高佳佳，劉書(shū)來(lái)，丁玉庭

（浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，浙江杭州 310014）

紅茶添加對(duì)靈芝菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的影響

高佳佳，劉書(shū)來(lái)，丁玉庭

（浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，浙江杭州 310014）

通過(guò)添加紅茶對(duì)靈芝菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖（EPS）影響的研究表明，培養(yǎng)基中添加紅茶對(duì)靈芝菌液態(tài)發(fā)酵的菌體干重和EPS產(chǎn)量均有顯著影響。當(dāng)紅茶添加量為2.5%時(shí)，對(duì)EPS產(chǎn)量的提高有顯著的促進(jìn)作用，為0.985 g?L-1，比對(duì)照組增加80.2%；而菌體干重為7.818 g?L-1時(shí)，比對(duì)照組下降43.6%。同時(shí)研究了在最適紅茶添加量條件下，靈芝菌發(fā)酵菌體干重和胞外多糖EPS產(chǎn)量的變化過(guò)程，驗(yàn)證了其生物量與產(chǎn)物生成呈部分偶聯(lián)型的代謝規(guī)律。

紅茶添加；靈芝菌；菌體干重；胞外多糖（EPS）

靈芝菌（Ganoderma lucidum）是名貴的藥食兩用真菌，屬真菌門(mén)擔(dān)子菌亞門(mén)層菌綱非褶菌目靈芝菌科靈芝屬［1］，在我國(guó)有2 000多年的食用歷史，是滋補(bǔ)強(qiáng)壯、扶正固本之珍品，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤［2］、清除機(jī)體自由基抗氧化［3］等多種功效。靈芝菌富含多種生理活性成分，主要為靈芝多糖和靈芝三萜等，其中靈芝多糖（EPS）的研究較為深入。由于傳統(tǒng)的靈芝培養(yǎng)方式栽培期長(zhǎng)且效率低下，故而隨著深層液體發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，靈芝菌的開(kāi)發(fā)利用即從固態(tài)的子實(shí)體轉(zhuǎn)向了液體發(fā)酵的菌絲體。

我國(guó)是世界上產(chǎn)茶大國(guó)之一，茶制品的科技含量與附加值卻較低。紅茶在世界茶消費(fèi)中占80%，其生物活性逐漸引起研究者的重視，因其營(yíng)養(yǎng)成分豐富，存在茶多糖、維生素、微量元素等［4］特殊誘導(dǎo)因子，可促進(jìn)靈芝菌EPS的合成，故而考慮利用紅茶與靈芝菌進(jìn)行混合發(fā)酵研究，不僅豐富了茶制品的營(yíng)養(yǎng)與保健因子的種類與數(shù)量，還開(kāi)辟了研發(fā)功能性保健品的新途徑。此外，靈芝菌發(fā)酵過(guò)程中會(huì)代謝產(chǎn)生氨基酸和多酚氧化酶，降解紅茶中的多酚類物質(zhì)，提高氨基酸含量，從而改變紅茶主要呈味物質(zhì)的協(xié)調(diào)關(guān)系，改善其口感及品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試劑

供試材料為普通紅茶，購(gòu)于杭州茶葉市場(chǎng)。供試菌種為鹿角靈芝（Ganoderma lucidum），由浙江工業(yè)大學(xué)食品系保存。試劑包括無(wú)水乙醇、苯酚、濃硫酸，均為分析純。

1.2 培養(yǎng)基

參照文獻(xiàn)［5］開(kāi)展試驗(yàn)。

斜面種子培養(yǎng)基。為PDA瓊脂培養(yǎng)基。

種子液培養(yǎng)基。每升加入葡萄糖20 g，甘油30 g，牛肉膏2.5 g，蛋白胨5.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，維生素B10.05 g，碳酸鈣1.0 g，初始pH值5.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基。每升含葡萄糖30 g，甘油30 g，牛肉膏2.5 g，蛋白胨5.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，維生素B10.05 g，碳酸鈣1.0 g，紅茶6.0 g，初始pH值5.5。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化

斜面保藏菌種室溫下放置5 h后，接入新配制的PDA瓊脂培養(yǎng)基中，30℃活化5 d待用。

1.3.2 種子液培養(yǎng)

將活化后菌種切成5 mm×5 mm大小塊狀，取5塊菌種接入100 m L新配制的種子液培養(yǎng)基（裝于500 mL三角瓶）中，30℃，150 r·min-1條件下培養(yǎng)3 d待用。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)

取6%種子液接入50 m L新配制的發(fā)酵培養(yǎng)基（裝于100 mL三角瓶）中，30℃，150 r·min-1條件下發(fā)酵培養(yǎng)9 d，每2 d取3瓶發(fā)酵液樣品進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

1.3.4 菌體干重測(cè)定

將樣品恒重后用濾紙過(guò)濾，得到菌絲體濾渣，85℃恒重后稱量記錄數(shù)據(jù)。

1.3.5 EPS測(cè)定

苯酚硫酸法［5-6］。

1.3.6 菌體干重增加率與EPS增加率的計(jì)算

菌體干重增加率／%＝（試驗(yàn)組菌體干重-對(duì)照組菌體干重）／對(duì)照組菌體干重×100。

EPS增加率／%＝（試驗(yàn)組EPS產(chǎn)量-對(duì)照組菌體干重）／對(duì)照組菌體干重×100。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和LSD多重比較，判斷紅茶添加對(duì)靈芝菌發(fā)酵菌體干重和EPS產(chǎn)量影響的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅茶添加量對(duì)靈芝菌發(fā)酵菌體干重和EPS產(chǎn)量的影響

考查紅茶添加量分別為0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%和3.0%的條件下，靈芝菌發(fā)酵7 d后，對(duì)菌體干重和EPS產(chǎn)量的影響如圖1和2所示。

圖1 紅茶添加量對(duì)靈芝菌發(fā)酵菌體干重的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，不添加紅茶的對(duì)照組發(fā)酵后最大菌體干重為13.853 g?L-1，而添加紅茶的各試驗(yàn)組其最大菌體干重均明顯低于對(duì)照組，其中紅茶添加量為2.5%和3.0%的試驗(yàn)組菌體干重分別比對(duì)照組下降了43.6%和42.4%，最大菌體干重分別為7.818和7.976 g?L-1，均低于試驗(yàn)組（圖1）。經(jīng)方差分析和LSD多重比較分析可知，不添加紅茶的對(duì)照組與添加紅茶的試驗(yàn)組間菌體干重差異顯著，即紅茶的添加對(duì)靈芝菌發(fā)酵菌體干重的影響顯著。而不同紅茶添加量的試驗(yàn)組間，紅茶添加量為2.5%，3.0%試驗(yàn)組的菌體干重分別與紅茶添加量為0.5%的試驗(yàn)組差異顯著，其他試驗(yàn)組間差異不顯著。

如圖2所示，紅茶添加后試驗(yàn)組的最大EPS產(chǎn)量均有所提高，其中紅茶添加量為2.5%的試驗(yàn)組EPS產(chǎn)量相較于各試驗(yàn)組最高，達(dá)到了0.985 g?L-1，比對(duì)照組增加了80.2%。由此可知，紅茶添加量為2.5%時(shí)，最有利于EPS產(chǎn)量的提高。經(jīng)方差分析和LSD多重比較可知，不添加紅茶的對(duì)照組與添加紅茶的試驗(yàn)組間EPS產(chǎn)量差異顯著，即紅茶的添加對(duì)靈芝發(fā)酵EPS產(chǎn)量影響顯著。而不同紅茶添加量的試驗(yàn)組間差異顯著性，紅茶添加量為2.5%的試驗(yàn)組EPS產(chǎn)量與其他添加量的試驗(yàn)組之間差異顯著，紅茶添加量為0.5%的試驗(yàn)組與添加量分別為2.0%，2.5%，3.0%的試驗(yàn)組差異顯著，添加量為1.0%的試驗(yàn)組與2.0%，2.5%，3.0%的試驗(yàn)組差異顯著，添加量為2.0%的試驗(yàn)組與0.5%，1.0%，2.5%的試驗(yàn)組差異顯著，添加量為3.0%的試驗(yàn)組與0.5%，1.0%，2.5%的試驗(yàn)組差異顯著。

圖2 紅茶添加量對(duì)靈芝菌發(fā)酵EPS產(chǎn)量的影響

結(jié)合圖1和2及數(shù)據(jù)分析可知，紅茶添加量為2.5%對(duì)靈芝菌發(fā)酵菌體干重和EPS產(chǎn)量影響最為顯著，故選擇2.5%作為最適紅茶添加濃度。根據(jù)菌體生情況，推斷出紅茶中含有抑菌物質(zhì)，在靈芝菌發(fā)酵過(guò)程中，抑制了菌體干重的增長(zhǎng)，同時(shí)卻促進(jìn)了EPS產(chǎn)量的提高。而從EPS的抗氧化、抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫等生理活性角度考慮，EPS產(chǎn)量的提高具有重要意義。

2.2 最適紅茶添加量條件下菌體干重和EPS產(chǎn)量變化過(guò)程分析

在2.5%的最適紅茶添加量條件下，考察了靈芝菌發(fā)酵過(guò)程中菌體干重和EPS產(chǎn)量的變化情況（圖3）。紅茶的添加抑制了靈芝菌菌體的生長(zhǎng)，在0～3 d內(nèi)，對(duì)照組的菌體生長(zhǎng)經(jīng)短暫的適應(yīng)期后呈指數(shù)型增長(zhǎng)；而試驗(yàn)組由于紅茶中多酚類物質(zhì)對(duì)靈芝菌生長(zhǎng)的抑制作用使其適應(yīng)期較長(zhǎng)，生長(zhǎng)較為緩慢。在3～5 d內(nèi)，對(duì)照組的菌體生長(zhǎng)速率減慢，開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定期；而試驗(yàn)組逐漸適應(yīng)了茶葉中的多酚類物質(zhì)，生長(zhǎng)速率稍有增加。5 d后，對(duì)照組菌體開(kāi)始自溶，菌體干重逐漸減少；而試驗(yàn)組菌體經(jīng)過(guò)前期的適應(yīng)，生長(zhǎng)速率增加，在7～9 d內(nèi)，經(jīng)過(guò)穩(wěn)定期開(kāi)始自溶。

圖3 添加2.5%紅茶靈芝菌發(fā)酵過(guò)程中菌體干重變化

靈芝菌發(fā)酵過(guò)程中EPS產(chǎn)量變化見(jiàn)圖4。紅茶本身存在茶多糖，在靈芝菌未開(kāi)始發(fā)酵前，培養(yǎng)環(huán)境中即存在少量多糖。在0～3 d內(nèi)，試驗(yàn)組的多糖有先減少后增加趨勢(shì)，而對(duì)照組EPS產(chǎn)量則快速增加。3～5 d內(nèi)，對(duì)照組進(jìn)入穩(wěn)定期，EPS產(chǎn)量逐步積累至最大0.547 g?L-1；試驗(yàn)組菌體開(kāi)始適應(yīng)紅茶多酚類物質(zhì)環(huán)境，且在各種有利于EPS生成的誘導(dǎo)因子促進(jìn)下，EPS合成速率明顯增加。5 d后，由于對(duì)照組菌體開(kāi)始自溶，底物耗完，部分未自溶菌體利用已合成的胞外多糖滿足自身生長(zhǎng)，故EPS產(chǎn)量逐漸下降；而試驗(yàn)組靈芝菌的生長(zhǎng)環(huán)境中底物未耗完，有利于EPS產(chǎn)量進(jìn)一步增加，直至7 d達(dá)到最大產(chǎn)量0.985 g?L-1。

圖4 添加2.5%紅茶后靈芝菌發(fā)酵過(guò)程中EPS產(chǎn)量變化

從圖3和4得知，2.5%紅茶中既存在抑制靈芝菌菌體生長(zhǎng)的多酚類物質(zhì)，又存在可以促進(jìn)EPS合成和釋放的各種誘導(dǎo)因子。此外，當(dāng)靈芝菌菌體生長(zhǎng)處于穩(wěn)定期時(shí)，EPS的合成處于快速生長(zhǎng)期，由此可見(jiàn)，靈芝菌的菌體生長(zhǎng)和EPS合成屬于部分偶聯(lián)型的代謝［7］。

3 小結(jié)與討論

紅茶中富含多種蛋白質(zhì)、氨基酸、生物堿、茶色素、茶多糖和維生素及礦物質(zhì)，其營(yíng)養(yǎng)豐富，有利于促進(jìn)靈芝菌EPS的合成，同時(shí)紅茶也含有具抑菌作用的多酚類物質(zhì)。靈芝菌在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)分泌一種能降解多酚類物質(zhì)的多酚氧化酶，該酶可降解發(fā)酵液中的多酚，減少多酚類物質(zhì)對(duì)靈芝菌菌體生長(zhǎng)的影響，積累更多的胞外代謝產(chǎn)物［8］。因此，紅茶添加到靈芝菌發(fā)酵過(guò)程中，培養(yǎng)基中含少量的多酚類物質(zhì)，誘導(dǎo)靈芝菌合成多酚氧化酶，而多酚氧化酶的合成又可進(jìn)一步降解多酚類物質(zhì)，進(jìn)而緩解多酚類物質(zhì)對(duì)靈芝菌菌體生長(zhǎng)的抑制，從而促使靈芝菌分泌胞外代謝產(chǎn)物EPS，達(dá)到提高EPS產(chǎn)量的目的。

由試驗(yàn)結(jié)果可以推測(cè)，2.5%紅茶添加量中所含的多酚類物質(zhì)濃度可能在靈芝菌發(fā)酵體系中處于一種最適平衡濃度，故而能最大限度地提高靈芝菌EPS產(chǎn)量。同時(shí)，由于紅茶中豐富的營(yíng)養(yǎng)成分可以進(jìn)一步誘導(dǎo)靈芝菌合成EPS，因此添加2.5%紅茶后，靈芝菌EPS產(chǎn)量比對(duì)照組提高81.2%。

在發(fā)酵開(kāi)始的0～3 d適應(yīng)期，靈芝菌未及時(shí)合成多酚氧化酶，靈芝菌菌體生長(zhǎng)受到多酚類物質(zhì)抑制，而紅茶中本身存在的茶多糖被靈芝菌利用滿足自身生長(zhǎng)，EPS產(chǎn)量先減少后增加。3 d后，隨著多酚氧化酶的合成，多酚類物質(zhì)逐漸被降解，靈芝菌菌體逐漸適應(yīng)生長(zhǎng)環(huán)境開(kāi)始進(jìn)入快速合成EPS階段直至7 d后穩(wěn)定期結(jié)束菌體自溶，EPS產(chǎn)量下降。

綜上所述，紅茶的添加對(duì)靈芝菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)EPS具有積極作用，而關(guān)于這方面的研究較少，具體機(jī)制也有待進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯：張瑞麟）

S 567 < class="emphasis_bold">文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

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0528?9017（2014）01?0082?03

文獻(xiàn)著錄格式：高佳佳，劉書(shū)來(lái)，丁玉庭.紅茶添加對(duì)靈芝菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的影響［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（1）：82-85.

2013?10?04

高佳佳（1987-），女，浙江杭州人，碩士研究生，從事食品生物技術(shù)方面研究工作。E?mail：gaojiajia1123＠163.com。

劉書(shū)來(lái)（1977-），男，山東菏澤人，博士，副教授，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E?mail：slliu＠zjut.edu.cn。