羅慶云，田 敏，謝越盛，林英英，王康才

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，南京210095）

甜葉菊甜菊糖苷含量分析用RA和STV乙醇超聲提取體系優(yōu)化

羅慶云，田 敏，謝越盛，林英英，王康才

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，南京210095）

為建立一種甜葉菊葉片RA和STV提取方法，促進甜葉菊種質(zhì)RA和STV等甜菊糖苷含量分析用樣品制備體系的優(yōu)化，基于乙醇超聲提取法，采用單因素結(jié)合正交設(shè)計實驗，分析提取用乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲提取時間、超聲提取溫度等因素對甜菊葉片RA和STV提取效率的影響，優(yōu)化各參數(shù)，并以現(xiàn)有提取體系為參照，對其優(yōu)越性進行了檢驗。結(jié)果表明，本研究建立了一種RA和STV提取效率較現(xiàn)有體系明顯優(yōu)化的提取方法，具體操作方法為：將甜葉菊葉片粉末按料液比1∶20（m:v）加入50%（v:v）乙醇，室溫振蕩過夜，40℃下超聲提取60min。

甜葉菊；甜菊糖苷；提?。粌?yōu)化；RA；STV

甜葉菊（Stevia rebaudiana Bertoni），原產(chǎn)于巴拉圭[1]，為菊科多年生草本糖料作物，其葉含30多種甜菊糖苷類組分[2-3]，自1976年引入以來，我國已成為甜葉菊主產(chǎn)區(qū)，甜葉菊葉提取物甜菊糖苷出口量占世界出口總量80%[4-5]。RA（萊鮑迪苷A，Rebaudioside A）和STV（甜菊糖苷，Stevioside）為甜葉菊葉片所含兩種主要甜菊糖苷類組分[6-7]，隨著美國FDA和歐盟食品安全局對RA安全性的認(rèn)可，歐美市場對“第三代糖源”RA的需求量加大[8]，我國及世界各地區(qū)高RA苷含量、高RA/STV甜葉菊新品種的種植面積將進一步擴大[7]。為適應(yīng)市場需求對甜葉菊品種的要求，須大力開展高RA苷含量和高RA/STV的甜葉菊新品種選育。

甜葉菊種質(zhì)RA和STV含量檢測是甜葉菊新品種選育的依據(jù)。甜葉菊種質(zhì)RA和STV含量的測定包括提取、分離和檢測3個步驟，其中，葉片所含RA和STV的高效提取是后繼分離和檢測的基礎(chǔ)，只有對甜葉菊葉片所含RA和STV進行充分提取，才能對甜葉菊種質(zhì)甜菊糖苷含量進行準(zhǔn)確評估[9-14]。此外，在甜葉菊種質(zhì)評估中，由于需要同時處理大量的樣品，快速簡便樣品處理體系的建成顯得非常重要。為此，本研究的目的就是為甜葉菊種質(zhì)甜菊糖苷含量的檢測建立一種快速、簡便、高效的RA和STV提取方法，推動高RA苷含量、高RA/STV甜葉菊新品種選育。

由于RA和STV都為具有一定水溶性的化合物，目前有關(guān)甜葉菊種質(zhì)RA和STV提取的方法都是以溶劑浸提法為基礎(chǔ)發(fā)展起來的，所使用的溶劑包括水、甲醇等[10-14]，并通過超聲、加熱等方式來促進RA和STV向溶劑傳遞。超聲助溶乙醇提取法以操作簡便、提取效率高、環(huán)境污染小而被人們廣泛應(yīng)用于植物化學(xué)組分的分離提取[15-17]，但在甜葉菊RA和STV提取分離中的應(yīng)用還未見報道。為探討超聲助溶乙醇提取法在甜葉菊RA和STV提取分離中的應(yīng)用，優(yōu)化現(xiàn)有提取體系，本研究采用單因素結(jié)合正交設(shè)計實驗，對超聲助溶乙醇提取法中提取用乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時間、超聲提取水浴溫度等因素對RA和STV提取效率的影響進行了聯(lián)合分析，優(yōu)化了各提取參數(shù)，并以現(xiàn)有提取體系為參照，對本提取方法的優(yōu)越性進行了檢驗。

1 材料和方法

1.1 材料處理

1.1.1 材料研究所用材料為甜葉菊扦插苗鑫農(nóng)4號葉片，由安徽宿州群富甜葉菊專業(yè)合作社提供，經(jīng)鑒定為菊科植物甜葉菊（S.rebaudiana）。

1.1.2 材料的預(yù)處理將所得鑫農(nóng)4號葉片剔除雜質(zhì)和色澤灰暗者后，80℃烘干，于研缽中研磨充分，過60目篩，于干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 材料的處理精確稱取50mg甜葉菊粉末，加入各體積分?jǐn)?shù)的乙醇1.0mL，混勻，室溫振蕩過夜，置相應(yīng)水溫水浴的KQ2200E型超聲波清洗儀中超聲提取相應(yīng)時間后10000r/min離心10min，取上清，重復(fù)提取3次后合并上清，4℃保存?zhèn)溆?。同時設(shè)3個提取重復(fù)。

在2.3驗證對比實驗中涉及的前人相關(guān)樣品處理方法分別參照相應(yīng)文獻方法進行（表2）。其中，文獻1為利用甲醇室溫超聲提取10min，重復(fù)提取3次合并提取液[10]。文獻2是以水為提取用溶劑室溫振蕩浸提2h后再用正丁醇萃取的方法，重復(fù)提取3次合并提取液[11]。文獻3是利用水100℃振蕩浸提30min，重復(fù)提取3次合并提取液[12]。文獻4是利用pH為7.0的0.01M磷酸緩沖液（鈉鹽）100℃振蕩浸提5min，重復(fù)提取3次合并提取液[13]。文獻5是利用pH為7.0的0.01M磷酸緩沖液（鈉鹽）68℃振蕩浸提32min，重復(fù)提取3次合并提取液[14]。各提取液的精制等后續(xù)處理參照Liu[14]等方法進行。

1.2樣品的檢測

參照J(rèn)ECFA（2010）[18]方法檢測各樣品RA及STV含量。利用EXCEL（2007）處理各檢測數(shù)據(jù)和制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對RA和STV提取效率的影響圖1結(jié)果顯示RA和STV得率受提取所用乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響較大。在料液比1∶20（m:v），室溫下超聲提取40min的條件下，隨提取所用乙醇體積分?jǐn)?shù)從0%增大至30%，RA和STV得率迅速增大，當(dāng)提取所用乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%，50%和70%時，RA和STV得率受所用乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響不明顯，當(dāng)提取所用乙醇體積分?jǐn)?shù)超過70%時，RA和STV得率下降，當(dāng)提取所用乙醇體積分?jǐn)?shù)為100%時，RA和STV的得率都降到最低。

圖1 提取用乙醇濃度對RA和STV得率和RA/STV的影響

圖2 提取時間對RA和STV得率和RA/STV的影響

同時，圖1結(jié)果還顯示RA和STV得率比例也受提取所用乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響?？偟谋憩F(xiàn)為隨提取所用乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而逐漸降低，當(dāng)提取所用乙醇體積分?jǐn)?shù)為100%時，RA和STV的得率比例最低，但是當(dāng)提取所用乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%、50%和70%時，RA和STV的得率比例間差異不顯著。

2.1.2 超聲提取時間對RA和STV提取效率的影響根據(jù)實驗2.1.1的結(jié)果，用體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇以料液比1∶20，在室溫下超聲提取不同時間，以檢測超聲提取時間對RA和STV得率及其得率比例的影響。

圖3 提取水浴溫度對RA和STV得率和RA/STV的影響

表1-1 正交設(shè)計實驗結(jié)果及分析結(jié)果

圖2結(jié)果顯示，超聲提取時間對RA和STV得率及得率比例的影響不是特別明顯，但當(dāng)超聲提取時間小于20min時，RA和STV得率及其得率比例隨超聲提取時間的延長而增大，當(dāng)超聲提取時間大于20min時，RA和STV得率及其得率比例受超聲提取所用時間的影響不明顯，各處理間差異不顯著。

2.1.3 超聲提取溫度對RA和STV提取效率的影響根據(jù)實驗2.1.1和實驗2.1.2的結(jié)果，用體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇以料液比1∶20，分別在室溫（25℃）、40℃、60℃和80℃下超聲提取40min，以檢測超聲提取水浴溫度對RA和STV得率及其得率比例的影響。圖3結(jié)果顯示，超聲提取水浴溫度對RA和STV得率及其得率比例的影響不明顯，但當(dāng)超聲提取水浴溫度超過40℃時，RA和STV得率表現(xiàn)出輕微的下降；而RA和STV得率比例受超聲提取水浴溫度的影響不明顯，各處理間差異不顯著。

2.2正交設(shè)計實驗

根據(jù)實驗2.1.1、實驗2.1.2和實驗2.1.3的結(jié)果，用正交設(shè)計實驗聯(lián)合分析提取用乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲提取水浴溫度和超聲提取時間三因素對RA和STV得率的影響，具體的實驗及分析結(jié)果見表1-1、1-2。RA和STV得率受提取用乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲提取水浴溫度和超聲提取時間三因素影響由強到弱的順序都表現(xiàn)為超聲提取時間＞提取用乙醇體積分?jǐn)?shù)＞超聲提取水浴溫度。在上述三因素中，除提取溫度對RA和STV得率的影響都一樣外（最佳提取溫度為40℃），提取用乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲提取時間對RA和STV得率的影響不同。

首先，提取用乙醇體積分?jǐn)?shù)對RA和STV得率影響出現(xiàn)極化現(xiàn)象，即，對RA最適合的提取用乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%，而對STV最適合的提取用乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%；而超聲提取時間對RA和STV得率的影響都表現(xiàn)為適當(dāng)延長超聲提取時間可以提高RA和STV得率，對RA最適合的超聲提取時間為60min，而對STV最適合的超聲提取時間為40min。為實現(xiàn)RA和STV的充分提取和同步檢測，結(jié)合表1結(jié)果，本研究將甜葉菊葉片RA和STV提取各參數(shù)確定為：提取用乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、超聲提取水浴溫度為40℃、超聲提取時間為60min。

表1 -2 正交設(shè)計實驗結(jié)果及分析結(jié)果

表2 本優(yōu)化方法與文獻方法的比較

2.3 驗證對比實驗

為進一步驗證實驗2.2所確定的超聲提取各因素組合對RA和STV得率及得率比例的影響，本實驗在正交設(shè)計實驗2.2的基礎(chǔ)上，聯(lián)合已發(fā)表的相關(guān)方法對本研究正交設(shè)計實驗2.2所確定的RA和STV提取方法進行了驗證。表2的結(jié)果表明，與已發(fā)表的5種方法相比較，實驗2.2所確定的方法在提高RA和STV得率、維持RA和STV得率比例參數(shù)的穩(wěn)定性等方面顯示出了較好的優(yōu)越性，可作為準(zhǔn)確評估甜葉菊種質(zhì)葉片RA和STV含量及其比例的提取方法。

3 討論和結(jié)論

RA和STV為現(xiàn)有甜葉菊栽培品種葉片中的主要甜菊糖苷類物質(zhì)，隨著市場對RA需求量的增加[11]，須大力開展高RA苷含量和高RA/STV含量比值的甜葉菊新品種選育，為促進甜葉菊新品種的選育，有必要建立一種可用于甜葉菊種質(zhì)RA和STV含量特性分析的快速、簡便、高效的RA和STV提取方法。超聲助溶乙醇提取法以其溶媒極性可調(diào)、操作簡便、提取效率高、環(huán)境污染小而被廣泛應(yīng)用于植物化學(xué)組分的分離提取[15-17]，但在甜葉菊RA和STV提取分離中還未見報道。為此，本研究對以水和乙醇的混合溶媒在甜葉菊種質(zhì)評價時RA和STV提取上的應(yīng)用進行了探討。

正交設(shè)計實驗結(jié)果表明提取用溶媒極性對RA和STV得率影響是除提取時間外影響最大的因素（表1）?，F(xiàn)有的RA和STV提取方法都是基于單一溶媒（水或甲醇）而建立的，我們在研究中發(fā)現(xiàn)RA和STV具有不同的水溶性，其中RA由于其分子結(jié)構(gòu)上具有3個葡萄糖基團，其水溶性較STV強，而STV的脂溶性較強（未發(fā)表資料）。圖1的結(jié)果顯示：RA和STV得率在純水和純乙醇的情況下遠(yuǎn)低于使用混合溶媒的情況，這是目前為止有關(guān)混合溶媒在RA和STV提取上的首次應(yīng)用報道。這一結(jié)果同時也得到了實驗2.3中相關(guān)研究結(jié)果的印證，表明在甜葉菊種質(zhì)評價中，與采用純合試劑作為提取用溶媒相比，較宜利用兩極性不同的溶劑配制適宜比例的混合溶劑來提取?？梢赃M一步推斷的是，由于甜葉菊體內(nèi)存在的30多種甜菊糖苷類化合物間分子結(jié)構(gòu)和極性差異大，若欲進一步詳細(xì)評價甜葉菊種質(zhì)中各甜菊糖苷組分含量，深入評估不同極性混合溶媒在各甜菊糖苷組分提取中的可行性應(yīng)是一個大的研究方向。

適宜水浴溫度可促進溶質(zhì)向溶媒的擴散，提高超聲提取效率，圖3的結(jié)果顯示，與常溫相比較，當(dāng)水浴溫度為40℃時，RA和STV的得率有所提高；但是，當(dāng)水浴溫度高于40℃時，RA和STV的得率反倒表現(xiàn)出不明顯的輕微下降，這可能是由于過高的提取溫度易于引起混合溶媒中乙醇的部分揮發(fā)，使提取體系中乙醇隨提取時間的延長而部分減少所致。需要說明的是，為克服這一現(xiàn)象，本研究采用的是密閉體系，但也觀察到提取用試管的局部區(qū)域出現(xiàn)液滴，這有可能就是在超聲過程中揮發(fā)出的乙醇，從而引起與物料實際接觸的溶媒中乙醇量的減少。當(dāng)然，由水浴溫度所引起的提取體系局部乙醇量輕微減少對RA和STV得率影響并不嚴(yán)重，因為實驗2.2的正交設(shè)計分析結(jié)果表明提取用水浴溫度對RA和STV的得率的影響在本研究所探討的3個因素中為最?。ū?），這一結(jié)果也為實驗2.1.3有關(guān)超聲提取水浴溫度對RA和STV得率及其得率比例影響不明顯的結(jié)果所印證（圖3）。

實驗2.3的結(jié)果表明，與現(xiàn)有已發(fā)表的方法相比較，依照本研究所建立的方法所得RA和STV得率明顯較高，同時，數(shù)據(jù)誤差小、精確性高（表2）。為此，本研究建立了一種在RA和STV得率等方面明顯優(yōu)于已有方法，可更充分地提取甜葉菊葉片所含以RA和STV為代表的甜菊糖苷，為更快速準(zhǔn)確評價甜葉菊種質(zhì)RA和STV含量特性奠定了基礎(chǔ)，具有快速、簡便、高效等優(yōu)點，具體的提取方法為：將甜菊葉片粉末按料液比1∶20（m:v）加入50%（v:v）乙醇，室溫振蕩過夜，40℃下超聲提取60min。

[1]黃應(yīng)森，陸榮剛.甜菊栽培技術(shù)[M].南京：江蘇科學(xué)技術(shù)出版社，1981

[2]Ohta M,Sasa S,Inoue A,Tamai T,Fujita I,Morita K,Matsuura F.Characterization of novel steviol glycosides from leaves of Stevia rebaudiana Morita[J].J.Appl.Glycosci.,2010,57(3):199-209.

[3]Chaturvedula VSP,Clos JF,Rhea J,Milanowski D,Mocek U,DuBois GE,Prakash I.Minor diterpenoids glycosides from the leaves of Stevia rebaudiana[J].Phytochem.Lett.2011,4(3):209-212.

[4]舒世珍.新糖料作物——甜葉菊在京試種成功[J].農(nóng)業(yè)科技通訊，1979（2）：19-20.

[5]舒世珍.甜菊引種三十年[J].中國種業(yè)，2010（6）：21-23.

[6]何毓娟，黃彩云，李淑萍.甜葉菊的育種目標(biāo)及品種選育[J].種子世界，1997（9）：36-37.

[7]楊文婷，蔡乾蓉，徐應(yīng)文，等.四川引種甜葉菊的糖苷含量變異及優(yōu)良單株篩選[J].中國糖料，2010（2）：27-30，34.

[8]王貴民，董振紅，郝再彬.甜葉菊糖苷的應(yīng)用和安全性的研究進展[J].中國食品添加劑，2007，6：65-69.

[9]洪維廉，陳睦傳，李里焜，劉丹.甜菊不同葉齡細(xì)胞結(jié)構(gòu)及其甜菊糖甙含量分布的研究[J].武漢植物學(xué)研究,1987，5（3）：211-218，315-316.

[10]Claudio Gardanaa,Martina Scaglianti,Paolo Simonetti.Evaluation of steviol and its glycosides in Stevia rebaudiana leaves and commercial sweetener by ultra-high-performance liquid chromatography-mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A, 2010,1217(9):1463-1470.

[11]Latha Sivaram,Usha Mukundan.In vitro culture studies on steviarebaudiana[J].In Vitro Cell.Dev.Biol.—Plant,2003,39(5):520-523.

[12]Ursula Woelwer-Rieck,Christa Lankes,Andreas Wawrzun,Matthias W¨ust.Improved HPLC method for the evaluation of the major steviol glycosides in leaves of Stevia rebaudiana[J].Eur Food Res Technol,2010,231(4):581-588.

[13]Antonio S.Dacome,Cleuza C.da Silva,Cec＇lia E.M.da Costa,Jose＇D.Fontana,Juliana Adelmann,Silvio Cla＇udio da Costa. Sweet diterpenic glycosides balance of a new cultivar of Stevia rebaudiana(Bert.)Bertoni:Isolation and quantitative distribution by chromatographic,spectroscopic,and electrophoretic methods[J].Process Biochemistry,2005,40(11):3587-3594.

[14]Liu J,Li JW,Tang J.Ultrasonically assisted extraction of total carbohydrates from Stevia rebaudiana Bertoni and identification of extracts[J].Food and Bioproducts Processing,2010,88(2):215-221.

[15]謝秋濤，李高陽.超聲波輔助乙醇提取法提取玫瑰色素[J].食品與機械，2012，28（3）：148-150.

[16]謝陽姣，何志鵬，謝冬養(yǎng)，等.超聲輔助乙醇提取油茶籽餅多酚工藝的優(yōu)化[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2012，43（4）：515-519.

[17]梁興飛，郭宗樓.超聲輔助熱乙醇提取法測定浮游植物葉綠素a的方法優(yōu)化[J].水生生物學(xué)報，2010，34（4）：856-861.

[18]FAO.STEVIOL GLYCOSIDES[S].FAO JECFA Monographs,2010,10.

Optimization of Ultrasonic-assisted Ethanol Extraction of RA and STV for Analysis of Steviosides Content in Stevia

LUO Qing-yun,TIAN Min,XIE Yue-sheng,LIN Ying-ying,WANG Kang-cai
(College of Horticulture,Agricultural University of Nanjing,Nanjing 210095,China)

Method of ultrasonic-assisted ethanol extraction was optimized for establishing a sample preparation system for RA and STV content analysis in stevia germplasm.Firstly,3 factors of the ethanol concentration, extraction time and extraction temperature were optimized by using single factor experiments combined with orthogonal design experiments,and then the superiority of the established sample preparation system was tested by compared with 5 the existed preparation systems.Results showed that the newly established system was better than existed ones in the yields of RA and STV,and the specific operation process for the stevia leaf powder was added 20 times(m:v)50%ethanol and oscillated at room temperature overnight,and then ultrasonic extracted under 40℃for 60 minutes.

stevia;stevioside;extraction;optimization;RA;STV

566.901

A

1007-2624（2014）02-00010-04

10.13570/j.cnki.scc.2014.02.004

2013-08-30

高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金項目“磷酸化修飾對甜葉菊糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1糖基化Stevioside形成Rebaudioside A的調(diào)控機制研究”（20120097120033）。

羅慶云（1974-），男，重慶市墊江人，博士，講師。研究方向：植物次生代謝生理與遺傳。E-mail:qyluo@njau.edu.cn