陳玉華，母安雄，王曉陽(yáng)

（1.浙江省杭州市畜牧獸醫(yī)局，浙江杭州 310020；2.富陽(yáng)市畜牧獸醫(yī)局，浙江富陽(yáng) 311400）

3種雞免疫抑制性疫病對(duì)禽流感疫苗免疫效果的影響

陳玉華1，母安雄1，王曉陽(yáng)2

（1.浙江省杭州市畜牧獸醫(yī)局，浙江杭州 310020；2.富陽(yáng)市畜牧獸醫(yī)局，浙江富陽(yáng) 311400）

以H5N1亞型高致病性禽流感滅活疫苗，對(duì)16個(gè)規(guī)模肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)、11個(gè)種禽場(chǎng)、6個(gè)放養(yǎng)雞場(chǎng)，按7日齡首免0.3 mL，40日齡二免0.5 mL進(jìn)行注射免疫，同時(shí)開(kāi)展禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒（REV）、白血病病毒（ALV）J亞型和傳染性貧血病毒（CAV）3種免疫抑制病血清學(xué)調(diào)查。結(jié)果發(fā)現(xiàn)肉雞場(chǎng)禽流感平均抗體滴度為5.90 log2，REV、ALV?J、CAV血清學(xué)陽(yáng)性率分別為69.8%，20.1%和83.6%；種禽場(chǎng)禽流感平均抗體滴度為6.05 log2，REV、ALV?J、CAV血清學(xué)陽(yáng)性率分別為54.3%，5.7%和82.8%；放養(yǎng)雞場(chǎng)禽流感平均抗體滴度為6.86 log2，REV、ALV?J、CAV血清學(xué)陽(yáng)性率分別為35.7%，3.6%和83.9%，表明3種免疫抑制病對(duì)禽流感抗體水平有協(xié)同抑制作用。

免疫抑制；血清學(xué)；禽流感；免疫

防控高致病性禽流感的一個(gè)重要環(huán)節(jié)是進(jìn)行疫苗免疫接種，而禽流感疫苗的質(zhì)量、免疫程序、免疫操作、禽群機(jī)體健康狀況等都對(duì)禽流感免疫效果有很大的影響。隨著專業(yè)化、集約化養(yǎng)殖的不斷發(fā)展，禽群中疫病變得越來(lái)越不典型，很多的研究表明［1-2］，禽群中往往因隱性感染或者是非典型性疫病的存在而導(dǎo)致免疫后抗體應(yīng)答低于正常水平，使禽流感免疫接種不能達(dá)到預(yù)期的免疫效果。禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒（REV）、白血病病毒（ALV）和傳染性貧血病毒（CAV）是雞群中3種常見(jiàn)的免疫抑制性病毒，它們除可能造成各自的特殊病變（如腫瘤、貧血）外，常以亞臨床感染的形式存在于雞群，并造成不同程度的免疫抑制［3-4］，導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、繼發(fā)細(xì)菌感染或嚴(yán)重干擾對(duì)雞新城疫、禽流感等疫苗的免疫效果［5-6］，而且REV、ALV和CAV還常常通過(guò)種蛋導(dǎo)致垂直傳播。因此，了解雞群中3種免疫抑制病的血清學(xué)陽(yáng)性率，明確其對(duì)禽流感疫苗免疫效果的影響，具有重要的理論和臨床指導(dǎo)意義。為此，本研究選擇不同類型的養(yǎng)雞場(chǎng)，使用相同的免疫程序、相同的禽流感疫苗對(duì)雞群進(jìn)行禽流感免疫后抗體監(jiān)測(cè)，同時(shí)開(kāi)展3種免疫抑制病的血清學(xué)調(diào)查，擬在摸清3種免疫抑制病在杭州重點(diǎn)養(yǎng)雞地區(qū)的感染狀況（抗體陽(yáng)性率），評(píng)估3種免疫抑制病對(duì)雞群禽流感免疫效果的影響。

1 材料與方法

1.1 疫苗

根據(jù)前期筆者試驗(yàn)結(jié)果，表明雞群使用不同廠家疫苗進(jìn)行禽流感免疫之后，都能快速提高H5抗體水平，且高抗體水平持續(xù)較長(zhǎng)的時(shí)間，組間無(wú)明顯差異。但南京梅里亞動(dòng)物保健有限公司的疫苗產(chǎn)生抗體較快，平均禽流感抗體滴度的離散度較小。因此本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)一使用南京梅里亞動(dòng)物保健有限公司的重組禽流感單價(jià)滅活疫苗（H5N1亞型，Re?1株），批號(hào)為09010986。

1.2 試劑

禽流感病毒H5亞型的標(biāo)準(zhǔn)抗原、陰性和陽(yáng)性血清均購(gòu)自中國(guó)農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所，抗原批號(hào)為200803，血凝（HA）試驗(yàn)效價(jià)為9 log2，0.1 mol·L-1pH值7.2磷酸鹽緩沖溶液（PBS）和1%雞紅細(xì)胞懸液為自制。

雞傳染性貧血、J亞群禽白血病及網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病抗體監(jiān)測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)愛(ài)德士（IDEXX）公司，生產(chǎn)批號(hào)分別為08702?KE137、09268?DE163、09267?KE183，盒內(nèi)包括已包被好抗原的96孔酶聯(lián)反應(yīng)板，標(biāo)準(zhǔn)陰性、陽(yáng)性對(duì)照血清，酶標(biāo)二抗，樣品稀釋液，TMB底物溶液，終止液等。

1.3 試驗(yàn)分組和樣品采集

1.3.1 分組

在杭州市7個(gè)區(qū)、縣（市）選擇16個(gè)規(guī)模肉雞場(chǎng)、11個(gè)種禽場(chǎng)、6個(gè)放養(yǎng)雞場(chǎng)各選一批雞按相同的免疫程序、相同的免疫劑量進(jìn)行禽流感疫苗免疫。即均采用南京梅里亞公司生產(chǎn)的重組禽流感疫苗，在雞群14日齡時(shí)頸部注射0.3 mL進(jìn)行首免，40日齡時(shí)頸部注射0.5 mL進(jìn)行二免。

1.3.2 樣品采集

血清樣品的采集方法及處理。對(duì)上述各試驗(yàn)組雞群二免后35 d，每個(gè)場(chǎng)分別隨機(jī)抽取10～15份血樣，分離血清，編號(hào)，置-20℃冰箱保存，統(tǒng)一進(jìn)行H5亞型禽流感HI抗體和雞傳染性貧血、J亞群禽白血病、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒ELISA抗體檢測(cè)。

1.4 實(shí)驗(yàn)室操作

1.4.1 PBS溶液的配置

稱取0.316 g磷酸二氫鈉、1.096 g磷酸氫二鈉和8.5 g的氯化鈉，加入1 000 mL的純凈水，用氫氧化鈉溶液調(diào)整pH值至7.2，120℃高壓滅菌30 min后，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 雞紅細(xì)胞懸液的配置

翅靜脈采集經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)無(wú)禽流感H5亞型抗體的3只公雞血樣，加入抗凝管中，輕輕搖勻，分別倒入15mL的螺紋管中，加入PBS溶液，2 000 r· min-1離心5 min，棄去上清液，重復(fù)離心洗滌4次，配置成1%的紅細(xì)胞懸液（即1體積紅細(xì)胞加入99體積的PBS溶液），4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 禽流感HI抗體效價(jià)測(cè)定

按照《高致病性禽流感診斷技術(shù)》（GB／T 18936—2003）的血凝抑制試驗(yàn)（HI）檢測(cè)評(píng)定禽只HI抗體水平操作方法進(jìn)行。用96孔微量反應(yīng)板進(jìn)行微量血凝抑制（Hemagglutination Inhibition，HI）試驗(yàn)，試驗(yàn)用抗原為4 HAU稀釋的診斷抗原，以完全抑制4 HAU抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI滴度，并按常規(guī)方法設(shè)置陰性和陽(yáng)性對(duì)照。

1.4.4 檢測(cè)

雞傳染性貧血、J亞群禽白血病及網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病抗體檢測(cè)雞傳染性貧血、J亞群禽白血病及網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病抗體檢測(cè)嚴(yán)格按試劑盒內(nèi)操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 J亞群禽白血病（ALV）檢測(cè)

從表1-4可以看出，在所檢33個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)中有12個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)檢出J亞型白血病抗體陽(yáng)性，且只有2個(gè)場(chǎng)抗體陽(yáng)性率在50%以上。所檢320份血清中，有40份血清學(xué)抗體檢測(cè)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為12.5%，其中規(guī)模肉雞場(chǎng)、種雞場(chǎng)、放養(yǎng)雞場(chǎng)抗體陽(yáng)性率分別為20.1%，5.7%和3.6%。

表1 肉雞場(chǎng)ALV?J、CAV和REV感染狀態(tài)的血清學(xué)調(diào)查及禽流感抗體檢測(cè)結(jié)果

2.2 網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生?。≧EV）檢測(cè)

從表1-4可以看出，在所檢33個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)中僅有3個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)未檢出網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病抗體陽(yáng)性，且有11個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)為100%陽(yáng)性。所檢320份血清中，有188份血清學(xué)抗體檢測(cè)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為58.8%，其中規(guī)模肉雞場(chǎng)、種雞場(chǎng)、放養(yǎng)雞場(chǎng)抗體陽(yáng)性率分別為69.8%，54.3%和35.7%。從圖1可以看出，在不考慮CAV、ALV?J亞型感染的情況下，禽流感抗體水平隨著REV抗體陽(yáng)性率增高而降低。

表2 種禽場(chǎng)ALV?J、CAV和REV感染狀態(tài)的血清學(xué)調(diào)查及禽流感抗體檢測(cè)結(jié)果

表3 放養(yǎng)雞場(chǎng)ALV?J、CAV和REV感染狀態(tài)的血清學(xué)調(diào)查及禽流感抗體檢測(cè)結(jié)果

表4 肉雞場(chǎng)、種雞常、放養(yǎng)雞場(chǎng)ALV?J、CAV和REV感染狀態(tài)的血清學(xué)調(diào)查及禽流感抗體檢測(cè)結(jié)果

圖1 REV抗體陽(yáng)性率與禽流感免疫水平曲線

2.3 雞傳染性貧血（CAV）檢測(cè)

從表1-4可以看出，在所檢33個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)中僅2個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)未檢出雞傳染性貧血陽(yáng)性，且有11個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)為100%陽(yáng)性，其余養(yǎng)殖場(chǎng)抗體陽(yáng)性率基本在60%以上。所檢320份血清中，有267份血清學(xué)抗體檢測(cè)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為83.4%，其中規(guī)模肉雞場(chǎng)、種雞場(chǎng)、放養(yǎng)雞場(chǎng)抗體陽(yáng)性率分別為83.7%，82.9%和83.9%。

2.4 3種免疫抑制病與禽流感免疫抗體水平的相關(guān)性

從表4可以看出，CAV抗體陽(yáng)性率在肉雞場(chǎng)、放養(yǎng)雞場(chǎng)、種雞場(chǎng)的感染率都在80%左右，組間差異不顯著。ALV?J、REV抗體陽(yáng)性率在肉雞場(chǎng)、放養(yǎng)雞場(chǎng)和種雞場(chǎng)差異非常大，暫時(shí)不考慮CAV抗體陽(yáng)性率對(duì)禽流感免疫效果的影響，ALV?J、REV抗體陽(yáng)性率最高的肉雞場(chǎng)禽流感平均免疫抗體滴度最低為5.9 log2，其次為放養(yǎng)雞場(chǎng)6.86 log2和種雞場(chǎng)6.08 log2。

2.5 3種免疫抑制病混合感染率

從表5可以看出，所檢33個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)中有12個(gè)場(chǎng)存在3種免疫抑制病共同感染，3種免疫抑制病的混合感染率為36.4%。其中ALV＋REV和ALV＋CAV 2種抑制病混合感染率相當(dāng)高，分別為12個(gè)場(chǎng)（36.4%）和10個(gè)場(chǎng)（30.3%），33個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)中28個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)存在這2種免疫抑制病的混合感染，混合感染率達(dá)87.9%。

表5 免疫抑制病混合感染情況及禽流感平均抗體滴度

2.6 禽流感抗體檢測(cè)情況

從表1-3可以看出禽流感免疫抗體滴度平均水平分別為肉雞場(chǎng)5.90 log2，放養(yǎng)雞場(chǎng)6.08 log2、種雞場(chǎng)6.86 log2。感染單種免疫抑制病的禽流感抗體水平為9.67 log2和7.87 log2，混合感染二種免疫抑制病的禽流感抗體水平為4.2 log2和5.95 log2，混合3種免疫抑制病的雞場(chǎng)禽流感抗體水平為4.2 log2。從圖2可以看出，肉雞場(chǎng)16其REV、ALV?J、CAV3種免疫抑制病的抗體陽(yáng)性率最高，分別為100%，90%和80%，其禽流感抗體水平是所有場(chǎng)點(diǎn)中最低的，僅為2.1 log2，其他養(yǎng)殖場(chǎng)隨著3種免疫抑制病抗體陽(yáng)性率的降低，禽流感抗體水平略有升高。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了禽流感（HIV）抗體效價(jià)與雞群和ALV、REV、CAV抗體陽(yáng)性率等因素進(jìn)行了相關(guān)分析，結(jié)果表明，HIV與ALV抗體陽(yáng)性率（r＝-0.799，P＜0.01），REV抗體陽(yáng)性率（r＝-0.599，P＜0.01）呈極顯著相關(guān)，而與雞場(chǎng)的種類（P＞0.05）和CAV抗體陽(yáng)性率（P＞0.05）無(wú)顯著相關(guān)。

圖2 ALV?J＋REV＋CAV混合感染情況下禽流感抗體水平

2.7 單獨(dú)感染一種免疫抑制病雞場(chǎng)的禽流感抗體水平

從表6可以看出，只感染REV一種免疫抑制病的2個(gè)場(chǎng)，REV抗體陽(yáng)性率為22.2%時(shí)，禽流感平均抗體滴度為9.4 log2，REV抗體陽(yáng)性率為25.0%室，禽流感平均抗體滴度為9.37 log2。

表6 單獨(dú)感染REV場(chǎng)的禽流感平均抗體滴度

從表7可以看出，只感染CAV 1種免疫抑制病的3個(gè)場(chǎng)，CAV抗體陽(yáng)性率都為100%，禽流感平均抗體滴度分別為8.00 log2、7.70 log2和6.56 log2。

表7 單獨(dú)感染CAV場(chǎng)的禽流感平均抗體滴度

3 分析和討論

雞群中存在多種病毒性免疫抑制性疾病已被大家所公認(rèn)，但是對(duì)這些病毒感染在雞群中的危害性缺乏系統(tǒng)的流行病學(xué)研究，特別是免疫抑制病對(duì)雞群的禽流感、新城疫等疫苗的免疫到底存在怎樣的免疫抑制缺乏相關(guān)文獻(xiàn)資料。本研究旨在用血清學(xué)方法調(diào)查不同雞群中ALV、REV、CAV的感染現(xiàn)狀，并通過(guò)測(cè)定禽流感HI抗體水平來(lái)闡明其不同感染率對(duì)禽流感免疫效果的影響。

本試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果表明，在生產(chǎn)飼養(yǎng)中免疫抑制病在雞群中的感染率非常普遍，3種常見(jiàn)雞免疫抑制病感染率從高到低分別為CAV（84.3%）、REV（58.6%）、ALV（12.5%），且多為雙重或多重感染，3種免疫抑制病的混合感染率達(dá)36.4%。

從檢測(cè)情況看，除CAV在種禽場(chǎng)、放養(yǎng)雞場(chǎng)和肉雞場(chǎng)的感染情況無(wú)明顯差異外，REV和ALV的抗體陽(yáng)性率是肉雞場(chǎng)＞種禽場(chǎng)＞放養(yǎng)雞場(chǎng)，經(jīng)P檢驗(yàn)，P＜0.05相互間差異顯著。這可能與雞群的養(yǎng)殖環(huán)境、放養(yǎng)場(chǎng)飼養(yǎng)密度較低，種禽場(chǎng)飼養(yǎng)條件好于肉雞場(chǎng)，以及種群來(lái)源的差異有關(guān)。同時(shí)不同于其他文獻(xiàn)資料顯示REV感染率在種禽場(chǎng)最高，可能是試驗(yàn)中所采集血樣在不同雞場(chǎng)間日齡相當(dāng)，而REV感染率一般隨著雞群的日齡不斷增加而不斷升高，所以本次調(diào)查種禽場(chǎng)REV感染率低于肉雞場(chǎng)。

從前面檢測(cè)結(jié)果可以看出，禽流感H5HI抗體滴度雖沒(méi)有與REV抗體陽(yáng)性率成完全反比關(guān)系，但禽流感H5HI抗體滴度基本隨著REV抗體陽(yáng)性率的增高而降低，說(shuō)明REV病毒對(duì)禽流感疫苗免疫效果存在明顯的免疫抑制作用，且在感染兩種或兩種以上免疫抑制病情況下，其禽流感免疫抗體水平與免疫抑制病抗體陽(yáng)性率呈反比關(guān)系。通過(guò)對(duì)ALV、REV、CAV抗體陽(yáng)性率等因素進(jìn)行的相關(guān)分析，也充分說(shuō)明HIV與ALV抗體陽(yáng)性率、REV抗體陽(yáng)性率呈極顯著相關(guān)。

雖然在考慮協(xié)同作用時(shí)的方差分析結(jié)果表示，各個(gè)試驗(yàn)因素的協(xié)同作用對(duì)HIV的影響均不顯著（P＞0.05），這可能由于受采樣數(shù)量的影響。但感染ALV?J＋CAV＋REV的雞場(chǎng)其抗體陽(yáng)性率相對(duì)最高的場(chǎng)點(diǎn)，其禽流感抗體水平僅為2.10 log2，表示3種免疫抑制病的抗體陽(yáng)性率越高，其禽流感免疫抗體水平越低，初步表明這3種病毒感染雞時(shí)能夠起協(xié)同作用加重雞體的免疫抑制。李延鵬等［7］通過(guò)CAV與REV共感染SPF雞對(duì)疫苗免疫反應(yīng)的抑制作用試驗(yàn)證實(shí)，CAV單獨(dú)感染的抑制作用沒(méi)有REV顯著，但在共感染的情況下CAV能夠加重REV對(duì)SPF雞的免疫抑制。王建新等［4］也證實(shí)J亞群禽白血病病毒（ALV?J）與REV共感染1日齡肉雞時(shí)能夠加重對(duì)肉雞的免疫抑制?；谀壳癈AV、REV和ALV共同感染的普遍性［8-10］，3種免疫抑制病的共同感染或這3種免疫抑制病與其他病毒的多重感染對(duì)雞疫苗免疫反應(yīng)的影響尤為值得關(guān)注。當(dāng)然因試驗(yàn)過(guò)程中未考慮種群差異、其他免疫性抑制疾病、藥物使用等因素，對(duì)數(shù)據(jù)的積累也有待進(jìn)一步擴(kuò)大，免疫抑制病對(duì)禽流感免疫效果的影響還需深入研究和探討。

免疫抑制病的存在，極大地增加了禽病的發(fā)生率和治療難度，特別是其對(duì)疫苗免疫的抑制作用，給養(yǎng)禽業(yè)的主要疾病如ND、禽流感的免疫效果帶來(lái)了極大影響，給疾病的防治增加了很大困難，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。防治免疫抑制病，提高禽流感綜合免疫效果，還需從科學(xué)免疫、加強(qiáng)綜合管理措施等方面入手。

首先應(yīng)加大對(duì)免疫抑制病的防治工作，對(duì)有疫苗免疫的免疫抑制病盡可能進(jìn)行疫苗免疫，對(duì)尚無(wú)有效疫苗免疫的免疫抑制病，可適當(dāng)給予藥物預(yù)防，同時(shí)養(yǎng)殖場(chǎng)戶要加強(qiáng)其血清檢測(cè)，盡早淘汰陽(yáng)性雞。另外養(yǎng)殖場(chǎng)要從綜合管理入手，做好其他疾病的免疫、日常消毒，減少應(yīng)激，增加雞群營(yíng)養(yǎng)水平，提高雞群的綜合保護(hù)力。

［1］ 李延鵬，崔治中，姜世金，等.CAV與REV共感染SPF雞對(duì)疫苗免疫反應(yīng)的抑制作用中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)［J］，2008，28（11）：1243-1246.

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（責(zé)任編輯：張 存）

S 831 < class="emphasis_bold">文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

A

0528?9017（2014）01?0121?05

文獻(xiàn)著錄格式：陳玉華，母安雄，王曉陽(yáng).3種雞免疫抑制性疫病對(duì)禽流感疫苗免疫效果的影響［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（1）：121-125.

2013?11?12

陳玉華（1979-），女，浙江長(zhǎng)興人，獸醫(yī)師。從事動(dòng)物疫病實(shí)驗(yàn)工作。E?mail：cyhzju＠163.com。