顧賽麒，李 莉，王錫昌，梁煒瀧

人工養(yǎng)殖大鯢皮膠原蛋白的性質(zhì)研究

顧賽麒，李 莉，王錫昌*，梁煒瀧

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306）

在低溫4 ℃條件下，采用酸法（0.5 mol/L乙酸）和酶法（胃蛋白酶）對人工養(yǎng)殖大鯢皮中的膠原蛋白進(jìn)行了提取，對提取純化后的兩種不同類型的膠原蛋白——酸溶性膠原蛋白（acid-soluble collagen，ASC）和胃蛋白酶酶促溶性膠原蛋白（pepsin-soluble collagen，PSC）其各項理化性質(zhì)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：ASC和PSC均包含2條α鏈及它們的二聚體β鏈，為Ⅰ型膠原蛋白；ASC和PSC中甘氨酸含量最高，其次為谷氨酸和脯氨酸，胱氨酸含量最低；ASC和PSC中亞氨基酸含量分別為144和173（以殘基/1 000殘基計），兩者熱變性溫度分別為23.5 ℃和26.5 ℃，表明PSC的熱穩(wěn)定性較優(yōu)；ASC和PSC的紫外最大吸收峰分別位于233.0 nm和232.0 nm波長處，符合膠原蛋白的特征；ASC和PSC的紅外特征吸收頻率相似，均含有酰胺Ⅱ帶、酰胺Ⅲ帶及在兩酰胺帶間的一系列吸收峰，表明ASC和PSC中膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)較為完整。

大鯢；鯢皮；膠原蛋白；提??；理化性質(zhì)

中國大鯢（Andrias davidianus Blanchard），俗稱娃姓魚，屬兩棲綱、有尾目、隱腮鯢科[1]，是現(xiàn)存兩棲類動物中體形最長、壽命最長的動物，有“活化石”之美譽(yù)[2-4]。據(jù)調(diào)查，野生大鯢在我國分布廣泛，但從1950年起，由于生態(tài)環(huán)境的破壞、人為濫捕濫殺、大鯢遷移范圍有限等原因，其數(shù)量已急劇下降[5]。目前，野生大鯢已被列為國家二級保護(hù)動物并被收錄于《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》附錄Ⅰ中。為了保護(hù)大鯢資源，我國1960年起就開展了大鯢的人工養(yǎng)殖實(shí)驗，現(xiàn)已取得較大進(jìn)展。至2010年，全國大鯢養(yǎng)殖總量達(dá)170多萬尾，大鯢總資源量的快速增長為后續(xù)的開發(fā)以及利用提供了有力保障[6]。

大鯢是一種藥用保健價值極高的動物，其肌肉、骨骼、內(nèi)臟、表皮及其分泌物皆可入藥（目前大鯢體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)50多種天然活性物[7]）。目前國內(nèi)外對人工養(yǎng)殖大鯢的研究主要集中于肌肉和鯢皮兩方面。對于前者，主要評價其營養(yǎng)品質(zhì)[1]，探討大鯢肉在增強(qiáng)免疫力及抗疲勞等方面的保健功效[8]；對于后者，除一般營養(yǎng)成分分析外[9]，也有部分有關(guān)大鯢皮所分泌黏液中活性糖肽抗氧化活性的研究[10]。與肌肉相比，目前對大鯢皮的利用主要以烹飪菜肴為主，缺乏對其進(jìn)行進(jìn)一步精深加工的報道。大鯢皮膠原蛋白含量十分豐富，其膠原蛋白可能具有一些陸生動物膠原蛋白沒有的特殊功能活性，故對大鯢皮中所含膠原蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行研究具有重要意義。本研究通過對人工養(yǎng)殖大鯢皮中的膠原蛋白進(jìn)行提取純化，并對所提取膠原蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)進(jìn)行分析，旨在為人工養(yǎng)殖大鯢資源的后續(xù)開發(fā)利用提供參考借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

6尾人工養(yǎng)殖大鯢采自陜西省漢中市留壩縣養(yǎng)殖場，體長為（80.00±8.66）cm，體質(zhì)量為（3.57±0.09）kg。去除大鯢肌肉和骨骼后，用流水徹底洗凈鯢皮，采集不同部位的鯢皮后，將其切割成0.5 cm×0.5 cm的小片，混勻后放入聚乙烯袋中，于－80 ℃條件下貯藏。

胃蛋白酶（酶活力1 200 IU/g） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；透析袋（截留分子質(zhì)量為25 000 D） 上海源葉生物科技有限公司；蛋白質(zhì)（高）分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Marker（44.3～200 kD）、樣品緩沖液 大連寶生物工程有限公司；十二烷基磺酸鈉（sodium dodecylsulfate，SDS）、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、甘氨酸、Tris、過硫酸銨、四甲基乙二胺 生工生物工程（上海）股份有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

THZ-82（A）氣浴恒溫振蕩器 金壇市科析儀器有限公司；裝配式活動冷庫 上海迪安制冷有限公司；Avanti J-26XP冷凍離心機(jī) 美國Beckman Coulter公司；Mini-PROTEAN垂直電泳槽 美國Bio-Rad公司；PowerLook 2100XL-USB蛋白成像系統(tǒng) 上海世群國際貿(mào)易有限公司；L-8800氨基酸分析儀 日本日立公司；UV-3000 PC型紫外-可見分光光度計 上海美譜達(dá)儀器有限公司；Nicolet 6700傅里葉紅外光譜儀（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR） 美國Thermo Fisher Scientific公司；CH1015超級恒溫槽 上海舜守恒平科學(xué)儀器有限公司；DV-Ⅱ＋可編程控制式黏度計美國Brookfield公司。

1.3 方法

1.3.1 大鯢皮基本成分的測定

水分：參照GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》方法；粗蛋白：參照GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》；粗脂肪：GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測定》和灰分：GB 5009.4—2010《食品中灰分的測定》。

1.3.2 大鯢皮中膠原蛋白的提取

1.3.2.1 原料預(yù)處理

參照文獻(xiàn)[11]，將人工養(yǎng)殖大鯢皮4 ℃冰箱過夜半解凍后，手動去除鯢皮上殘余肌肉，剪成0.5 cm×0.5 cm的小片。在4 ℃條件下，用0.1 mol/L NaOH溶液（液料比30 mL/g）浸泡l d，以除去非膠原蛋白；用去離子水洗滌至中性后，再用10%（V/V）正丁醇溶液（液料比為30 mL/g）浸泡l d，以除去脂肪；最后用去離子水洗滌至中性。

1.3.2.2 酸溶性膠原蛋白的提取

以0.5 mol/L乙酸作為提取溶液，液料比為15 mL/g，于4 ℃冷庫中振蕩提取29 h，粗提液經(jīng)3 層紗布初步分離后，在4 ℃、20 000×g轉(zhuǎn)速離心15 min，取上清液，向其中緩慢加入研磨細(xì)的NaCl粉末使NaCl最終濃度為0.7 mol/L；將此溶液置于4℃條件下鹽析過夜后，進(jìn)行第2 次離心（條件同上）；棄去上清液，將沉淀用0.5 mol/L乙酸溶液溶解后，重復(fù)鹽析、離心、酸溶操作各一次[12]。將酸溶后的膠原蛋白溶液移入透析袋，先用0.1 mol/L乙酸溶液透析1 d，再用去離子水透析2 d，透析時每天更換3 次透析外液，最后對得到的膠原蛋白溶液進(jìn)行真空冷凍干燥。

1.3.2.3 酶促溶性膠原蛋白（pepsin-soluble collagen，PSC）的提取

以胃蛋白酶作為提取用酶，加酶量為198 IU/g，以0.5 mol/L乙酸作為提取溶液，液料比為15 mL/g，于4 ℃冷庫中振蕩酶解29 h，粗提液經(jīng)3 層紗布初步分離后，進(jìn)行冷凍離心，上清液的后續(xù)處理方法同酸溶性膠原蛋白，最后對得到的膠原蛋白溶液進(jìn)行真空冷凍干燥。

1.3.2.4 大鯢皮中膠原蛋白提取率的計算

膠原蛋白的質(zhì)量可由其所含的羥脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）質(zhì)量乘以其換算系數(shù)得到。Hyp是膠原蛋白的特征性氨基酸，不存在于一般蛋白質(zhì)中[13]。參照文獻(xiàn)[14]將Hyp水解；參照國標(biāo)GB/T 9695.23——2008《肉與肉制品羥脯氨酸含量》測定酸解或酶解液中Hyp的質(zhì)量后，將其乘以換算系數(shù)即可得到膠原蛋白的質(zhì)量。

大鯢皮中膠原蛋白的提取率（X，%）按下式計算。

式中：ω為酸解或酶解液中Hyp質(zhì)量/μg；11.1為Hyp換算系數(shù)。

1.3.3 ASC和PSC的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）

分別將ASC、PSC溶解于1 mL 5% SDS溶液中，溶解后的樣品置于85 ℃水浴中保溫1 h使其充分溶解，進(jìn)行離心（4 000×g，5 min）除去不溶性的物質(zhì)。參照Laemmli[15]的方法，電泳分離采用7.5%分離膠和4%濃縮膠體系[16]，電極緩沖液為SDS-Tris-甘氨酸系統(tǒng)，指示劑為溴酚藍(lán)，分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Marker和樣品上樣量分別為5、10 ?L。電泳時采用恒定電流模式，濃縮膠：20 mA、0.5 h，分離膠：40 mA、2.5 h，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑離下沿約1 cm處時停止電泳。首先用去離子水沖洗凝膠3 次，將凝膠倒入固定液（乙酸、甲醇和去離子水之比為1∶5∶4的混合溶液）中浸泡30 min左右；用去離子水沖洗1次，移入盛有染色液（0.25%考馬斯亮藍(lán)R-250溶液）的容器內(nèi)，染色2 h左右后回收染色液，再用去離子水將凝膠漂洗3 次，倒入脫色液（乙酸、甲醇和去離子水之比為1∶3∶6的混合溶液）進(jìn)行脫色過夜；采用PowerLook 2100XL-USB成像系統(tǒng)對凝膠進(jìn)行掃描。

1.3.4 ASC和PSC的氨基酸組成分析

分別精確稱取10 mg左右膠原蛋白樣品至水解管中，依次加入15 mL 6 mol/L的HCl溶液和4 滴新蒸餾的苯酚，真空封管，110 ℃條件下水解22 h，水解液定容至50 mL，取1 mL水解液在50 ℃條件下真空干燥后，用2 mL pH 2.2的檸檬酸鈉緩沖液溶解，經(jīng)0.45 μm水相濾膜過濾后，使用氨基酸自動分析儀進(jìn)行測定，具體參照國標(biāo)：GB/T 5009.124——2003《食品中氨基酸的測定》。

1.3.5 ASC和PSC的紫外掃描

將膠原蛋白樣品溶于0.5 mol/L乙酸溶液中，配成1 mg/mL的膠原蛋白溶液，使用紫外-可見分光光度計對其進(jìn)行掃描（波長范圍為200～400 nm，波長間隔為1 nm），以0.5 mol/L乙酸溶液為空白對照。

1.3.6 ASC和PSC的FT-IR掃描

取2 mg膠原蛋白樣品與KBr混合后置于瑪瑙研缽中，在紅外燈下研磨后手動壓片，使用傅里葉變換紅外掃描儀在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外掃描，分辨率為10 cm-1。

1.3.7 ASC和PSC的熱穩(wěn)定性分析

膠原蛋白的熱變性溫度等同于其增比黏度（ηsp）變化50%時所對應(yīng)的溫度[17]。具體步驟為：將膠原蛋白樣品溶于0.1 mol/L乙酸溶液中，于4 ℃條件下緩慢攪拌2 d，將其配制成0.3 mg/mL的膠原蛋白溶液。采用超級恒溫槽將膠原蛋白溶液從10 ℃加熱到50 ℃（每個溫度間隔為5 ℃，共有8 個溫度點(diǎn)）。在每個溫度點(diǎn)保溫30 min后，使用Brookfield黏度計的超低轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)子（轉(zhuǎn)速為100 r/min）測定膠原蛋白溶液在各溫度點(diǎn)的黏度（η），將η除以對應(yīng)溫度下溶劑的黏度（η0）并減去1后可得膠原蛋白溶液的ηsp。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鯢皮基本成分構(gòu)成

表1 鯢皮的基本成分Table 1 General composition of the skin of Chinese giant salamander

由表1可知，大鯢皮中蛋白質(zhì)含量最高，其次是脂肪和灰分。經(jīng)換算后得知，鯢皮中的粗蛋白含量占鯢皮干質(zhì)量的96.46%。

2.2 大鯢皮中膠原蛋白含量及其提取率

以吸光度為縱坐標(biāo)、L-羥脯氨酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程為：y=0.170 9x－0.002 9，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 7。由線性方程得相應(yīng)吸光值的羥脯氨酸含量，計算大鯢皮中膠原蛋白含量為（19.00±2.66）g/100 g（濕質(zhì)量），換算成干質(zhì)量則膠原蛋白含量高達(dá)60.66%，約占大鯢皮中蛋白質(zhì)總量的62.89%。采用PSC時，當(dāng)加酶量為198 IU/g，液料比為15 mL/g，酶解時間為29 h時，PSC提取率為66.99%；采用0.5 mol/L乙酸對ASC進(jìn)行提取時，ASC提取率為28.88%?？梢姴捎梦傅鞍酌高M(jìn)行酶解之后，膠原蛋白提取率有了顯著提高。

2.3 大鯢皮中膠原蛋白性質(zhì)研究

2.3.1 SDS-PAGE圖譜分析

圖1 鯢皮酸溶性和酶促溶性膠原蛋白的SDS-PAGE電泳圖Fig.1 SDS-PAGE patterns of ASC and PSC from Chinese giant salamander skin

由圖1可知，ASC和PSC都包含了2條α鏈（α1鏈和α2鏈）及它們的二聚體β鏈，其條帶分別在97.2、116.0 kD和200.0 kD附近，其中α2鏈含量約為α1鏈的兩倍，符合典型的Ⅰ型膠原蛋白特征，說明所提取膠原蛋白的構(gòu)型為Ⅰ型。

從電泳圖還可看出，ASC中的β鏈含量明顯高于PSC，這是因為胃蛋白酶酶切掉了膠原蛋白的端肽，使部分β鏈轉(zhuǎn)變成兩條α鏈，導(dǎo)致PSC中β鏈含量降低而α鏈含量升高，且ASC中還含少量的三聚體γ鏈，這與對羅非魚皮[18]、軍曹魚皮[19]、氣球魚皮[20]、大鰭長觸須鯰魚皮[12]的研究結(jié)果相一致。

此外，ASC和PSC的α鏈的電泳遷移率相同，表明胃蛋白酶只作用于膠原蛋白的非螺旋端肽，不會改變其三螺旋結(jié)構(gòu)，通過低溫酶法提取可獲得保持生物活性的、低抗原性膠原，這也與劉磊[21]對海蜇膠原蛋白的研究相符合。

2.3.2 氨基酸組成分析

表2 鯢皮酸溶性和酶促溶性膠原蛋白的氨基酸組成Table 2 Amino acid profiles of ASC and PSC from Chinese giant salamander skin kin

由表2可知，鯢皮ASC和PSC的氨基酸組成相似。膠原蛋白的氨基酸組成有其自身的特點(diǎn)。一般而言，除N端的前14個和C端的前10個氨基酸殘基外，甘氨酸以重復(fù)的氨基酸序列（Gly-X-Y）n存在于膠原蛋白中，因此膠原蛋白中甘氨酸殘基約占氨基酸殘基總數(shù)的三分之一[11]。羥脯氨酸是膠原蛋白的特征性氨基酸，膠原蛋白中脯氨酸和羥脯氨酸是各種蛋白質(zhì)中含量最高的[22]。此外，膠原蛋白中色氨酸缺乏、胱氨酸含量低。

ASC和PSC中甘氨酸含量最高（以殘基/1 000殘基計，下同），達(dá)217和261；谷氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸的含量較高，為85和100、82和99、62和74；組氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸含量較低；胱氨酸的含量最低。以上結(jié)果符合膠原蛋白的氨基酸組成特點(diǎn)。

脯氨酸、羥脯氨酸為亞氨基酸，其含量與物種及其棲息地相關(guān)，尤其與棲息地的環(huán)境溫度相關(guān)[11]。鯢皮ASC中亞氨基酸含量低于PSC，分別為144和173，此結(jié)果與氣球魚皮較為相似（179和174）[20]、低于棕紋紅鯛魚皮（212和221）[11]、褐色帶狀竹鯊魚皮（204和207）[23]以及條紋鯰魚皮（206和217）[24]。脯氨酸和羥脯氨酸都為環(huán)狀氨基酸，這與膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性密切相關(guān)，可賦予膠原蛋白較好的微彈性和較強(qiáng)的拉伸強(qiáng)度[25]。此外，亞氨基酸含量也與膠原蛋白的熱變性溫度有密切聯(lián)系，隨亞氨基酸含量升高，膠原蛋白的熱穩(wěn)定性越好，因此PSC的熱穩(wěn)定性要優(yōu)于ASC。

2.3.3 紫外光譜分析

圖2 鯢皮酸溶性和酶促溶性膠原蛋白的紫外吸收光譜圖Fig.2 Ultraviolet absorption spectra of ASC and PSC from Chinese giant salamander skin

由圖2可知，組成蛋白質(zhì)的各種氨基酸，在可見光區(qū)均沒有光吸收，在遠(yuǎn)紫外區(qū)（10～200 nm）都有光吸收，在近紫外區(qū)（200～400 nm）只有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等芳香族氨基酸有吸收光的能力 （一般最大的光吸收范圍為250～290 nm）[19]。由于膠原蛋白中芳香族氨基酸含量較低，在250～290 nm范圍內(nèi)基本無吸收。但膠原肽鏈中所含C＝O、—COOH、CONH2均為生色基團(tuán)，使得膠原蛋白在200～230 nm附近有較強(qiáng)的光吸收，這也可應(yīng)用于對膠原蛋白進(jìn)行定性[14]。

實(shí)驗結(jié)果表明，ASC和PSC的最大吸收峰分別位于233 nm和232 nm處，與大鰭長須鯰魚皮（ASC、PSC均在233 nm左右）[12]、斑點(diǎn)叉尾鮰皮（PSC在232 nm）[26]、氣球魚皮（ASC和PSC均在210～240 nm附近）[20]和牛蛙皮（PSC在236 nm附近）[27]的研究結(jié)果一致。說明ASC和PSC的紫外吸收符合膠原蛋白的吸收特征，也表明本研究得到的ASC和PSC具有較高的純度。

2.3.4 FT-IR分析

由圖3可知，ASC和PSC的特征吸收頻率相似，但各特征吸收頻率上的吸收強(qiáng)度相差較大。表3展示了鯢皮ASC和PSC的FT-IR譜圖中各特征峰的具體波數(shù)位置及其形成機(jī)理，此結(jié)果與軍曹魚皮[19]、條紋鯰魚[24]等的報道較為相似。

圖3 鯢皮酸溶性和酶促溶性膠原蛋白的FT-IIRR圖Fig.3 Fourier transform infrared spectra of ASC and PSC from Chinese giant salamander skin

表3 鯢皮酸溶性和酶促溶性膠原蛋白的紅外光譜吸收峰位置及其形成機(jī)理Table 3 FT-IR spectral peak locations and their formation mechanism of ASC and PSC from Chinese giant salamander skin

酰胺A主要由N—H的伸縮振動而引起，其吸收峰一般出現(xiàn)在3 400～3 440 cm-1范圍內(nèi)，但當(dāng)其與氫鍵締合后，對應(yīng)的波數(shù)會有所偏移，一般為3 300 cm-1左右[14,28]。FT-IR圖譜表明，ASC和PSC分別位于3 307.70、3 338.37 cm-1處的吸收峰是由酰胺A的N—H伸縮振動與氫鍵的締合體引起的。酰胺B由CH2不對稱伸縮振動而引起，一般出現(xiàn)在2 930 cm-1附近。因此，ASC和PSC分別位于2 958.94、2 939.02 cm-1處的較弱吸收峰是由酰胺B的CH2不對稱伸縮振動引起。

酰胺Ⅰ帶是由C＝O伸縮振動引起，其吸收峰最強(qiáng)，分別位于1 658.91、1 658.73 cm-1處。因其不受肽鏈側(cè)基的影響，只取決于肽鏈的構(gòu)型，故其對膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的變化較為敏感，從而與膠原蛋白的二級結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[17]。ASC和PSC分別位于1 542.15、1 553.28 cm-1是酰胺Ⅱ的特征吸收峰，它是由C—N伸縮振動以及N—H彎曲振動引起[26]。ASC、PSC分別位于1 233.02cm-1、1 239.28 cm-1處的吸收峰由酰胺Ⅲ帶中的N—H變形振動引起。酰胺Ⅲ帶證明膠原蛋白中三螺旋結(jié)構(gòu)的存在[29]。此外，ASC、PSC分別在酰胺Ⅱ帶與酰胺Ⅲ間的一系列吸收峰（ASC：1 454.63～1 233.02 cm-1，PSC：1 453.15～1 239.28 cm-1）也表明了膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的完整性[30]。以上結(jié)果表明，本實(shí)驗中經(jīng)酸法和酶法提取的鯢皮膠原蛋白其三螺旋結(jié)構(gòu)較為完整。

2.3.5 熱穩(wěn)定性分析

膠原蛋白的熱變性溫度可通過測定其溶液ηsp的變化確定。圖4為鯢皮ASC和PSC的熱變性曲線，縱坐標(biāo)為增比黏度，橫坐標(biāo)為溶液溫度，ηsp變化50%時所對應(yīng)的溫度即為熱變性溫度。

圖4 鯢皮酸溶性和酶促溶性膠原蛋白的熱變性曲線Fig.4 Thermal denaturation curves of ASC and PSC from Chinese giant salamander skin

由圖4可知，ASC和PSC的增比黏度隨溫度升高而下降，尤其在20～30 ℃范圍內(nèi)下降幅度較大，這是因為此時膠原蛋白發(fā)生變性，從高度有序的三螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o規(guī)則卷曲[31]。ASC的熱變性溫度低于PSC，兩者的熱變性溫度分別為23.5 ℃和26.5 ℃，這與它們氨基酸組成中的亞氨基酸含量密切相關(guān)。由表2可知，ASC和PSC中亞氨基酸含量分別為144和173（殘基/1 000殘基）。亞氨基酸的吡咯環(huán)對蛋白質(zhì)二級機(jī)構(gòu)起到固定作用，同時羥脯氨酸的羥基形成的氫鍵能穩(wěn)定膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)，因此膠原蛋白的熱穩(wěn)定性與亞氨基酸含量呈正相關(guān)[21]。

3 結(jié) 論

人工養(yǎng)殖大鯢皮中的膠原蛋白占鯢皮干質(zhì)量的60.66%，采用0.5 mol/L乙酸和胃蛋白酶分別對鯢皮中ASC和PSC膠原蛋白進(jìn)行了提取，提取率為28.88%和66.99%。電泳結(jié)果顯示：ASC和PSC均包含2條α鏈及它們的二聚體β鏈，其構(gòu)型為典型的Ⅰ型膠原蛋白。氨基酸組成分析顯示：ASC和PSC中甘氨酸含量最高，其次為谷氨酸和脯氨酸，胱氨酸含量最低；ASC和PSC中亞氨基酸含量分別為144和173（以殘基/1 000殘基計），且由熱變性曲線可知，兩者熱變性溫度分別為23.5 ℃和26.5 ℃，表明PSC的熱穩(wěn)定性優(yōu)于ASC，此結(jié)果也符合大鯢棲息的環(huán)境溫度。ASC和PSC的紫外最大吸收峰分別位于233.0、232.0 nm處，符合膠原蛋白的紫外吸收特征。傅里葉變換紅外掃描光譜圖顯示，ASC和PSC的紅外特征吸收頻率相似，均含有酰胺Ⅱ帶、酰胺Ⅲ帶及在兩酰胺帶間的一系列吸收峰，表明ASC和PSC中膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)較為完整。

[1] 陳德經(jīng). 大鯢黏液、皮膚及肉中氨基酸分析[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(18): 375-376.

[2] 李時珍. 本草綱目[M]. 北京: 中國書店影印出版社, 1988: 106.

[3] 陳云祥. 淺談大鯢的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)[J]. 海洋與漁業(yè), 2006, 7(11): 26-27.

[4] CHEN L J, TAO F Y, LU Q B. Advances in research of Chinese giant salamander[J]. Journal of Shanghai Fisheries University, 2003, 12(1): 110-114.

[5] 章克家, 王小明, 吳巍, 等. 大鯢保護(hù)生物學(xué)及其研究進(jìn)展[J]. 生物多樣性, 2002, 10(3): 291-297.

[6] 羅慶華. 中國大鯢營養(yǎng)成分研究進(jìn)展及食品開發(fā)探討[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(19): 390-393.

[7] 金立成. 娃娃魚的經(jīng)濟(jì)價值市場前景與保護(hù)[J]. 農(nóng)業(yè)科技通訊, 2003, 32(4): 26-27.

[8] 曹潔, 余龍江, 崔永明, 等. 純大鯢粉對小鼠抗疲勞作用及免疫功能的影響[J]. 四川動物, 2008, 27(1): 149-152.

[9] 王立新, 鄭堯, 艾閩, 等. 中國大鯢皮膚營養(yǎng)成分分析[J]. 淡水漁業(yè), 2011, 41(1): 91-95.

[10] 金橋, 魏芳, 佟長青, 等. 大鯢糖肽組分的高效液相色譜分析及其抗氧化活性研究[J]. 北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報, 2011, 26(1): 27-29.

[11] JONGJAREONRAK A, BENJAKUL S, VISESSANGUAN W, et al. Isolation and characterisation of acid and pepsin-solubilised collagens from the skin of Brownstripe red snapper (Lutjanus vitta)[J]. Food Chemistry, 2005, 93(3): 475-484.

[12] ZHANG M, LIU W T, LI G Y. Isolation and characterisation of collagens from the skin of largefin longbarbel catfish (Mystus macropterus)[J]. Food Chemistry, 2009, 115(3): 826-83 1.

[13] 陸劍鋒, 萬全, 殷章敏, 等. 中華鱉裙邊膠原蛋白的提取及其特征[J].水產(chǎn)學(xué)報, 2010, 34(6): 981-988.

[14] 宮子慧, 林琳, 孟昌偉, 等. 乳酸提取鮰魚皮膠原蛋白工藝優(yōu)化[J].肉類研究, 2011, 25(7): 18-23.

[1 5] LAEMMLI U K. Cleavage of structural proteins during assembly of he ad of bacteriophage T4[J]. Nature, 1970, 277: 680-685.

[16] 沃興德. 蛋白質(zhì)電泳與分析[M]. 北京: 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社, 2008: 39-41.

[17] 鴻巢章二, 橋本周久. 水產(chǎn)利用化學(xué)[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 1 994: 269.

[18] 張帥. 羅非魚皮膠原蛋白提取及性質(zhì)研究[D]. 上海: 上海海洋大學(xué), 2010: 35-36.

[19] 楊樹齊. 軍曹魚魚皮膠原蛋白的提取及其功能特性的研究[D]. 廣東: 廣東海洋大學(xué), 2010: 20-31.

[20] HUANG Y R, SHIAU C Y, CHEN H H, et al. Isolation and characterization of acid and pepsin-solubilized collagens from the skin of balloo n fish (Diodon holocanthus)[J]. Food Hydrocolloids, 2011, 25(6): 1507-1513.

[21] 劉磊. 海蜇膠原蛋白的提取、純化及理化性質(zhì)研究[D]. 無錫: 江南大學(xué), 2009: 24-33.

[22] 蔣挺大. 膠原與膠原蛋白[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2006: 2-5.

[23] KITTIPHATTANABAWON P, BENJAKUL S, VISESSANGUAN W, et al. Isolation and characterisation of collagen from the skin of brownbanded bamboo shark (Chiloscyllium punctatum)[J]. Food Chemistry, 2010, 119(4): 1519-1526.

[24] SINGH P, BENJAKUL S, MAQSOOD S, et al. Isolation and characterisation of collagen extracted from the skin of striped catfish (Pangasianodon hypophthalmus)[J]. Food Chemistry, 2011, 124(1): 97-105.

[25] 湯克勇. 膠原物理與化學(xué)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2012: 128-129.

[26] LIU H Y, LI D, GUO S D. Studies on collagen from the skin of channel catfish (Ictalurus punctaus)[J]. Food Chemistry, 2007, 101(2): 621-625.

[27] LI H, LIU B L, GAO L Z, et al. Studies on bullfrog skin collagen[J]. Food Chemistry, 2004, 84(1): 65-69.

[28] YAN M Y, LI B F, ZHAO X, et al. Characterization of acid-soluble collagen from the skin of walleye pollock (Theragra chalcogramma)[J]. Food Chemistry, 2008, 107(4): 1581-1586.

[29] WOO J W, YU S J, CHO S M, et al. Extraction optimization and properties of collagen from yellowfin tuna (Thunnus albacares) dorsal skin[J]. Food Hydrocolloids, 2008, 22(5): 879-887.

[30] 劉蘇銳, 王坤余, 琚海燕. 豬皮Ⅰ型膠原蛋白的提取及其結(jié)構(gòu)表征[J].中國皮革, 2007, 36(7): 43-49.

[31] 鐘朝輝, 李春美, 竇宏亮, 等. 草魚魚鱗酶溶性膠原蛋白黏度特性及變性溫度研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2006, 32(6): 64-68.

Properties of Collagen Extracted from the Skin of Farmed Chinese Giant Salamander (Andrias davidianus Blanchard)

GU Sai-qi, LI Li, WANG Xi-chang*, LIANG Wei-long
(Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing and Preservation, College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

Acid-soluble collagen (ASC) and pepsin-soluble collagen (PSC) from the skin of farmed Chinese giant salamander (Andrias davidianus Blanchard) were extracted with 0.5 mol/L acetic acid solution and pepsin at 4 ℃, respectively, and purified for further property analysis. Results showed that both ASC and PSC contained two α chains and one β chain (dimer of α chains), indicating them both to be typeⅠ collagen. Among all amino acids in ASC and PSC, glycine had the largest amount, followed by glutamic and proline, while cystine was the least abundant. The contents of amino acids in ASC and PSC were 144 and 173 residues/1 000 residues, respectively, and their denaturation temperatures were 23.5 and 26.5 ℃, respectively. These observations manifested that PSC possessed a better thermal stability than ASC. In addition, the largest UV absorption of ASC an d PSC was observed at 233.0 and 232.0 nm, respectively, which agreed with the characteristic UV absorption of collagen. Fourier transform infrared (FT-IR) spectra of ASC and PSC were almost identical. Both collagens had amide Ⅱ and amide Ⅲ, and a series of absorption peaks between them, indicating the existence of integrated triple helix structure in ASC and PSC.

Chinese giant salamander; skin; collagen; extraction; physico-chemical properties

S98

A

1002-6630（2014）09-0074-06

10.7506/spkx1002-6630-201409016

2013-06-29

上海市科委工程中心建設(shè)項目（11DZ2280300）；上海市教委食品質(zhì)量與安全重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項目（J50704）；上海海洋大學(xué)優(yōu)秀研究生論文培育計劃項目（B-9600-10-0003-3）

顧賽麒（1984—），男，博士研究生，研究方向為食品營養(yǎng)與風(fēng)味。E-mail：gusaiqi@126.com

*通信作者：王錫昌（1964—），男，教授，博士，研究方向為食品營養(yǎng)與安全。E-mail：xcwang@shou.edu.cn