程 超，薛 峰，李 偉，汪興平,*

葛仙米藻膽蛋白與色度降解動(dòng)力學(xué)

程 超1,2，薛 峰3，李 偉1，汪興平1,2,*

（1.湖北民族學(xué)院 生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 恩施 445000；2.湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

以葛仙米藻膽蛋白為原料，研究pH值、溫度和光照對其色度和含量的影響，建立葛仙米藻藍(lán)蛋白及其色度的降解動(dòng)力學(xué)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pH 3色素溶液在可見光區(qū)幾乎沒有藻藍(lán)蛋白特征吸收峰，隨pH值增加藻藍(lán)蛋白特征吸收峰值逐漸增強(qiáng)，至pH 6達(dá)最高，之后逐漸下降；pH值增加藻藍(lán)蛋白特征峰有輕微的藍(lán)移效應(yīng)。pH 4色素溶液Hunter-b最小，其藍(lán)色最深，且每種pH值色素溶液的Hunter-b差異極顯著。藻藍(lán)蛋白在50 ℃半衰期分別是60 ℃和70 ℃的8.09 倍和11.05 倍；而色度在50 ℃半衰期分別是60 ℃和70 ℃的29.17 倍和72.74 倍。

葛仙米；藻藍(lán)蛋白；色度；降解動(dòng)力學(xué)

在構(gòu)成藻膽蛋白的蛋白質(zhì)中，由于其所含色基不同產(chǎn)生的顏色也有差異，如藻藍(lán)蛋白主要呈現(xiàn)藍(lán)色，藻紅蛋白主要呈現(xiàn)紫紅色，別藻藍(lán)蛋白顯示的是淺藍(lán)色[1]。近年來人們對藻膽蛋白穩(wěn)定性進(jìn)行了一些研究，如螺旋藻蛋白干粉在暗處和室內(nèi)自然光下較穩(wěn)定，直射光下稍差。螺旋藻蛋白色素在10%乙醇溶液或50%甘油溶液中較穩(wěn)定，Cu2+可破壞其穩(wěn)定性，乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）和檸檬酸可使其穩(wěn)定性增強(qiáng)，山梨酸可保護(hù)溶液色澤[2]。張以芳等[3]發(fā)現(xiàn)藻藍(lán)蛋白在低于40 ℃、pH 4.0～8.5較穩(wěn)定，45 ℃以上有變色現(xiàn)象，熒光性減弱，糖可提高藻藍(lán)蛋白對熱穩(wěn)定性，光照對藻藍(lán)蛋白影響較小。當(dāng)酒精體積分?jǐn)?shù)低于40%，溫度低于30 ℃，pH 4～10鈍頂螺旋藻藻藍(lán)蛋白可保持較好生物結(jié)構(gòu)和活性[4]。陳新美等[5]發(fā)現(xiàn)螺旋藻藻藍(lán)蛋白提取物在pH 4.0～8.5、40 ℃以下和弱光環(huán)境中表現(xiàn)穩(wěn)定。但畢海等[6]發(fā)現(xiàn)紫外輻照抑制了鈍頂螺旋藻中藻藍(lán)蛋白含量和純度，藻藍(lán)素的結(jié)構(gòu)也發(fā)生了明顯改變。螺旋藻藻藍(lán)蛋白在20 ℃和30 ℃時(shí)保持穩(wěn)定，pH值為中性時(shí)藻藍(lán)蛋白穩(wěn)定性良好[7]。范剛等[8]發(fā)現(xiàn)葛仙米藻藍(lán)蛋白在低于30 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)小于10%、pH 6～8條件下比較穩(wěn)定。以上研究主要集中在光照、乙醇、溫度、pH值、添加劑對藻膽蛋白穩(wěn)定性的影響，這些因素對藻膽蛋白的色度影響還是未知，而在紅曲色素和葉綠素等方面已經(jīng)有報(bào)道[9-10]。此外藻膽蛋白具有較強(qiáng)的抗氧化、抗癌和抗炎作用，可以作為熒光探針進(jìn)行醫(yī)療檢測等，但這些作用的發(fā)揮依賴于藻膽蛋白的穩(wěn)定性，因此本實(shí)驗(yàn)以葛仙米藻膽蛋白為原料，研究pH值、溫度和光照對其色度和與之關(guān)聯(lián)的藻藍(lán)蛋白的影響，為探討高效利用葛仙米藻膽蛋白提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葛仙米 湖北省恩施市鶴峰縣。

乙酸、磷酸氫二鉀、乙酸鈉、氫氧化鈉、硫酸銨、山梨酸鉀（分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CR-400色度計(jì) Sensing公司；UV-1700 SPC型紫外-可見分光光度計(jì) 日本Shimadzu公司；高速冷凍離心機(jī)、Ф660pH/Temp/Mv Meter Beckman公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；SH045恒定濕熱試驗(yàn)箱 上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠。

1.3 方法

1.3.1 葛仙米藻膽蛋白制備

稱取脫脂葛仙米粉30 g，復(fù)水后于－20 ℃反復(fù)凍融3 次，后高速勻漿，4 ℃、pH 7.3的50 mmol/L KH2PO4-NaOH緩沖液浸提，10 000 r/min離心15 min，20%飽和硫酸銨去除雜蛋白后上清液接著用60%飽和硫酸銨沉淀，透析過羥基磷灰石柱層析后冷凍干燥得產(chǎn)品[11]。

1.3.2 葛仙米藻藍(lán)蛋白含量測定

參考Román等[12]的方法略微進(jìn)行了修改，由于葛仙米藻膽蛋白中不含別藻藍(lán)蛋白，因此原公式中的別藻藍(lán)蛋白的部分去掉。

式中：A613nm為藻藍(lán)蛋白在613 nm波長處的吸光度。

1.3.3 色度測定

配制5 mg/mL葛仙米藻膽蛋白色素溶液，用色度儀測試樣品的Hunter-L和Hunter-b值。Hunter L表示亮度，Hunter b值在色相環(huán)中表示黃色（－Hunter b值表示藍(lán)色）[13]。

1.3.4 葛仙米藻藍(lán)蛋白在不同光照下的穩(wěn)定性

采用乙酸-乙酸鈉緩沖液配制pH 5.0的5 mg/mL葛仙米藻膽蛋白溶液，在所有處理中加入0.2%山梨酸鉀以防止溶液腐敗。22 ℃于黑暗、日光和藍(lán)光照射3 種條件下，間隔1 d測定Hunter-b值和藻藍(lán)蛋白含量變化。

1.3.5 pH 5的葛仙米藻膽蛋白色素溶液的熱穩(wěn)定性

采用乙酸-乙酸鈉緩沖液配制pH 5的5 mg/mL藻膽蛋白色素溶液，將色素溶液分別在50、60、70 ℃條件下恒溫加熱處理，每隔一定時(shí)間取樣，為保證受熱均勻水浴時(shí)注意不斷搖勻，樣品在熱處理之后用流水迅速冷卻。冷卻后測定溶液的Hunter-b值和藻藍(lán)蛋白含量。

對葛仙米藻膽蛋白不同溫度處理下的含量變化，做動(dòng)力學(xué)分析如下：降解動(dòng)力學(xué)方程的反應(yīng)速率常數(shù)（k）和半衰期（t1/2）可采用下面公式計(jì)算得出[14]。

此公式可以用來表明藻藍(lán)蛋白和色度對溫度依賴性。活化能Ea和頻率常數(shù)K0可以從一級反應(yīng)速率常數(shù)的對數(shù)（lnk）對絕對溫度的倒數(shù)（1/T）的作圖中求出。

式中：ρ0為初始質(zhì)量濃度/（mg/mL）；ρ為在選擇溫度下加熱t(yī)段時(shí)間后的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；k為一級反應(yīng)速率常數(shù)/min-1；K0為頻率常數(shù)/min-1；t為熱處理時(shí)間/h；Ea為活化能/（kJ/mol）；R為氣體常數(shù)，取8.314 J/（mol·K）；T為絕對溫度/K。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每組重復(fù)測定10 次取平均值，采用Origin8.0軟件作圖，SPSS16.0軟件對數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同pH值緩沖液中葛仙米藻藍(lán)蛋白吸收光譜

圖1 不同pH值緩沖液中葛仙米藻藍(lán)蛋白吸收光譜Fig.1 Absorption spectra of phycocyanin from Nostoc sphaeroides Kützing in different pH buffers

分別配制5 mg/mL的不同pH 3～8的葛仙米藻膽蛋白色素溶液，在400～700 nm進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果見圖1。pH 3色素溶液幾乎無色，在可見光區(qū)幾乎沒有藻藍(lán)蛋白特征吸收峰，可能是因?yàn)樵跇O端pH值條件下藻膽蛋白的聚合度發(fā)生改變，影響其光吸收能力，當(dāng)pH值低于4或高于10時(shí)，會(huì)導(dǎo)致別藻藍(lán)蛋白三聚體發(fā)生解聚，二級結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈變化，其光能吸收被破壞[15-16]，本結(jié)果與此對應(yīng)，說明藻藍(lán)蛋白也可能發(fā)生類似的結(jié)構(gòu)變化。此外隨pH值增加，色素溶液特征吸收峰逐漸增強(qiáng)，至pH 6藻藍(lán)蛋白特征吸收（A613nm）達(dá)最高值，之后開始逐漸下降；可能是pH值對藻藍(lán)蛋白中與色基結(jié)合的蛋白構(gòu)象的影響不同，進(jìn)而影響整體發(fā)色。此外pH值會(huì)影響葛仙米藻藍(lán)蛋白特征吸收峰位置，pH值增加藻藍(lán)蛋白特征峰有輕微的藍(lán)移效應(yīng)。

2.2 不同pH值葛仙米藻藍(lán)蛋白溶液的色澤指數(shù)

2.2.1 葛仙米藻藍(lán)蛋白溶液不同pH值下色素亮度指數(shù)和彩度指數(shù)

圖2 葛仙米藻藍(lán)蛋白溶液不同pH值下色素亮度指數(shù)和彩度指數(shù)Fig.2 Hunter-L and Hunter-C values of phycocyanin from Nostoc sphaeroides Kützing at different pH values

由圖2可知，不同pH值的葛仙米藻膽蛋白色素溶液的亮度值Hunter-L隨pH值增加逐漸減弱，即pH 3.0色素溶液亮度最高，說明其中的有色物質(zhì)少，相反隨pH值增加亮度減弱，有色物質(zhì)含量逐漸增加，這與圖1結(jié)果一致。而彩度值Hunter-C在pH 3.0最低，至pH 5.0達(dá)到最高，之后逐漸下降，彩度值Hunter-C其實(shí)是指色素溶液顏色的飽和度，pH 5之后溶液的彩度下降是因?yàn)殡SpH值增加色素溶液中藻紅蛋白所占比例上升（對應(yīng)圖1的紫外掃描圖譜的A565nm的吸收峰），這使得藻藍(lán)蛋白的彩度下降。

2.2.2 葛仙米藻藍(lán)蛋白溶液不同pH值條件下的Hunter-b

表1 不同pH值藻藍(lán)蛋白色素溶液的Hunteerr--b差異性比較Table 1 Comparison of Hunter--b values of phycocyanin from Nostoc sphaeroides Kü tzing at different pH values

由表1的Hunter-b可以看出，隨pH值增加，葛仙米藻膽蛋白色素溶液Hunter-b逐漸增加，但是在pH 4.0陡然下降，而pH 8.0色素溶液的Hunter-b是最低的，Hunter-b負(fù)值越小，說明這種色素溶液的藍(lán)色越深；因此pH4色素溶液藍(lán)色最深，后隨pH值增加藍(lán)色逐漸變淺。通過SPSS16.0軟件分析每種pH值色素溶液的Hunter-b差異極顯著（P＜0.01）。

2.3 光照對葛仙米藻藍(lán)蛋白色素穩(wěn)定性的影響

實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)pH 6.0和pH 7.0緩沖液配制的藻膽蛋白（phycobiliprotein，PBP）溶液，光照2 d后易出現(xiàn)混濁，從而影響吸光度測定，因此本部分實(shí)驗(yàn)只進(jìn)行了pH 5.0緩沖液光照降解實(shí)驗(yàn)，具體結(jié)果見圖3和圖4。

圖3 藻膽蛋白溶液光處理時(shí)的藻藍(lán)蛋白（A）及其色澤的降解（B）Fig.3 Degradation of phycocyanin (A) from Nostoc sphaeroides Kützing and its color (B) under different light conditions

圖4 光處理過程中藻藍(lán)蛋白與色澤降解的關(guān)系圖Fig.4 Linear relationships between the degradation of phycocyanin from Nostoc sphaeroides Kützing and its color under different light conditions

由圖3、4可知，不同光照對pH5.0的葛仙米藻膽蛋白色素溶液的藻藍(lán)蛋白的含量影響不同，日光燈照射最易導(dǎo)致藻藍(lán)蛋白降解，藍(lán)光對其有一定的保護(hù)作用，但相比較黑暗條件而言，仍有部分降解；圖4表明藻藍(lán)蛋白及其色度的光降解符合線性關(guān)系。He等[17]曾報(bào)道在光照條件下藻藍(lán)蛋白具有產(chǎn)生自由基的作用，而暗處具有清除自由基的作用，所以光照導(dǎo)致藻藍(lán)蛋白色度下降可能是產(chǎn)生的自由基的作用。Madhyastha等[18]發(fā)現(xiàn)暴露在藍(lán)光下的C-藻藍(lán)蛋白具有清除能力，所以藍(lán)光對藻藍(lán)蛋白及其色度具有一定的保護(hù)作用。

2.4 溫度對葛仙米藻膽蛋白色素穩(wěn)定性的影響

由圖5、6可知，選擇光照處理組對應(yīng)的pH 5.0緩沖液的進(jìn)行溫度穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葛仙米藻藍(lán)蛋白色素溶液在高溫處理時(shí)會(huì)有明顯的褪色現(xiàn)象，并且溫度越高褪色越明顯，分別測定不同溫度處理下藻藍(lán)蛋白的保留率和Hunter-b值的變化。

圖5 葛仙米藻藍(lán)蛋白在熱處理過程中的降解Fig.5 Degradation of phycocyanin from Nostoc sphaeroides Kützing during thermal treatment

圖6 葛仙米藻膽蛋白色澤在熱處理過程中的降解Fig.6 Color degradation of phycocyanin from Nostoc sphaeroides Kützing during thermal treatment

圖7 熱處理過程中藻藍(lán)蛋白與色澤降解的關(guān)系圖Fig.7 Linear relationships between the degradation of phycocyanin from Nostoc sphaeroides Kützing and its color during thermal treatment

表2 葛仙米藻膽蛋白溶液熱處理過程中藻藍(lán)蛋白和色澤的熱降解參數(shù)Table 2 Thermal degradation parameters of phycocyanin from sphaeroides ides Kützing and its color during thermal treatment

圖5、6表明pH 5.0時(shí)藻藍(lán)蛋白熱降解符合一級反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，且R2均大于0.90。圖7為熱處理過程中藻藍(lán)蛋白的降解與色度降解有線性相關(guān)性。熱處理過程中藻藍(lán)蛋白和色度熱降解參數(shù)如表2所示，在所選擇溫度下，隨溫度升高，體系中藻藍(lán)蛋白和色度降解變快，半衰期變短。藻藍(lán)蛋白在50 ℃半衰期分別是60 ℃和70 ℃的8.09 倍和11.05 倍；而色度在50 ℃半衰期分別是60 ℃和70 ℃的29.17 倍和72.74 倍。

3 討 論

溶液pH值改變會(huì)在很大程度上影響葛仙米藻膽蛋白的色度，夏安東等[19]發(fā)現(xiàn)在低pH值（3.9、4.7和7.0）別藻藍(lán)蛋白聚合度下降，而三聚體狀態(tài)的發(fā)色團(tuán)分子更趨于卷曲和折疊狀態(tài)。同時(shí)蘇海楠[20]發(fā)現(xiàn)藻藍(lán)蛋白在酸性溶液中，藻藍(lán)蛋白高聚態(tài)會(huì)發(fā)生解離，解離程度受溶液pH值及離子強(qiáng)度影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出pH 3的色素溶液在可見光區(qū)幾乎沒有藻藍(lán)蛋白特征吸收峰，隨pH值增加這兩種蛋白的特征吸收峰逐漸增強(qiáng)，至pH 6溶液藻藍(lán)蛋白的特征吸收達(dá)到最高值，之后開始逐漸下降。不同pH值色素溶液的Hunter-b差異極顯著，pH 4.0的色素溶液的藍(lán)色較深，這也說明pH值會(huì)影響到與藻膽蛋白色基結(jié)合的蛋白構(gòu)象，構(gòu)象直接影響藻藍(lán)蛋白對光的吸收[16]，進(jìn)而影響到藻膽蛋白整體發(fā)色。

光照會(huì)導(dǎo)致藻藍(lán)蛋白及其色度的降解，暗處最穩(wěn)定，藍(lán)光對其有一定的保護(hù)作用，日光燈照射最易導(dǎo)致藻藍(lán)蛋白降解。葛仙米藻藍(lán)蛋白色素溶液在高溫處理時(shí)會(huì)有明顯的褪色現(xiàn)象，并且溫度越高褪色越明顯，半衰期越短。因此為了保證充分的發(fā)揮藻藍(lán)蛋白功能，提取和處理藻藍(lán)蛋白時(shí)最好采用黑暗、低于50 ℃的條件。

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Degradation Dynamics of Phycocyanin and Its Chroma from Nostoc sphaeroides Kützing

CHENG Chao1,2, XUE Feng3, LI Wei1, WANG Xing-ping1,2,*
(1. Hubei Key Laboratory of Biological Resource Conservation and Utilization, Hubei University for Nationalities, Enshi 445000, China; 2. School of Biological Science and Technology, Hubei University for Nationalities, Enshi 445000, China; 3. College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

In this article, using phycobiliprotein of Nostoc sphaeroides Küting as raw material, the influence of pH, temperature and light on the chroma and concentration of phycobiliprotien were studied, and established the degradation kinetics of phycocyanin and its chroma of Nostoc sphaeroides Küting. The results showed that aqueous phycocyanin at pH 3 exhibited almost no characteristic absorption peaks in the visible region, and characteristic absorption peaks appeared and the peak values gradually increased along with increasing pH, reaching the maximum at pH 6, followed by a gradual decrease. The characteristic absorption peaks of phycocyanin displayed a slight blue shift at higher pH levels. The Hunter-b value of phycocyanin was the lowest at pH 4, and its darkest color was blue. There was a significant difference in Hunter-b value at all pH levels tested. The half-life of phycocyanin at 50 ℃ was 8.09 and 11.05 times higher than those at 60 ℃ and 70 ℃, respectively and the half-life of chroma at 50 ℃ was 29.17 and 72.74 times higher than those 60 ℃ and 70 ℃ respectively.

Nostoc sphaeroides Kützing; phycocyanin; chroma; degradation dynamics

TS201.2

A

1002-6630（2014）09-0016-04

10.7506/spkx1002-6630-201409004

2014-01-18

國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（31260365）；湖北省教育廳團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目 （T201312）；生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（PKLHB1322）；湖北民族學(xué)院博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目（MY2012B011）

程超（1976—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。E-mail：chengchaolw@126.com

*通信作者：汪興平（1963—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。E-mail：hbmywxp@163.com