馬華威，楊會(huì)成，付萬冬，廖妙飛，周宇芳，相興偉，陳 孟，鄭 斌,*

鮟鱇魚皮膠原蛋白肽的抗氧化活性

馬華威1，楊會(huì)成2,3，付萬冬2，廖妙飛2，周宇芳2，相興偉2，陳 孟1，鄭 斌2,*

（1.浙江海洋學(xué)院海洋科學(xué)學(xué)院，浙江 舟山 316022；2.浙江省海洋開發(fā)研究院，浙江 舟山 316021；3.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003）

選取鐵離子還原體系和3 種自由基體系為指標(biāo)，研究鮟鱇魚皮膠原蛋白肽體外清除自由基效果和抗氧化作用。采用超濾膜分離鮟鱇魚皮膠原蛋白肽組分，篩選出體外清除·OH活性最好的組分，再建立小鼠衰老模型，將分離得到活性最好的組分采用灌胃法，測(cè)定小鼠皮膚中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）及丙二醛（malondialdehyde，MDA）和羥脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）的含量，研究鮟鱇魚皮膠原蛋白肽體內(nèi)抗氧化和清除自由基作用。結(jié)果表明：鮟鱇魚皮膠原蛋白肽具有較強(qiáng)的還原能力且對(duì)O－2·、DPPH自由基、·OH具有清除效果，質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)對(duì)·OH、DPPH自由基、O－2·的清除率和對(duì)Fe3+的還原能力分別為70.48%、68.78%、42.53%和0.676；分子質(zhì)量小于2 000 D的鮟鱇皮膠原蛋白肽組分對(duì)·OH具有較好的清除效果，IC50為15.7 mg/mL；劑量為100 mg/（kg?d）時(shí)，顯著提高了皮膚中SOD、GSH-Px、CAT的活性，較模型組分別增加20.9%、41.3%和58.1%，且顯著抑制MDA的形成。

鮟鱇魚皮；膠原蛋白肽；抗氧化；丙二醛；羥脯氨酸

在水產(chǎn)品加工過程中，會(huì)產(chǎn)生大量的下腳料（包括魚頭、魚皮、魚鰭、魚尾、魚骨及其殘留魚肉），其質(zhì)量約占原料魚的30%～55%，不同部位膠原蛋白的含量從20%～50%不等[1-3]。鮟鱇魚（Lophius litulon）屬冷溫性底層魚類，常棲伏海底，分布于北太平洋西部，我國產(chǎn)于東海北部、黃海及渤海[4]。近年來我國鮟鱇魚出口需求旺盛，產(chǎn)量和價(jià)格大幅增加，鮟鱇魚出口己成為我國的新興漁業(yè)。然而，在鮟鱇魚的加工中，大量魚皮被作為下腳料而廢棄，這不僅污染了環(huán)境，也造成了資源的浪費(fèi)[5]。目前，為了提高鮟鱇魚皮的經(jīng)濟(jì)附加值，已有學(xué)者開始研究從鮟鱇魚加工副產(chǎn)物中提取硫酸皮膚素、硫酸軟骨素、膠原蛋白等。

以水產(chǎn)膠原蛋白或多肽為基料可開發(fā)成各種保健品、功能食品、添加劑等，但與哺乳動(dòng)物膠原蛋白的應(yīng)用研究相比，水產(chǎn)膠原蛋白的特性及其在醫(yī)學(xué)、美容護(hù)膚、食品、化工及生物材料等方面的應(yīng)用研究相對(duì)較少，限制了其應(yīng)用范圍[6]。初步研究結(jié)果表明，水產(chǎn)膠原蛋白和多肽具有保護(hù)胃黏膜、抗?jié)冏饔谩⒖惯^敏、降血壓、降膽固醇、抗衰老、促進(jìn)傷口愈合、增強(qiáng)骨強(qiáng)度和預(yù)防骨質(zhì)疏松、預(yù)防關(guān)節(jié)炎、促進(jìn)角膜上皮創(chuàng)傷修復(fù)和促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞生長等多種生理活性功能[7-9]。

人體內(nèi)有多種自由基，尤以氧自由基最多[12]。研究證實(shí)人體內(nèi)氧化產(chǎn)生的自由基與人的衰老、癌癥、動(dòng)脈硬化等許多疾病有關(guān)。過多的自由基可損傷機(jī)體內(nèi)生物大分子，影響細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能[10-11]。而在食品等復(fù)雜體系中，大量的自由基也會(huì)嚴(yán)重影響體系的穩(wěn)定性。因此，越來越多的學(xué)者將目光投入到海洋天然抗氧化活性物質(zhì)的研究中，相關(guān)研究報(bào)道較多，結(jié)果也證實(shí)多種水產(chǎn)動(dòng)物中提取的多肽物質(zhì)具有體內(nèi)外抗氧化活性，并顯示了較好應(yīng)用前景[13-21]。但迄今關(guān)于鮟鱇魚皮制備多肽及其抗氧化研究的報(bào)道還較少。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮟鱇魚皮膠原蛋白肽粉末是由本實(shí)驗(yàn)室利用蛋白酶酶解鮟鱇魚皮，再經(jīng)冷凍干燥制得。昆明種小白鼠，體質(zhì)量23～25 g，雌雄各半，浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（（浙））20030001。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）及丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒 南京建成生物工程研究所；其他的試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

80-2B型高速離心機(jī) 湖南星科科學(xué)儀器有限公司；UV-2102 C型紫外分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司；WDD-2型電腦發(fā)光測(cè)試儀 北京瑞利分析儀器公司；SCM-300型杯式超濾器 中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所；AL-104電子分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；手持式快速pH計(jì) 意大利Hanna公司；Micct-Q型超純水器 日本Milli-Por公司；海爾冰箱青島海爾股份有限公司；EYELA冷凍干燥機(jī) 上海愛朗儀器有限公司；SK21-4型數(shù)顯水浴鍋 天津歐諾儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 鮟鱇魚皮膠原蛋白肽抗氧化能力測(cè)定

在本研究中選取VC、茶多酚、叔丁基羥基茴香醚（butylated hydroxyanisol，BHA）為對(duì)照樣品，體外實(shí)驗(yàn)設(shè)置的鮟鱇魚皮膠原蛋白肽質(zhì)量濃度梯度為2、4、6、8、10 mg/mL。

1.3.1.1 還原能力測(cè)定[22]

取一定鮟鱇魚皮膠原蛋白肽質(zhì)量濃度的樣品，加入2.5 mL pH 6.6的磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L）和2.5 mL體積分?jǐn)?shù)1%的鐵氰化鉀溶液，混勻，在50 ℃保溫20 min后加入2.5 mL 10%的三氯乙酸，混合后以3 000 r/min離心10 min。取上清液2.5 mL，加蒸餾水2.5 mL和0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的FeCl3，然后在700 nm波長處比色。

1.3.1.2 清除O－2·的能力測(cè)定

采用鄰苯三酚自氧化法[23]，鄰苯三酚在堿性條件下會(huì)發(fā)生自氧化，生成有色中間產(chǎn)物和超氧陰離子自由基，對(duì)自氧化有催化作用。具體操作：取0.05 mol/L Tris-HCl pH 8.2緩沖液4.5 mL，置于25 ℃水浴預(yù)熱20 min，加0.1 mL不同質(zhì)量濃度的樣品，2.5 mmol/L鄰苯三酚0.4 mL，混勻后在25℃水浴中反應(yīng)4 min，立即用VC溶液終止反應(yīng)，測(cè)A299nm值。以蒸餾水代替樣品做空白組，按式（1）計(jì)算清除率并求得IC50。

式中：A樣品為樣品吸光度；A空白為空白的吸光度。

1.3.1.3 清除DPPH自由基的能力測(cè)定

采用DPPH酶標(biāo)儀法[24]，加不同質(zhì)量濃度的樣品溶液100 μL和1 mmo1/L的DPPH自由基甲醇溶液100 μL于96 孔酶標(biāo)板中，振蕩30 s，37 ℃保溫20 min后在517 nm波長處測(cè)定。每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次，然后按式（2）計(jì)算。

式中：Ap為樣品和1 mmol/mL DPPH自由基反應(yīng)后的吸光度；Ac為不加DPPH自由基時(shí)樣品的吸光度；Amax為加DPPH自由基但不加樣品（以80%甲醇代替樣品）的吸光度。

1.3.1.4 清除·OH的能力測(cè)定[25]

取0.025 mol/L、pH 7.4的磷酸緩沖液1 mL、40 μg/mL番紅花紅1 mL、供試樣品0.5 mL、3%過氧化氫1 mL（新鮮配制）、0.945 mmol/L EDTA-Fe（Ⅱ） 1 mL（新鮮配制），混合后在37℃水浴中反應(yīng)30 min后在520 nm波長處測(cè)定吸光度?？瞻捉M以0.5 mL蒸餾水代替供試樣品，對(duì)照組以1.5 mL蒸餾水代替EDTA-Fe（Ⅱ）和供試樣品，并按式（3）計(jì)算清除率。

式中：A樣品、A空白、A對(duì)照分別為樣品、空白和對(duì)照組的吸光度。

1.3.2 不同分子質(zhì)量的鮟鱇魚皮膠原蛋白肽的制備

稱取一定量的鮟鱇皮膠原蛋白肽粉末，用超純水溶解后，依次用截留值分子質(zhì)量為10 000、5 000、2 000 D的超濾膜進(jìn)行超濾處理，得到分子質(zhì)量（Mr）范圍為：Mr＞10 000 D，5 000 D＜Mr＜10 000 D，2 000 D＜Mr＜5 000 D等不同組分的多肽，分別測(cè)定各組分多肽對(duì)?OH的清除率以及蛋白含量，并計(jì)算各組分的IC50，凍干保存。

1.3.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.3.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處理

昆明種小白鼠40 只，雌雄各一半，按性別、體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組、正常組和實(shí)驗(yàn)組（低劑量組和高劑量組），分組后飼養(yǎng)觀察5 d，以便剔除發(fā)育不良個(gè)體。模型組每天頸背部皮下注射1 000 mg/（kg?d）的D-半乳糖，同時(shí)灌胃2 mL生理鹽水（10 mL/（kg?d））。以超濾膜分離的膠原蛋白肽（Mr＜2 000 D）進(jìn)行給藥灌胃，按體質(zhì)量分別設(shè)為50 mg/（kg?d）（低劑量組）和100 mg/（kg?d）（高劑量組，灌胃量按照0.1 mL/（10g?d），正常組用生理鹽水2.0 mL/d進(jìn)行連續(xù)灌胃30 d，實(shí)驗(yàn)期間，小鼠自由攝食及飲水。

1.3.3.2 實(shí)驗(yàn)樣本采集

小鼠停止灌胃、停食1 d后，取背部皮下組織，剪碎，并加4 ℃預(yù)冷的生理鹽水以固液比1∶9（m/V）混合，用組織勻漿機(jī)充分研磨，于3 200 r/min，離心15 min，取上清液－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.3 指標(biāo)測(cè)定

皮膚中SOD、GSH-Px、CAT活力和MDA含量的測(cè)定分別按照試劑盒說明進(jìn)行。羥脯氨酸含量的測(cè)定利用ISO3496（E）的比色法測(cè)量在130 ℃條件下6 mol/L的HCl水解4 h的待測(cè)樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 鮟鱇魚皮膠原蛋白肽的抗氧化能力

2.1.1 鮟鱇魚皮膠原蛋白肽的還原能力

圖1 鮟鱇魚皮膠原蛋白肽、VC、茶多酚和BHA的還原能力比較Fig.1 Comparison of reducing power of collagen peptide, vitamin C, tea polyphenols and BHA

由圖1可知，鮟鱇魚皮膠原蛋白肽對(duì)Fe3+的還原能力隨質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。與VC、BHA和茶多酚相比，10 mg/mL相同質(zhì)量濃度條件下，鮟鱇魚皮膠原蛋白的還原能力介于VC和BHA之間，以VC的還原能力最高，鮟鱇魚皮膠原蛋白的還原能力0.676。

圖 2鮟鱇魚皮膠原蛋白肽、VC、茶多酚和BHA清除的能力比較Fig.2 Comparison of superoxide anion radical scavenging capacity of collagen peptide, vitamin C, tea polyphenols and BHA

2.1.3 鮟鱇魚皮膠原蛋白肽清除DPPH自由基的能力

DPPH自由基在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，其乙醇紫色溶液在517 nm波長處有強(qiáng)烈的吸收?？寡趸瘎┠苁惯@一吸收現(xiàn)象消失，顏色褪化，因此通過衡量樣品溶液吸光度的變化能夠快速靈敏的評(píng)價(jià)抗氧化劑的抗氧化能力[27-28]。由圖3可知，各受試樣品清除DPPH自由基的能力均隨其質(zhì)量濃度的增加而增大，鮟鱇魚皮膠原蛋白肽質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率可達(dá)68.78%。質(zhì)量濃度相同時(shí)，各抗氧化劑清除DPPH自由基能力大小依次為茶多酚＞VC＞鮟鱇魚皮膠原蛋白肽＞BHA。

圖3 鮟鱇魚皮膠原蛋白肽、VC、茶多酚和BHA清除DPPHDPPH自由基的能力比較Fig.3 Comparison of DPPH radical scavenging capacity of collagen peptide, vitamin C, tea polyphenols and BHA

2.1.4 鮟鱇魚皮膠原蛋白肽清除·OH的能力

圖4 鮟魚皮膠原蛋白肽、VC、茶多酚和BHA清除·OH的能力比較Fig.4 Comparison of hydroxyl radical scavenging capacity of collagen peptide, vitamin C, tea polyphenols and BHA

?OH是需氧生物代謝過程中生成的具有強(qiáng)氧化能力的氧自由基，因此可以用清除?OH能力來反映樣品抗氧化性的強(qiáng)弱[29-30]。由圖4可知，不同抗氧化劑清除?OH的能力均隨質(zhì)量濃度的增加而增大，鮟鱇魚皮膠原蛋白肽質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，對(duì)?OH的清除率達(dá)70.48%，明顯高于VC和BHA。此外，不同抗氧化劑在相同質(zhì)量濃度條件下，清除?OH能力的大小依次為：鮟鱇魚皮膠原蛋白＞茶多酚＞BHA＞VC。由此可知，鮟鱇魚皮膠原蛋白肽具有較強(qiáng)的清除?OH能力。

2.2 不同分子質(zhì)量的鮟鱇魚皮膠原蛋白肽的活性

鮟鱇魚皮酶解液經(jīng)過10 000、5 000、2 000 D超濾膜，對(duì)收集到的各組分按1.3.1.4節(jié)中?OH清除能力測(cè)定，結(jié)果見表1。各受試組分均有清除?OH能力，且活性高低與其分子質(zhì)量大小相關(guān)，隨著分子質(zhì)量減小而增大，2 000 D以下的活性最高，其IC50達(dá)到15.7 mg/mL。因此對(duì)2 000 D以下的酶解液組分進(jìn)行收集并凍干保存，用于抗氧化活性的進(jìn)一步研究。

表1 超濾分離及清除·OH活性測(cè)定結(jié)果Table 1 Hydroxyl radical scavenging activity of ultrafiltration fractions

2.3 鮟鱇皮膠原蛋白肽抗氧化活性動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

以清除?OH活性最強(qiáng)的鮟鱇皮膠原蛋白肽（Mr＜2 000 D）進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，對(duì)小鼠血清及皮膚中各項(xiàng)生化指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表2所示。頸背部皮下注射100 mg/（kg?d）D-半乳糖后的模型組動(dòng)物體內(nèi)的自由基大量增加，此時(shí)，抗氧化酶體系嚴(yán)重破壞，致使SOD、GSH-Px、CAT的活力降低，Hyp水平減少，MDA含量增多，說明致動(dòng)物衰老模型構(gòu)建成功。

MDA的形成常用于表示脂質(zhì)過氧化作用的指數(shù)，Hyp的含量是衡量機(jī)體對(duì)自由基攻擊反應(yīng)的指數(shù)。

表 2 鮟鱇魚皮膠原蛋白肽對(duì)小鼠皮膚的抗氧化指標(biāo)影響（x±s，n=20)Table 2 Effects of collagen peptides in skin antioxidant parameters in mice (x±s，n=20)

由表2可知，模型組小鼠脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增加，皮膚中Hyp含量顯著降低（P＜0.01）。鮟鱇魚皮膠原蛋白肽可以極大提高皮膚中SOD、GSH-Px、CAT活性（P＜0.05，P＜0.01）。鮟鱇魚皮膠原蛋白劑量100 mg/（kg?d）時(shí)，小鼠皮膚中各抗氧化酶的活力最高，較模型組分別增加20.9%、41.3%和58.1%。鮟鱇魚皮膠原蛋白劑量50 mg/（kg?d）時(shí)，皮膚中的MDA含量降低（P＜0.05），并對(duì)皮膚中的GSH水平?jīng)]有影響（P＞0.05）。因此，不同劑量的鮟鱇魚皮膠原蛋白均能顯著增加GSH水平，降低MDA水平，且劑量為100 mg/（kg?d），能顯著抑制MDA的形成，并增加皮膚組織的GSH水平（P＜0.01）。

3 結(jié) 論

3.2 小于2 000 D膠原蛋白肽組分對(duì)·OH具有較好的清除效果，其IC50為15.7 mg/mL。

3.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鮟鱇魚皮膠原蛋白劑量100 mg/（kg?d）時(shí)，皮膚中抗氧化酶的活力最高，較模型組分別增加20.9%、41.3%和58.1%，顯著抑制MDA的形成。

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Antioxidant Activity of Collagen Peptides from Lophius litulon Skin

MA Hua-wei1, YANG Hui-cheng2,3, FU Wan-dong2, LIAO Miao-fei2, ZHOU Yu-fang2, XIANG Xing-wei2, CHEN Meng1, ZHENG Bin2,*
(1. School of Marine Science, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China; 2. Zhejiang Marine Development Research Institute, Zhoushan 316021, China; 3. College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

A ferric ion-reducing system and three free radical systems were used to evaluate the radical-scavenging capacity and antioxidant activity of collagen peptides from Lophius litulon skin in vitro. The peptide components were separated by ultrafiltration and the fraction with the highest hydroxyl radical scavenging activity in vitro was obtained. In addition, aged mouse models were constructed and determined for SOD, CAT, GSH-Px, MDA and Hyp contents in the skin after oral administration of the screened fraction. The results showed that Lophius litulon skin collagen peptides had strong reducing power and superoxide anion, DPPH and hydroxyl radical scavenging capacity in vitro. When the sample concentration was 10 mg/mL, the scavenging rates of hydroxyl, DPPH and superoxide anion radicals and the ferric ion reducing power were 70.48%, 68.78%, 42.53% and 0.676, respectively. The fraction with relative molecular weight less than 2 000 D had stronger hydroxyl radical scavenging activity, and its IC50was 15.7 mg/mL. The activities of SOD, GSH-Px and CAT in skin were increased by respectively 20.9%, 41.3% and 58.1% at the dose of 100 mg/(kg·d) when compared with the model group. Moreover the generation of MDA was significantly inhibited.

Lophius litulon skin; collagen peptide; antioxidant activity; malondialdehyde; hydroxyproline

Q936.16

A

1002-6630（2014）09-0080-05

10.7506/spkx1002-6630-201409017

2013-05-07

浙江省廳市會(huì)商項(xiàng)目（2011C02003）；舟山市海洋類項(xiàng)目（2011C21059）；浙江省公益技術(shù)研究農(nóng)業(yè)項(xiàng)目（2012C22068）；“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD28B05-02）

馬華威（1986—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)楹Ｑ笊镔Y源開發(fā)與利用。E-mail：ma463543285@163.com

*通信作者：鄭斌（1968—），男，研究員，碩士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工及質(zhì)量安全控制。E-mail：6369958@163.com