薛 晶，何文志，張會華，馬澤輝，楊曉麗，俞德洪，杜迎春

（云南省彌勒市糖業(yè)辦公室，彌勒652300）

彌勒蔗區(qū)甘蔗宿根矮化病發(fā)生分布及病原檢測

薛 晶，何文志，張會華，馬澤輝，楊曉麗，俞德洪，杜迎春

（云南省彌勒市糖業(yè)辦公室，彌勒652300）

為明確云南彌勒蔗區(qū)甘蔗宿根矮化?。≧SD）的分布、發(fā)生危害情況，對云南彌勒蔗區(qū)RSD的發(fā)生和分布進行了調(diào)查和田間采樣，采用PCR法對田間采集的60個樣本進行RSD檢測。結(jié)果表明：52個樣本為陽性，陽性檢出率86.67%，確認(rèn)彌勒蔗區(qū)存在RSD；通過系統(tǒng)分析，明確了不同品種、不同植期、不同蔗地RSD發(fā)生狀況，為彌勒蔗區(qū)推廣應(yīng)用溫水脫毒健康種苗、有效防控甘蔗宿根矮化病提供了科學(xué)依據(jù)。

甘蔗宿根矮化病；發(fā)生；檢測

甘蔗宿根矮化病由一種棒桿菌屬細(xì)菌（Leifsonia xyli subsp.xyli，Lxx）寄生于蔗株維管束中引起，主要通過帶病蔗種和收獲、砍種刀具等傳播蔓延，且傳播性極強[1-3]。此病屬維管束病害，用一般的物理、化學(xué)方法難以消除，有效的防治方法是生產(chǎn)、繁殖和推廣脫毒健康種苗，已在澳大利亞、美國、巴西、古巴、南非、菲律賓及我國臺灣省等地應(yīng)用多年[1，4-5]。摸清蔗區(qū)甘蔗宿根矮化病的分布、發(fā)生危害情況，是科學(xué)推廣脫毒健康種苗、有效防控甘蔗宿根矮化病的關(guān)鍵。彌勒作為中國和云南省甘蔗生產(chǎn)優(yōu)勢區(qū)域市，至今未對甘蔗RSD進行全面調(diào)查，尤其近年來，在甘蔗生產(chǎn)快速發(fā)展中，甘蔗品種改良更新加快，種植制度多樣化，而作為影響甘蔗生產(chǎn)的重要病害甘蔗RSD的分布、發(fā)生危害和各主栽品種的感病程度等情況均不清，推廣應(yīng)用脫毒健康種苗、有效防控甘蔗RSD缺乏可靠依據(jù)。為此，我們于2013年對彌勒甘蔗主產(chǎn)鄉(xiāng)鎮(zhèn)RSD的發(fā)生和分布進行了調(diào)查和田間采樣，采用PCR檢測技術(shù)進行RSD檢測，分析明確了彌勒蔗區(qū)RSD的分布、發(fā)生危害和各主栽品種的感病程度等情況，為推廣應(yīng)用脫毒健康種苗、有效防控甘蔗RSD提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病害調(diào)查與樣品采集

于2013年1月9—10日甘蔗成熟期，對云南彌勒朋普、竹園、江邊、巡檢司等甘蔗主產(chǎn)鄉(xiāng)鎮(zhèn)宿根矮化病的發(fā)生和分布進行了調(diào)查和田間采樣。采樣選擇具有代表性的主栽品種，根據(jù)品種、植期分類，采用5點取樣法取樣，共采集60個樣本。每個樣本取10株，每株截取中下部莖節(jié)各1節(jié)，每節(jié)切成約7 cm長，縱向“十字”剖為4份，再用鉗子擠壓蔗莖，共取約25 mL的蔗汁于50 mL離心管內(nèi)混勻，樣品放于冰箱中，于-20℃保存待用。每取1個樣品后，取樣工具先用清水沖洗，再用75%的酒精進行消毒。RSD陽性對照由云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室鑒定保存，陰性對照為50±0.5℃熱水處理2h的無菌蔗株，空白對照為滅菌去離子水。

1.2 PCR檢測

1.2.1 引物設(shè)計引物序列采用已報道的RSD病原細(xì)菌Lxx 16S～23S rDNA基因間隔區(qū)特異引物[6]，預(yù)期擴增片段大小為438 bp（上游引物L(fēng)xx1：5＇-CCGAAGTGAGCAGATTGACC-3＇；下游引物L(fēng)xx2：5＇-ACCCTGTGTTGTTTTCAACG-3＇），委托上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2 蔗汁總DNA的提取用改進的CTAB法提取蔗汁總DNA[7]。每個樣品取2mL蔗汁放入離心管中，12000r/min離心10min，棄上清；沉淀加入300μL滅菌去離子水稀釋混勻；加入600μL經(jīng)65℃預(yù)熱的2% CTAB抽提緩沖液，65℃水浴1h（期間每隔20min搖勻1次）；加入600 μL氯仿/異戊醇（24∶1）劇烈振蕩30s，12000r/min離心10min；取上清液700μL置于新的1.5mL離心管中，加入等體積氯仿/異戊醇（24:1）溫和地混勻，12000r/min離心10min；取上清液650μL置于新的1.5mL離心管中，加入2/3體積（455μL）的異丙醇，混勻后置-20℃冰箱中沉淀4h或過夜；4℃下12000r/min離心10min；棄上清液，沉淀分別用400μL預(yù)冷的70%乙醇和冷無水乙醇各洗1次；室溫下風(fēng)干，溶于30μL雙蒸水中（用手指輕彈離心管使沉淀懸浮），-20℃保存。

1.2.3 PCR擴增和結(jié)果判別以抽提的蔗汁總DNA為模版，采用天根生化科技（北京）有限公司的Taq PCR MasterMix進行PCR擴增。擴增體系20μL：ddH2O 8.6μL，2×PCR Taq mix 8μL，DNA模板3μL，上下游引物各0.2μL（20μg/μL）；擴增程序為：95℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，35個循環(huán)后72℃延伸5min。PCR擴增結(jié)果判別：取10μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增到438bp條帶的為陽性，未擴出438bp條帶的為陰性；根據(jù)目的片段條帶亮度的強弱進一步判別樣品帶菌濃度的相對高低，條帶較亮的樣品為強陽性、一般的為中陽性，較弱的為弱陽性。

2 結(jié)果與分析

2.1 各主產(chǎn)鄉(xiāng)鎮(zhèn)（基地）RSD發(fā)生情況

采用RCR檢測方法，對采自云南彌勒朋普、竹園、江邊、巡檢司4個甘蔗主產(chǎn)鄉(xiāng)鎮(zhèn)（基地）的60個樣本進行RSD檢測。結(jié)果表明，彌勒蔗區(qū)RSD發(fā)生普遍，60個樣品中52個呈陽性，陽性檢出率為86.67%；其中強陽性樣品37個，占61.67%；4個甘蔗主產(chǎn)鄉(xiāng)鎮(zhèn)均檢測出RSD，陽性檢出率83.33%～91.67%，檢出率最高的是江邊鄉(xiāng)91.67%、其次是朋普鎮(zhèn)86.96%、巡檢司鎮(zhèn)85.71%、竹園鎮(zhèn)83.33%（表1）。

2.2 不同品種RSD發(fā)生情況

從檢測結(jié)果看，彌勒蔗區(qū)閩糖69-421、ROC16、ROC22、ROC26四個主栽品種均嚴(yán)重發(fā)病，發(fā)病率分別為93.33%、76.92%、86.67%和87.50%；強陽性率分別為66.67%、69.23%、86.67%、62.50%。此外，5個主推品種云蔗03-258、福農(nóng)91-21、ROC96-38、云蔗99-91、云蔗03-194也全部感染RSD（表1）

2.3 不同植期、蔗地RSD發(fā)生情況

從表1可看出，植期上1、2、3、4、5年均不同程度發(fā)病，但不同植期之間發(fā)病率和發(fā)病程度都沒有明顯的規(guī)律性。旱地、水田均發(fā)病。其中，旱地蔗樣品陽性檢出率為91.18%；水田蔗樣品陽性檢出率為88.46%，旱地蔗發(fā)病率比水田蔗稍高。

表1 不同情況下甘蔗宿根矮化病發(fā)生情況

3 結(jié)論與討論

3.1 甘蔗宿根矮化病在彌勒蔗區(qū)普遍發(fā)生且發(fā)病率高。彌勒市的朋普、竹園、江邊、巡檢司4個主產(chǎn)鄉(xiāng)鎮(zhèn)蔗區(qū)均檢測出RSD，供檢測的60個樣品中，有52個樣品為陽性，陽性檢出率高達(dá)86.67%，其中強陽性樣品為37個，占61.67%。檢測結(jié)果表明，RSD在彌勒市蔗區(qū)發(fā)生普遍且嚴(yán)重；4個主栽品種均嚴(yán)重發(fā)病，發(fā)病率76.92%～93.33%，5個主推品種也全部感染RSD；植期上1、2、3、4、5年均不同程度發(fā)病，但不同種植年限間發(fā)病率和發(fā)病程度都沒有明顯的規(guī)律性；水田、旱地均發(fā)病，其中旱地比水田發(fā)病率稍高。

3.2 彌勒蔗區(qū)應(yīng)大力示范推廣種植溫水脫毒健康種苗。結(jié)合我們2008—2012年溫水脫毒健康種苗試驗和生產(chǎn)示范結(jié)果，無論新植蔗、宿根蔗，一級健康種、二級健康種、三級健康種均有不同程度增產(chǎn)，增幅10%～35%[8]。因此，根據(jù)甘蔗宿根矮化病檢測結(jié)果，在蔗區(qū)推廣應(yīng)用甘蔗溫水脫毒健康種苗將會獲得較好的社會、經(jīng)濟效益，可有效地防治甘蔗宿根矮化病的傳播，提高甘蔗單產(chǎn)15t/hm2左右，延長甘蔗宿根年限1～2年。甘蔗溫水脫毒健康種苗是目前甘蔗生產(chǎn)上最具潛力和增效的甘蔗科技重要措施，因此，要認(rèn)真組織做好甘蔗溫水脫毒健康種苗生產(chǎn)、繁殖、示范工作，建立甘蔗溫水脫毒健康種苗的生產(chǎn)與應(yīng)用推廣技術(shù)體系及相應(yīng)技術(shù)規(guī)程，在生產(chǎn)上加快示范推廣，大幅度提高甘蔗的單產(chǎn)、延長宿根年限，從而提高甘蔗生產(chǎn)的經(jīng)濟效益，以此解決甘蔗生產(chǎn)特別是宿根甘蔗低產(chǎn)、宿根年限短、生產(chǎn)成本高，效益差的問題。

3.3 強化甘蔗溫水脫毒健康種苗繁殖示范基地建設(shè)。依托彌勒甘蔗新品種新技術(shù)示范基地（位于朋普鎮(zhèn)朋普村，面積20hm2）和云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所第三科研基地（位于朋普鎮(zhèn)黑果壩村，面積18hm2），建設(shè)甘蔗溫水脫毒健康種苗繁殖示范基地一級種苗圃；在蔗區(qū)4個鄉(xiāng)鎮(zhèn)6hm2以上甘蔗種植大戶建設(shè)甘蔗溫水脫毒健康種苗基地二、三級種苗圃，由二、三級健康種苗圃直接為大面積生產(chǎn)提供無病種苗。

[1]J.P.馬丁，E.V.阿伯特，C.G.休慈（陳慶龍譯）.世界甘蔗病害（第1卷）[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1982：299-319.

[2]Lopes S A and Damann K E.PCR amplification of DNA from bacterial pathogens of sugarcane[J].Phytopathology,1993,83:1398.

[3]James G.A review of ratoon stunting disease[J].International Sugar Journal,1996,98(1174):532-541.

[4]Davis M J,Gillaspie A G,Harris R W,et al.Ratoon stunting disease of sugarcane:isolation of the causal bacterium[J].Science, 1980,210(4476):1365-1367.

[5]游建華，何為中，曾慧，等.談脫毒健康種苗在廣西甘蔗生產(chǎn)的應(yīng)用及效益展望[J].甘蔗糖業(yè)，2001（1）：13-17.

[6]Pan Y B,Grisbam M P,Buroer D M,et al.A polymerase chain reaction protocol for the detection of Clavibacter xyli subsp.xyli, the causal bacterium of sugarcane ratoon stunting disease[J].Plant Disease,1998,82(3):285-290.

[7]李文鳳，王曉燕，黃應(yīng)昆，等.廣西宜州蔗區(qū)甘蔗宿根矮化病的調(diào)查及病原檢測[J].中國糖料，2012（1）：47-49.

[8]薛晶，黃應(yīng)昆，張會華，等.甘蔗溫水脫毒健康種苗田間栽培產(chǎn)量比較[J].廣西蔗糖，2011（3）：3-6.

Occurrence and Pathogen Detection of Sugarcane Ratoon Stunting Disease in Mile

XUE Jing,HE Wen-zhi,ZHANG Hui-hua,MA Ze-hui,YANG Xiao-li,YU De-hong,DU Ying-chun
(Sugar Industry Office of Yunnan Province Mile City,Mile 652300,China)

Sixty samples were collected to detect RSD by PCR for understanding the occurrence,distribution and damage of sugarcane ratoon stunting disease(RSD)in Mile,Yunnan province.The results showed that 52 samples were positive to RSD as the presence of RSD in Mile.RSD occurrence from different cultivars in different seasons and regions was confirmed by systematic analysis to provide a scientific basis for extension and application of bacteria-free seedlings with hot water treatment for effective control of RSD in Mile.

sugarcane ratoon stunting disease;occurrence;detection

S435.661

A

1007-2624（2014）02-0028-02

10.13570/j.cnki.scc.2014.02.010

2013-08-13

云南省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)甘蔗產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金資助。

薛晶（1967-），男，云南省彌勒市人，推廣研究員，主要從事甘蔗科技推廣，E-mail：mlxjing@sohu.com。