丁春燕，沈 峰，陸 敏，趙 陽，繆青梅

（1.浙江省德清縣食品藥品檢驗所，浙江德清 313200；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學院，浙江杭州 310021）

辣椒內(nèi)標準基因及其在食品檢測中的應(yīng)用

丁春燕1，沈 峰1，陸 敏1，趙 陽1，繆青梅2

（1.浙江省德清縣食品藥品檢驗所，浙江德清 313200；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學院，浙江杭州 310021）

本研究首先通過BLAST搜索，對92個辣椒基因進行比對分析，獲得了5對辣椒內(nèi)標基因候選序列，接著利用PRIMER5.0PCR設(shè)計引物，對候選基因進行種內(nèi)非特異性和種間特異性分析，PEP261（編碼辣椒AT?hook1蛋白）在12個辣椒品種和13個非辣椒品種中表現(xiàn)出典型的種內(nèi)非特異性和種間特異性，已有研究表明，該基因為單拷貝。PCR檢測的靈敏度達到0.1%，穩(wěn)定性良好?？梢詮V泛地應(yīng)用到食品中轉(zhuǎn)基因成分檢測。本文進一步討論了轉(zhuǎn)基因成分檢測中存在的問題、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標識的必要性和目前轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)在檢測中的問題。

辣椒；轉(zhuǎn)基因檢測；內(nèi)標基因；種間特異性

自轉(zhuǎn)基因番茄“FLAVR SAVR”于1994年在美國批準商業(yè)化生產(chǎn)以來，越來越多的轉(zhuǎn)基因作物被批準在不同國家和地區(qū)商業(yè)化生產(chǎn)和種植［1］。2012年全球轉(zhuǎn)基因作物的種植面積約為1.7億hm2，比2011年增長6%，全球15億hm2農(nóng)田中有11%種植了轉(zhuǎn)基因作物。1996-2012年，全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積擴大了100倍，累計超過了15億hm2。在中國目前已有7個轉(zhuǎn)基因品種獲準商業(yè)化，3個轉(zhuǎn)基因品種獲得安全證書，分別是2個轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種，抗病毒青椒、抗病毒番茄、遲熟番茄、矮牽牛、抗環(huán)斑病毒番木瓜各1個，抗蟲水稻2個，植酸酶玉米1個。至2011年，我國批準了30種國外轉(zhuǎn)基因植物的安全生產(chǎn)證書，主要涉及5類轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物，分別是4種大豆，6種棉花，7種油菜，12種玉米，1種甜菜［2］。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)的發(fā)展使轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品已從實驗室走向農(nóng)田，走上餐桌。為了保障消費者的知情權(quán)和消費選擇權(quán)，加強風險管理，各國政府要求對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進行標識。

對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進行標識檢測，PCR是目前最主要和準確的檢測轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的方法，包括定性PCR、復(fù)合PCR及熒光定量PCR方法等［3-6］。要建立轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測方法，必須設(shè)立內(nèi)對照，以確保檢測體系的穩(wěn)定性，同時確定所檢產(chǎn)品的植物源成分，即內(nèi)標準基因。內(nèi)標準基因具有種間特異性、種內(nèi)非特異性和恒定低拷貝數(shù)的特點。種間特異性指該基因在不同的物種間同源性極低，初期可通過NCBI數(shù)據(jù)庫的BLAST分析獲得；種內(nèi)非特異性指該基因在同一物種的不同品種中，包括地方種、野生種、栽培種等中具有很高的同源性和穩(wěn)定性；恒定低拷貝數(shù)指的是在同一物種拷貝數(shù)不變，一般為1～3個拷貝，單拷貝最佳。內(nèi)標準基因?qū)τ诖_保轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測體系的穩(wěn)定性，檢測數(shù)據(jù)的可靠性，定量檢測的準確性起決定性作用［8-10］。

為此，許多研究者致力開發(fā)不同植物的內(nèi)標基因，以便對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進行檢測標識。已報道的內(nèi)標基因有玉米的Zein、Invertase、HMG?A（high?mobile?group protein A）和zSSIIb基因，大豆的Lectin基因，油菜的HMG I／Y（high?mobile?group protein I／Y）、Bnaccg8和Curofin基因，水稻的SPS（Sucrose Phosphate Synthase）基因，番茄LAT52基因，棉花的Sad1基因［4-10］等。自從中國第1個轉(zhuǎn)基因辣椒品種商業(yè)化，各種轉(zhuǎn)基因青椒／辣椒不斷問世，并陸續(xù)申請中間試驗、環(huán)境釋放。但迄今為止，辣椒內(nèi)標基因的研究尚未見報道。因此本項研究重點開發(fā)和鑒定了辣椒內(nèi)標基因。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

轉(zhuǎn)基因辣椒：抗病毒辣椒（Capsicum annuum）（北京大學）。辣椒品種有采風1號、天津線椒、中椒7號、金富早椒、雞爪椒、短牛角椒、26?2、甜椒、小洋角、羊角椒、牛角椒、fuyou（X3R）、ZERAIM GEDERA，由浙江省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所和中國種子總公司提供；其他常見的植物材料有擬南芥、青菜、油菜、水稻、玉米、茄子、番茄、煙草、馬鈴薯、花生、蔥、大豆和棉花等，均由浙江省農(nóng)業(yè)科學院提供。

1.2 方法

1.2.1 候選辣椒內(nèi)標準基因的查找

內(nèi)標準基因需滿足種內(nèi)非特異性、種間特異性和恒定低拷貝3個條件。首先通過查閱文獻和數(shù)據(jù)庫信息檢索分析等，篩選到3個符合條件的辣椒基因，然后將其序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，從而確定一段在辣椒中相對保守而在其他植物基因組中無同源序列的基因作為辣椒的候選內(nèi)標準基因。根據(jù)候選基因序列設(shè)計相應(yīng)的定性PCR引物，再通過試驗驗證其種內(nèi)非特異性和種間特異性，確保候選辣椒內(nèi)標準基因的可靠性和適用性。

1.2.2 定性PCR引物的設(shè)計及反應(yīng)體系

利用軟件Primer 5.0與Oligo 6軟件輔助設(shè)計普通PCR引物；PCR反應(yīng)體系參考《分子克隆》。

1.2.3 辣椒基因組DNA的提取與純化

辣椒DNA的抽提和純化。利用試劑盒Ver. 3.0（寶生物工程（大連）有限公司）提取和純化辣椒基因組DNA，通過1%瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白定量分析儀檢測的對提取DNA質(zhì)量進行評價，以確保所提DNA的濃度和純度適合后續(xù)的PCR擴增。

1.2.4 內(nèi)標準基因的種內(nèi)非特異性分析

提取不同辣椒品種，包括地方種、野生種、普通栽培種、國外品種等的DNA，用對應(yīng)的引物按照反應(yīng)體系和條件進行PCR擴增反應(yīng)，結(jié)束后吸取12μL產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測分析，若所有品種中均能穩(wěn)定擴增出目的片段，則表明該內(nèi)標準基因具有較好的種內(nèi)非特異性。

1.2.5 內(nèi)標準基因的種間特異性分析

提取擬南芥、青菜、油菜、水稻、玉米、茄子、番茄、煙草、馬鈴薯、花生、蔥、大豆、棉花等基因組DNA作為模板，按照表1引物反應(yīng)體系進行定性PCR擴增。若除辣椒外，其他材料中均未擴增出目的片段，則表明該內(nèi)標準基因具有較好的種間特異性。

1.2.6 內(nèi)標準基因定性PCR靈敏度分析

用0.1%的TE將非轉(zhuǎn)基因青椒基因組DNA稀釋到100%，10%，1%，0.5%，0.1%，0.05%，0.01%的質(zhì)量分數(shù)濃度樣品，選用對應(yīng)的引物按反應(yīng)體系和條件進行PCR擴增反應(yīng)，結(jié)束后吸取12 μL產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒候選內(nèi)標準基因查找及網(wǎng)上BLAST結(jié)果

合適的內(nèi)標準基因具備種內(nèi)非特異性、種間特異性和恒定的低拷貝數(shù)3個特點。為了尋找適用于辣椒轉(zhuǎn)基因成分定性PCR檢測的內(nèi)標準基因，搜索Genbank、EMBL和DDBJ等公共數(shù)據(jù)庫，尋找符合條件的辣椒基因，通過比對分析，選擇編碼辣椒AT?hook1蛋白（Capsicum annuum L.Bukang AT?hook?Like gene 1）的CaATL1基因（Genbank No.DQ472735）作為候選內(nèi)標準基因［11］，其部分序列見圖1。CaATL1基因在Genbank上BLAST的結(jié)果顯示，辣椒的CaATL1基因與其他植物基因組序列的同源性很低（圖2）。根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫BLAST結(jié)果，選定了CaATL1基因特異性的序列，并設(shè)計了定性PCR引物（表1）。

圖1 辣椒CaATL1基因部分核苷酸序列

圖2 辣椒CaATL1基因核苷酸序列BLAST結(jié)果

表1 CaATL1基因定性PCR引物

2.2 CaATL1基因種內(nèi)非特異性鑒定

不同品種的辣椒在設(shè)計的特異性S1F／2R引物的PCR擴增反應(yīng)中，PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳顯示，在12個不同品種中都能擴增出大小為261 bp的單一條帶，條帶大小與預(yù)期一致。說明在辣椒的不同品種中都含有候選基因CaATL1特異性序列，辣椒CaATL1基因具有種內(nèi)的非特異性（圖3）。

圖3 CaATL1基因種內(nèi)非特異性定PCR檢測

2.3 CaATL1基因種間特異性鑒定

以擬南芥、煙草、水稻、青菜、花生、蔥、大豆、玉米、油菜、棉花、茄子、番茄和馬鈴薯等一些常見的植物和近緣性的植物基因組DNA為模板，在特異性S1F／S2R引物的PCR擴增反應(yīng)中，PCR產(chǎn)物電泳分析顯示，上述植物中未擴增出特異性的條帶，而辣椒樣品中有大小為261 bp的特異條帶，說明在其他種屬的植物中不含有辣椒的CaATL1基因或與辣椒CaATL1基因同源性較高的基因，從而證明辣椒CaATL1基因具有較強的種間特異性（圖4）。

圖4 CaATL1基因種間特異性定性PCR驗證

2.4 CaATL1基因定性PCR檢測靈敏度分析

以非轉(zhuǎn)基因辣椒為模板DNA，用TE將DNA進行稀釋，以確保PCR反應(yīng)體系中模板DNA質(zhì)量分數(shù)為100%，10%，1%，0.5%，0.1%，0.05%，0.01%。電泳結(jié)果顯示，該定性PCR反應(yīng)系統(tǒng)的檢測靈敏度為0.1%，能滿足辣椒及其制品中轉(zhuǎn)基因成分檢測需要（圖5）。

圖5 CaATL1基因定性PCR檢測靈敏度分析

3 討論

3.1 內(nèi)標基因CaATL1的獲得與鑒定

通過查閱文獻以及網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫信息的分析，搜索已克隆登陸的辣椒基因92個，將選取的基因序列在網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫BLAST比對該基因序列與其他作物基因序列的同源性，篩選到3個在辣椒中相對保守而在其他植物基因組中幾乎沒有同源序列的基因作為辣椒的候選內(nèi)標準基因，根據(jù)這3個基因部分序列設(shè)計了5對定性PCR引物，進行辣椒種間特異性和種內(nèi)非特異性試驗，結(jié)果有2對引物表現(xiàn)出高的種內(nèi)非特異性和種間特異性，其中一對引物擴增條帶稍弱，最后篩選到一個編碼辣椒的AT?hook1蛋白（Capsicum annuum L.Bukang AT?hook?Like gene1）的CaATL1基因。Southern Blot試驗證明，不同辣椒品種中，該基因具有恒定的拷貝數(shù)（1個）［11］；檢測靈敏度試驗表明，其檢測極限可達0.05 ng?？芍狢aATL1基因可用于轉(zhuǎn)基因辣椒檢測的內(nèi)標基因。

3.2 內(nèi)標基因在食品轉(zhuǎn)基因成分檢測中的應(yīng)用

通過檢測內(nèi)標準基因可以確定整個試驗體系的穩(wěn)定性和可靠性，判斷食品中是否含有辣椒成分［3-6］，CaATL1是否適用于轉(zhuǎn)基因辣椒的檢測。本研究選擇轉(zhuǎn)基因抗病毒辣椒作為陽性轉(zhuǎn)基因材料，并配制不同濃度的轉(zhuǎn)基因辣椒樣品，其中抗病毒轉(zhuǎn)基因辣椒DNA含量分別為10%，5%，2%，1%，0.5%和0%，利用該內(nèi)標準基因，0.5%含量以上均能穩(wěn)定檢出轉(zhuǎn)基因成分，表明該基因能夠用于食品中轉(zhuǎn)基因成分檢測。

近年來越來越多的轉(zhuǎn)基因辣椒品種申請環(huán)境釋放，一些國外的轉(zhuǎn)基因辣椒流入中國市場，本研究首次報道開發(fā)了辣椒內(nèi)標準基因，同時建立了轉(zhuǎn)基因辣椒定性檢測體系，這將為轉(zhuǎn)基因辣椒的檢測、消費者的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品消費知情權(quán)、政府部門的轉(zhuǎn)基因安全監(jiān)管提供技術(shù)支持。

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（責任編輯：張瑞麟）

表2 質(zhì)控菌株在2種培養(yǎng)基上的生長指數(shù)

3 小結(jié)與討論

培養(yǎng)基是微生物檢驗中非常重要的一種生物試劑，其質(zhì)量是保證試驗結(jié)果正確的主要因素之一［6］。國內(nèi)外生產(chǎn)的干燥培養(yǎng)基，各企業(yè)的配方有差異，采用的原料的理化性能、純度及對各種微生物生長繁殖代謝產(chǎn)物的穩(wěn)定性亦不相同，致使檢驗結(jié)果也有較大的差異。同樣配置1 L的量，進口培養(yǎng)基只需17.5 g；而國產(chǎn)培養(yǎng)基需要23.5 g，雖最后根據(jù)折算，進口略微偏高，但總體價格相差不大，也反映國產(chǎn)培養(yǎng)基的純化還需要提高。

試驗結(jié)果顯示，在一定培養(yǎng)時間內(nèi)，糕點中菌落總數(shù)在2種培養(yǎng)基上都能清晰地分辨，數(shù)量上無顯著性差異，但在菌株生長指數(shù)值比較上，進口培養(yǎng)基的生長指數(shù)明顯高于國產(chǎn)培養(yǎng)基。

綜上所述，OXOID平板計數(shù)瓊脂效果較好，在實驗室條件經(jīng)濟允許的情況下值得推廣。

參考文獻：

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（責任編輯：張瑞麟）

S 641.3 < class="emphasis_bold">文獻標志碼：B

B

0528?9017（2014）01?0089?04

文獻著錄格式：丁春燕，沈峰，陸敏，等.辣椒內(nèi)標準基因及其在食品檢測中的應(yīng)用［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學，2014（1）：89-92.

2013?08?30

德清縣食品藥品檢驗所創(chuàng)新項目

丁春燕（1987-），女，浙江德清人，本科，主要從事食品藥品檢測與分析工作。E?mail：njjfxu＠gmail.com。