黃小云，陶 鵬，王五宏，李必元，岳智臣，雷娟利，鐘新民

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，浙江杭州 310021；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇南京 210095）

結(jié)球甘藍(lán)離體葉片不定芽的再生研究

黃小云1，2，陶 鵬1，王五宏1，李必元1，岳智臣1，雷娟利1，鐘新民1

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，浙江杭州 310021；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇南京 210095）

以結(jié)球甘藍(lán)強(qiáng)力50組培苗葉片為外植體，研究不同激素配比、苗齡對(duì)其不定芽再生的影響。結(jié)果表明，在不含任何激素以及單獨(dú)添加不同濃度的6?BA或NAA的MS培養(yǎng)基上，均不能誘導(dǎo)外植體不定芽的分化；結(jié)球甘藍(lán)離體葉片不定芽在MS＋6?BA 2 mg·L-1＋NAA 0.80 mg·L-1分化培養(yǎng)基上再生頻率最高，為79.86%，最適宜的苗齡為8 d；外植體在生根培養(yǎng)基1／2 MS＋0.30 mg·L-1NAA中，不定芽的生根效果好，生根率達(dá)100.0%，且根系生長(zhǎng)健壯。

結(jié)球甘藍(lán)；不同激素配比；葉片；離體培養(yǎng)

結(jié)球甘藍(lán)（Brassica oleracea L.var.capitata L.）是十字花科蕓薹屬植物，是我國(guó)重要的蔬菜作物之一。近年來(lái)采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將目的基因?qū)虢Y(jié)球甘藍(lán)，已成為培育抗逆新品種的一種新手段，而建立穩(wěn)定可靠的高效離體再生體系是利用基因工程和其他技術(shù)育種的基礎(chǔ)。在結(jié)球甘藍(lán)離體培養(yǎng)研究中，以下胚軸作為外植體的研究最多［1-6］，且獲得高效高頻再生體系。葉綠體轉(zhuǎn)基因植物作為一種新型生物反應(yīng)器，具有外源蛋白表達(dá)量高和環(huán)境安全性好等優(yōu)點(diǎn)［7］，而葉片作為葉綠體轉(zhuǎn)基因植物最理想的外植體，研究其離體再生具有重要意義。本試驗(yàn)以結(jié)球甘藍(lán)強(qiáng)力50（簡(jiǎn)稱QL50）為材料，研究了不同激素配比、苗齡對(duì)離體子葉不定芽再生的影響，以期建立高效的植株再生體系，為今后通過(guò)葉綠體基因組遺傳轉(zhuǎn)化獲取預(yù)期優(yōu)良性狀的結(jié)球甘藍(lán)創(chuàng)造條件，并為進(jìn)一步有效地開(kāi)展結(jié)球甘藍(lán)葉綠體基因工程的研究奠定基礎(chǔ)。現(xiàn)將有關(guān)結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為結(jié)球甘藍(lán)QL50，由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供，取其無(wú)菌實(shí)生苗葉片為外植體。

1.2 方法

1.2.1 無(wú)菌苗培養(yǎng)

選取籽粒飽滿、大小均一的甘藍(lán)種子，用清水沖洗干凈，置于75%的酒精中浸泡30 s，用0.1%的HgCl2表面消毒5 min，最后用無(wú)菌水沖洗4次，再用滅菌濾紙吸去種子表面的水分，接種于無(wú)激素的MS基本培養(yǎng)基（蔗糖30 g·L-1＋瓊脂9 g· L-1，pH值5.8）上。于（25±2）℃、光照強(qiáng)度1 800 lx，16 h光／8 h暗的光周期條件下培養(yǎng)無(wú)菌苗。

1.2.2 不同激素組合試驗(yàn)

試驗(yàn)2種激素的不同組合，6?芐氨基腺嘌呤（6?BA）濃度為0，1，2，3，4 mg·L-1，萘乙酸（NAA）濃度為0，0.02，0.04，0.20，0.40，0.80 mg·L-1，進(jìn)行完全隨機(jī)組合。在材料苗長(zhǎng)約7 cm，切取0.3 cm×0.3 cm的葉片放入加有不同激素組合的MS分化培養(yǎng)基中。用培養(yǎng)皿進(jìn)行培養(yǎng)，每皿接種30個(gè)外植體，重復(fù)3次。培養(yǎng)20 d，觀察不定芽的分化情況，30 d后統(tǒng)計(jì)出芽情況。

1.2.3 苗齡試驗(yàn)

在篩選出來(lái)的出芽較好的培養(yǎng)基上，取7，8，9，10，11，12 d苗齡的外植體接種。培養(yǎng)30～35 d，統(tǒng)計(jì)不定芽分化率。

1.2.4 不定芽生根與植株移栽

當(dāng)分化培養(yǎng)基中的不定芽長(zhǎng)到1.5～2.5 cm時(shí)，切取后接種至含不同濃度生長(zhǎng)素的生根培養(yǎng)基（1／2MS＋0.30 mg·L-1NAA，1／2MS＋0.50 mg· L-1NAA）上直接誘導(dǎo)生根。待芽基部形成大量的毛根后，打開(kāi)培養(yǎng)瓶口，煉苗4～5 d后取出小植株，洗凈根部，移栽到基質(zhì)中，一周后觀察其成活率和生長(zhǎng)狀況。

1.3 不定芽再生頻率與生根率的計(jì)算

不定芽再生頻率／%＝（再生不定芽的外植體數(shù)／接種外植體總數(shù)）×100；不定芽再生系數(shù)＝外植體再生的不定芽總數(shù)／再生不定芽的外植體總數(shù)；褐化率／%＝（褐化芽數(shù)／總外植體數(shù)）×100；生根率／%＝（生根不定芽／接種不定芽數(shù)）×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素濃度對(duì)不定芽再生及葉片褐化的影響

2.1.1 不定芽再生

外植體接種于不同激素配比的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，5 d左右開(kāi)始膨大變厚；10 d后，6?BA濃度為1，2 mg·L-1的處理膨大明顯于3，4 mg·L-1的處理，其中3mg·L-16?BA膨大最弱，但是處理10和處理15即在6?BA濃度為1，2 mg·L-1的處理比濃度為3 mg·L-1的稍弱；接種20 d后，處理10和處理15已開(kāi)始出芽，大部分不定芽于接種后30～35 d產(chǎn)生，接種45 d后仍有少數(shù)不定芽的產(chǎn)生。由表1中可知，在MS培養(yǎng)基上單獨(dú)添加6?BA或NAA任何一種物質(zhì)，甘藍(lán)葉片均不能再生出不定芽，在不添加任何激素的MS培養(yǎng)基上，也不能再生不定芽，而同時(shí)添加6?BA和NAA的各處理均能誘導(dǎo)出不定芽（圖1中A，B），可見(jiàn)6?BA和NAA對(duì)于誘導(dǎo)甘藍(lán)葉片不定芽再生都是必要的。當(dāng)6?BA濃度一定時(shí)，0.04 mg·L-1NAA的處理不定芽再生率最低，而0.80 mg·L-1NAA的處理不定芽再生率偏高；當(dāng)NAA濃度一定時(shí)，3 mg·L-16?BA處理不定芽再生率總體偏低；而當(dāng)6?BA或NAA濃度一定時(shí)，隨著NAA或6?BA濃度的增加，其不定芽再生率和再生系數(shù)大多表現(xiàn)出先高后低再高趨勢(shì)，處理15的不定芽再生率顯著高于其他處理，達(dá)到79.86%，而處理6的不定芽再生系數(shù)顯著高于其他處理，達(dá)到0.72，但不定芽再生率較低，只有18.06%?？偟膩?lái)看，處理15最優(yōu)，處理10次之。

表1 6?BA與NAA不同配比對(duì)結(jié)球甘藍(lán)離體葉片不定芽再生的影響

2.1.2 葉片褐化

由表2可知，當(dāng)6?BA濃度一定時(shí)，褐化率隨著NAA的增大而減少，尤其是在NAA濃度為0.40 mg·L-1時(shí)，褐化率達(dá)到最低，但當(dāng)NAA到0.80 mg·L-1，褐化率開(kāi)始增大；當(dāng)NAA濃度一定時(shí)，6?BA濃度的變化，對(duì)褐化率的影響似無(wú)規(guī)律?？偟膩?lái)看，除了MS＋4 mg·L-16?BA＋0.02 mg· L-1NAA這個(gè)處理外，在NAA濃度大于0.04mg· L-1的所有處理，褐化率都低于10%，而在NAA為0.40mg·L-1時(shí)，褐化率均達(dá)到最低，且在MS＋1 mg·L-16?BA＋0.40mg·L-1NAA，MS＋2mg· L-16?BA＋0.40 mg·L-1NAA，MS＋4 mg·L-16?BA＋0.40 mg·L-1NAA處理時(shí)，褐化率最低達(dá)到0。

圖1 QL50葉片離體再生系統(tǒng)的情況

表2 不同處理對(duì)結(jié)球甘藍(lán)葉片離體再生黃褐化的影響

2.2 苗齡對(duì)不定芽再生的影響

不同苗齡的葉片對(duì)再生植株的形態(tài)發(fā)生有很大影響。由表3可知，當(dāng)苗齡7 d和12 d時(shí)，其再生率和再生系數(shù)均偏低，而褐化率偏高，可見(jiàn)苗齡偏小或偏大都不適宜甘藍(lán)葉片不定芽的再生；總的來(lái)看，當(dāng)苗齡為8 d時(shí)，表現(xiàn)出再生率和再生系數(shù)最高而褐化率最低，因此最適宜苗齡為8 d。

表3 不同苗齡對(duì)結(jié)球甘藍(lán)離體葉片不定芽再生的影響

2.3 不同生長(zhǎng)素濃度對(duì)不定芽誘導(dǎo)生根的影響

不定芽生根是植株再生必不可少的一步，有研究表明［4，5，8-11］，生根培養(yǎng)常用的是1／2MS培養(yǎng)基和NAA。由表4可知，不定芽在1／2MS＋0.3mg· L-1NAA培養(yǎng)基上效果更好；雖然2種處理不定芽的生根率均達(dá)到100%，但是NAA濃度為0.3 mg· L-1時(shí)，主根較粗且多（圖1中C），而NAA濃度為0.5 mg·L-1時(shí)，主根較少而須根多（圖1中D）。不定芽在生根培養(yǎng)基中20 d后可形成較多的不定根，此時(shí)獲得完整的再生植株（圖1中E）。再生植株經(jīng)馴化煉苗后移入營(yíng)養(yǎng)缽中，套塑料袋保濕。1周后去袋，再培養(yǎng)15 d左右，移栽到大花缽中讓其充分生長(zhǎng)（圖1中F），直至現(xiàn)蕾、開(kāi)花。

表4 不同生長(zhǎng)素濃度對(duì)不定芽誘導(dǎo)生根的影響

3 小結(jié)與討論

葉綠體基因工程是以葉綠體基因組為平臺(tái)進(jìn)行遺傳操作，與核轉(zhuǎn)基因相比具有明顯的優(yōu)越性：外源基因的高效表達(dá)，基因的原核表達(dá)形式，無(wú)位置效應(yīng)和基因沉默現(xiàn)象，環(huán)境安全性好［12］。目前已經(jīng)有許多作物品種通過(guò)葉綠體基因工程獲得了抗除草劑、抗蟲(chóng)、抗病、耐鹽耐旱的特性［13］。葉綠體轉(zhuǎn)基因植物雖是生物反應(yīng)器的理想系統(tǒng)，但葉綠體轉(zhuǎn)基因仍面臨著許多挑戰(zhàn)，高效葉片再生體系的建立更是當(dāng)務(wù)之急。目前，Liu等［14］已成功進(jìn)行了甘藍(lán)葉綠體轉(zhuǎn)化，這表明甘藍(lán)進(jìn)行葉綠體轉(zhuǎn)基因是可行的而且具有前景，探索結(jié)球甘藍(lán)葉片離體再生體系為葉綠體轉(zhuǎn)基因奠定了基礎(chǔ)。

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是誘導(dǎo)不定芽分化的重要因素，一般來(lái)說(shuō)細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的比率決定著器官分化的類型，當(dāng)細(xì)胞分裂素占優(yōu)勢(shì)時(shí)有利于芽的分化，當(dāng)生長(zhǎng)素占優(yōu)勢(shì)時(shí)有利于根的分化［15］。在蕓薹屬植物組織培養(yǎng)中能分化出再生植株的培養(yǎng)基大多采用6?BA和NAA的激素組合。本試驗(yàn)中，在不添加任何激素的MS培養(yǎng)基上，或只含有6?BA和NAA任一激素的培養(yǎng)基中，葉片均不能誘導(dǎo)出不定芽，而只在6?BA和NAA適宜濃度配比時(shí)能誘導(dǎo)出大量的不定芽，這說(shuō)明在不定芽的誘導(dǎo)過(guò)程中，細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素都是必須的，并且要求適宜的激素配比才能高效地誘導(dǎo)外植體不定芽的產(chǎn)生，這與李光遠(yuǎn)等［4，9-10，16-21］的試驗(yàn)結(jié)果一致。

葉片的生理狀態(tài)也是影響再生的一個(gè)關(guān)鍵因素，適宜的苗齡有助于提高不定芽再生率。本研究結(jié)果表明，不同的苗齡對(duì)于不定芽再生存在差異性，苗齡偏?。? d）或偏大（12 d）都不適宜甘藍(lán)葉片不定芽的再生，再生率低，褐化較多；當(dāng)苗齡8 d時(shí)，再生率和再生系數(shù)高而褐化率最低，適宜誘導(dǎo)不定芽的再生。

根系健壯是獲得完整再生植株的重要保證，在不定根形成過(guò)程中，生長(zhǎng)素起著主要作用［22］，1／2MS培養(yǎng)基較少的養(yǎng)分含量，反而有利于植物為了吸收營(yíng)養(yǎng)而生根來(lái)適應(yīng)環(huán)境。本研究結(jié)果表明，NAA對(duì)于不定芽的生根具有良好的誘導(dǎo)效果。在1／2MS＋0.3 mg· L-1NAA處理下，不定芽生根率達(dá)到100%，且根系健壯。在生根培養(yǎng)中，應(yīng)該注意選擇長(zhǎng)勢(shì)好的不定芽進(jìn)行生根誘導(dǎo)以獲得健壯的再生植株，同時(shí)一定要洗盡根系上附著的培養(yǎng)基，以防止霉變而降低移栽成活率。當(dāng)外部環(huán)境不適宜培養(yǎng)時(shí)，選擇光溫培養(yǎng)箱進(jìn)行移栽培養(yǎng)會(huì)提高成活率。

愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖及形態(tài)建成主要受外植體本身、培養(yǎng)基和培養(yǎng)環(huán)境3大因素的調(diào)控，在綜合條件適宜的情況下更易獲得再生植株。本試驗(yàn)中甘藍(lán)葉片離體的再生率偏低，還有葉片褐化的現(xiàn)象。AgNO3通常作為乙烯抑制劑而在組織培養(yǎng)中使用，它可以促進(jìn)外植體分化、防止褐化，從而可以較大幅度地提高再生頻率及再生芽數(shù)［23］。今后可利用AgNO3，進(jìn)一步調(diào)整不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合及不同基因型葉片對(duì)再生不定芽的影響，使獲得的再生體系具有良好的通用性。

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（責(zé)任編輯：張才德）

S 635.1 < class="emphasis_bold">文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

A

0528?9017（2014）01?0034?04

文獻(xiàn)著錄格式：黃小云，陶鵬，王五宏，等.結(jié)球甘藍(lán)離體葉片不定芽的再生研究［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（1）：34-38.

2013?08?22

浙江省農(nóng)業(yè)新品種選育重大科技專項(xiàng)（2012C12903?6?2）；浙江省博士后科研項(xiàng)目（Bsh1202084）；浙江省蔬菜產(chǎn)業(yè)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2009R50026）

黃小云（1989-），女，湖北孝感人，碩士，主要從事蔬菜作物遺傳育種研究工作。E?mail：yunxiaohuang1107＠126.com。

鐘新民，E?mail：zxm lly＠hotmail.com。