鄒游興，劉向蕊，王洪星

（海南大學(xué)應(yīng)用科技學(xué)院，儋州571737）

甘蔗黃葉病毒P0基因的克隆與原核表達(dá)及抗血清制備

鄒游興，劉向蕊，王洪星

（海南大學(xué)應(yīng)用科技學(xué)院，儋州571737）

根據(jù)已發(fā)表ScYLV-P0基因系列設(shè)計(jì)特異性引物，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)從甘蔗病葉的mRNA擴(kuò)增得到目的DNA片段。以pET32a（+）為原核表達(dá)載體，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-P0。經(jīng)過(guò)雙酶切鑒定和DNA測(cè)序后，將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）pLySs，在30℃培養(yǎng)條件下IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。通過(guò)SDS-PAGE電泳檢測(cè)融合蛋白表達(dá)情況。表達(dá)結(jié)果顯示，在該表達(dá)系統(tǒng)中，融合表達(dá)蛋白P0是以包涵體形式的蛋白存在；P0融合蛋白大小約45 kDa，與P0開(kāi)放閱讀框的理論推算值29.991 kDa加上載體自身蛋白約18 kDa相符，用Ni2+-NTA瓊脂糖親和層析純化融合蛋白，免疫家兔制備出抗血清，通過(guò)酶聯(lián)法（ID-ELISA）測(cè)定本實(shí)驗(yàn)制備的ScYLY-P0抗血清工作濃度為1∶25000。

甘蔗黃葉病毒；沉默抑制子；原核表達(dá)；抗血清

甘蔗是禾本科（Graminaceae）甘蔗屬（Saccharum L.）植物，是重要的熱帶、亞熱帶經(jīng)濟(jì)作物，是許多國(guó)家和地區(qū)主要的糖料來(lái)源。甘蔗屬于無(wú)性繁殖作物，病毒的累積使病害逐年加重[1]。甘蔗黃葉病（Sugarcane yellow leaf disase，SCYLD）又稱(chēng)甘蔗黃葉綜合癥（Sugarcane yellow leaf syndrome，SCYLS）。1990年Schenck等人第一次報(bào)道了這種大面積出現(xiàn)于夏威夷群島夷哈馬庫(kù)亞（Hamakua）地區(qū)種植的H65-7025甘蔗品種上的非營(yíng)養(yǎng)缺乏性甘蔗黃化現(xiàn)象[2-3]。甘蔗黃葉病毒（Sugarcane yellow leaf virus，ScYLV）引起的甘蔗黃葉病亦稱(chēng)黃葉綜合癥是我國(guó)和世界甘蔗生產(chǎn)中最主要的病害之一，造成產(chǎn)量下降、品質(zhì)變劣和品種種性退化[4]。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)GenBank查找到的甘蔗黃葉病毒P0基因序列設(shè)計(jì)引物，連接到載體并進(jìn)行原核表達(dá)和高效價(jià)特異性抗血清制備。一方面我們可以利用獲得的表達(dá)蛋白制備多克隆抗血清，用于SCYLS的檢測(cè)；另一方面，也可將這些表達(dá)蛋白用于與之具有相互作用的宿主蛋白的體外篩選，為后期著手研究甘蔗黃葉病毒與寄主之間互作做一定的前期工作。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試病樣取甘蔗植株病征葉片，包裝編號(hào)后保存于本實(shí)驗(yàn)室-80℃冰箱中備用。

1.1.2 菌株與質(zhì)?？寺≥d體pMD 19-Tsimple vector購(gòu)自大連寶生物公司（TaKaRa）；表達(dá)載體pET-32a由本實(shí)驗(yàn)室保存；克隆菌株E.coli DH5α購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；表達(dá)菌株E.coli BL21（DE3）購(gòu)自德國(guó)默克公司。

1.1.3 酶和化學(xué)試劑Trizol Reagent、瓊脂糖凝膠回收Kit、質(zhì)粒小提Kit和DNA Marker購(gòu)自北京天根生物技術(shù)公司；M-MLV RT RnaseH、Rnase Inhibitor、ExTaq酶及Primer STARTM HS DNA Polymerase、rTaq DNA Polymerase、氨芐青霉素（Ampicillin）、限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ/HindⅢ、IPTG均購(gòu)自大連寶生物公司；蛋白低分子量Marker購(gòu)自Promega公司；丙烯酰胺、N，N＇-亞甲基雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷（Tris）購(gòu)自Solarbio公司；十二烷基磺酸鈉（SDS）、考馬斯亮藍(lán)R-250購(gòu)自Amresco公司；其它化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 甘蔗葉片總RNA的提取與cDNA的合成按照TianGen公司Kit說(shuō)明，用Trizol從嚴(yán)重感染甘蔗黃葉病毒的甘蔗葉片中提取總RNA。稱(chēng)取0.5 g葉片，放入加有液氮的研缽（用無(wú)水乙醇灼燒處理30 min滅活RNase）中研磨，研磨充分后轉(zhuǎn)入加有1 mL Trizol的1.5 mL離心管中，使之成為組織懸液，用氯仿抽提后加入等體積的異丙醇沉淀RNA，用75%的乙醇洗滌兩次，溶于適量的RNase-free水中，測(cè)定OD260/OD280值并確定總RNA的含量和純度。

按TaKaRa公司cDNA Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA的合成：取1μg總RNA，1 μL Oligo（dT）15.4 μL 5×RT Buffer，2 μL dNTP Mixture，1 μL RNase Inhibitor，逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL，加RNase-free水至總體積為20 μL，混勻，稍離心。30℃水浴10 min，42℃保溫60 min，75℃滅活10 min，4℃冷卻5 min，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 甘蔗黃葉病毒基因P0的克隆根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室獲得的甘蔗黃葉病毒基因序列設(shè)計(jì)引物對(duì)ScYLV P0-F/ScYLV P0-R（Invitrogen公司合成）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列如下：

ScYLVP0-F:5＇-CGGGATCCATGCTTTTCAACGAATT-3＇BamH I

ScYLVP0-R:5＇-CCCAAGCTTCTATATATCATGAGAATAGGT-3＇Hind III

PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，循環(huán)35次；72℃終止補(bǔ)償延伸10 min。

取5 μL PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠（含0.5 μg/mL Goldview）1×TAE緩沖體系中電泳，Maker為DL2000（TaKaRa公司），剩余PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收并純化目的片段。PCR產(chǎn)物純化采用TIANGEN瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（天根生物技術(shù)有限公司），具體操作過(guò)程參照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行?；厥誔CR產(chǎn)物用T-A克隆方法克隆到質(zhì)粒pMD 19-Tsimple vector（TaKaRa公司）中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α。

以菌液為模板進(jìn)行PCR法鑒定重組質(zhì)粒（引物同前）。陽(yáng)性質(zhì)粒抽提后進(jìn)行雙酶切（BamHⅠ/HindⅢ）鑒定陽(yáng)性重組子。經(jīng)上述兩種方法鑒定后，陽(yáng)性克隆送上海英俊生物技術(shù)有限公司測(cè)序，獲得目的重組克隆質(zhì)粒pMD 19T-P0。

1.2.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定用BamHⅠ/HindⅢ雙酶切重組克隆質(zhì)粒pMD 19T-P0和表達(dá)載體pET32a(+)。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，回收P0和pET32a(+)片段；P0片段與pET32a(+)片段在T4DNA連接酶的作用下，16℃水浴連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)菌液PCR鑒定獲得的陽(yáng)性克隆后，再用小量法抽提重組表達(dá)質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定后進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序正確的陽(yáng)性重組子命名為pET32a(+)-P0。

1.2.4 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和可溶性分析以1∶100的接種量，將轉(zhuǎn)化進(jìn)重組子pET32a（+）-P0的大腸桿菌（BL 21）接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素100 μg/mL）中，37℃搖床振蕩培養(yǎng)。OD600值達(dá)到0.5～0.6時(shí)，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，轉(zhuǎn)到30℃繼續(xù)培養(yǎng)3～6 h。

取1 mL誘導(dǎo)表達(dá)的菌液加入2 mL離心管中，12 000 r/min離心1 min，棄上清，沉淀用50 μL雙蒸水懸浮，再加入50 μL的2×SDS-PAGE上樣緩沖液混勻，沸水浴煮5 min后放置在冰上2 min。在4℃條件下，12 000 r/min離心1 min，取上清10 μL上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)—250 R染色，分析融合蛋白的表達(dá)情況。收集經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h的菌液樣品，采用超聲波破碎菌體細(xì)胞，離心后分別取1 mL上清液和沉淀按上述方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳，對(duì)融合蛋白進(jìn)行可溶性分析。

1.2.5 融合蛋白的純化擴(kuò)大培養(yǎng)重組表達(dá)菌1 L，按上述條件誘導(dǎo)表達(dá)4 h。4℃、12000 r/min離心10 min，棄上清，收集菌體沉淀。沉淀重懸于Resnsptnsion buffer溶液，超聲波破碎10 min，4℃12000 r/min離心10 min；棄上清，沉淀重懸于Isolation buffer溶液，超聲波破碎10 min，4℃12000 r/min離心10 min；重復(fù)1次上一步驟；棄上清，最后包涵體重懸于含6M尿素的Binding buffer溶液中，RT 30～60 min。將制備好的溶液過(guò)Ni2+-NTA親和層析柱，經(jīng)Washing buffer（含50 mM咪唑）溶液洗去雜蛋白，再經(jīng)咪唑終濃度為500 mM的Elution buffer溶液洗脫，最終融合蛋白溶于其中，12%SDS-PAGE電泳，分析融合蛋白純化程度。

1.2.6 抗血清制備及血清學(xué)檢測(cè)純化的融合蛋白溶液經(jīng)過(guò)透析袋透析獲得溶于1×PBS的蛋白溶液。BCA法測(cè)定其濃度，與佐劑（1∶1）混勻，采用皮下多點(diǎn)注射抗原的方法免疫2只白兔[5]，每只總注射量為1.5～2.0 mg。第三次免疫10d后，每只白兔耳緣靜脈取血0.5～1.0 mL，分離抗血清。以1×PBS的蛋白溶液作抗原，IDELISA檢測(cè)抗血清效價(jià)，血清效價(jià)未符合要求則繼續(xù)免疫。血清效價(jià)符合要求后，心臟采血，分離抗血清，以融合蛋白作為抗原測(cè)定抗血清效價(jià)。

2 結(jié)果

圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 重組質(zhì)粒pET32a-P0酶切鑒定

2.1 ScYLV-P0基因克隆和表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

用PCR方法從病樣總DNA中擴(kuò)增獲得的ScYLV-P0基因片段，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后結(jié)果見(jiàn)圖1。以照片左側(cè)分子量標(biāo)記為對(duì)照，擴(kuò)增片段大小約為771 bp，而健康植株和雙蒸水的陰性對(duì)照均未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶。表達(dá)重組質(zhì)粒pET32a-P0經(jīng)BamHⅠ/HindⅢ雙酶切驗(yàn)證，出現(xiàn)特異性DNA條帶，其大小約為771 bp（圖2），從而進(jìn)一步證明已成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-P0。

2.2 AcPmp基因的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析

在30℃，IPTG終濃度0.1 mmol/mL條件下，誘導(dǎo)表達(dá)pET32a-P0重組表達(dá)菌[E.coli BL21（DE3）]。取1 mL菌液樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析（如圖3）顯示：在約43kDa處有一明顯區(qū)別的條帶，其大小與預(yù)估的融合蛋白大小符合。剩余菌液經(jīng)細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞后，分別取上清與沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析（如圖4）。結(jié)果顯示：在此條件下誘導(dǎo)表達(dá)獲得的目的融合蛋白為包涵體蛋白。

圖3 融合蛋白Ac-PM的SDS-PAGE分析

圖4 P0融合蛋白可溶性分析

2.3 抗血清的制備和效價(jià)測(cè)定

在注射抗原蛋白到白兔前，用ID-ELISA對(duì)白兔進(jìn)行免疫前血清本底水平檢測(cè)，結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)所選用的兩只大白兔（大白兔A和大白兔B）血清本底比較低，符合實(shí)驗(yàn)要求（表1）。將純化獲得的融合蛋白作為免疫原，第一次與完全佐劑等比例混勻，第二、三次與不完全佐劑等比例混勻，采用肌肉與皮下注射相結(jié)合免疫大白兔。3次注射后采集血清，以融合蛋白溶液為抗原進(jìn)行ID-ELISA測(cè)定抗血清效價(jià)。測(cè)得該抗血清的效價(jià)為1∶25000（表2）。

表1 ID-ELISA檢測(cè)免疫前血清本底水平（OD值）

表2 不同稀釋度抗血清與蛋白的ID-ELISA結(jié)果的OD值

3 討論

利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白來(lái)獲得抗原已經(jīng)成為一項(xiàng)成熟的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。表達(dá)的外源蛋白有兩種形式，一種是可溶性的外源融合蛋白，一種是以包涵體形式存在的融合蛋白。在對(duì)兩種形式的蛋白進(jìn)一步純化時(shí)，主要區(qū)別在于包涵體需要經(jīng)過(guò)變復(fù)性處理，而可溶性蛋白則不需要[6]。

本研究獲得了甘蔗黃葉病毒P0基因序列。用原核表達(dá)載體表達(dá)P0基因的全長(zhǎng)蛋白，從而用pET32a（+）原核表達(dá)載體成功構(gòu)建了P0基因表達(dá)質(zhì)粒。但在誘導(dǎo)表達(dá)中，表達(dá)量并不是很高，并且可溶性蛋白含量相對(duì)較少，包涵體形式存在的蛋白占有不少的比例。本實(shí)驗(yàn)在低溫條件下誘導(dǎo)表達(dá)，多次誘導(dǎo)表達(dá)，將獲得的可溶性融合蛋白收集進(jìn)行純化，獲得大量可溶性蛋白，制備了專(zhuān)化性很強(qiáng)的抗血清，制備的SCYLV抗血清經(jīng)ELISA檢測(cè)，證實(shí)其具備較高的血清效價(jià)（1∶25000）和較好的特異性。為今后研發(fā)高效準(zhǔn)確的SCYLV血清學(xué)檢測(cè)試劑盒提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為甘蔗黃化病的快速檢測(cè)提供了一條較為便捷的途徑。

[1]周?chē)?guó)輝，許東林，蔡艷清，等.我國(guó)南方甘蔗病毒種類(lèi)初步鑒定[J].廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué)，2006，25（3）：226-228

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Cloning and Prokaryotic Expression of Sugarcane Yellow Leaf Virus P0 Gene and Preparation of Antiserum

ZOU You-xing,LIU Xiang-rui,WANG Hong-xing
(College of Applied Science and Technology,Hainan University,Danzhou 571737,China)

A specific primers used in RT-PCR were designed according to the sequences of SCYLV-P0 gene published.A target fragment of P0 was isolated by RT-PCR with RNA isolated from diseased leaves as template. The complete SCYLV-P0 gene was taken according to the sequence analysis.The plasmid of pET32a(+)was taken as vector bone，and the prokaryo expression plasmids named as pET32a-P0 with the target gene of P0 was constructed.The recombinant plasmids pET32a-P0 were tested by double digestion tests and sequncing,then they were transformed into competent cells of E.coli BL21(DE3)pLySs and induced by IPTG to express the target gene.The P0 fusion protein was expressed as inclusion body,the molecular weight of P0 fusion protein was about 45 kDa with two parts of 29.991 kDa according to P0 and 18 kDa according to pET32a(+).The fusion protein was then purified with Ni2+-NTA agarose affinity chromatography,and used to immune rabbits for antiserum preparation.The optimal titer of the antiserum was determined to be as 1:25000 by indirect enzyme-linked immunosorbent assay(ID-ELISA).

sugarcane yellow leaf virus;RNA silencing suppressor;prokaryotic expression;antiserum

435.661

A

1007-2624（2014）02-0001-03

10.13570/j.cnki.scc.2014.02.001

2013-09-04

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)專(zhuān)項(xiàng)（ITBB110303）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)資金（nycytx-24）。

鄒游興（1986-），男，福建省建甌市人，碩士，助教，主要從事農(nóng)作物病蟲(chóng)害防治研究。

王洪星（1982-），男，助理工程師，碩士，研究方向：分子植物病理學(xué)。E-mail：hxingw@163.com