Chamaecyparis thyoides[J]. Sydowia, 1992, 44(3): 1-12.

[19] 任安芝, 高玉葆. 植物內(nèi)生真菌: 一類應(yīng)用前景廣闊的資源微生物[J].微生物學(xué)通報, 2001, 28(6): 90-93.

[20] PETRINI O, FISHER P J, PETRINI L E. Fungal endophytes of bracken (Pteridium aquilinum) with some reflections on their use in biological control[J]. Sydowia, 1992, 44: 282-293.

[21] 王劍文, 夏忠豪, 譚仁祥. 內(nèi)生真菌Colletohichum sp.B501的寡糖提取物對黃花蒿發(fā)根中青蒿素生物合成的誘導(dǎo)[J].西北植物學(xué)報, 2002, 44(10): 1233-1238.

[22] KI W L, YOUNG J K. Cocoa has more phenolic phytochemicals and a higher antioxidant capacity than teas and red wine[J]. Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51: 7292-7295.

Separation and Purification of Free Radical Scavenging Bioactive Components from Endophytic Fungi in Ligustrum lucidum

CHEN An-hui, CHEN Hong-wei, SHAO Ying, ZHANG Di
(College of Food (Biology) Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China)

Endophytic fungi were isolated from Ligustrum lucidum by tissue sepa r ation and their 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity was studied. Metabolite components with high DPPH radical scavenging activity were purified. One hundred and one strains of endophytic fungi were isolated from leaves, stems, roots and branches. It was found that NZ-18 strain had the highest DPPH radical scavenging activity and an active component was prepared from its fermentation metabolites by liquid chromatography, which was identified as a pure compound by HPLC and TLC and named as compound 1. The compound I at a concentration of 0.5 mg/mL could scavenge 94.88% of DPPH at 0.2 mg/mL. The present study indicated that there were many endophytic strains from Ligustrum lucidum whose metabolites could scavenge DPPH free radical.

Ligustrum lucidum; endophytic fungi; free radical; component; purification

TS201.3

A

1002-6630（2014）09-0101-05

10.7506/spkx1002-6630-201409021

2013-07-01

江蘇省蘇北科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（BN2011017；BN2011022）

陳安徽（1979—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)閼?yīng)用微生物學(xué)。E-mail：chenah201@163.com