王宏偉，鄔應龍*

（四川農(nóng)業(yè)大學食品學院，四川 雅安 625014）

RS4型抗性淀粉對高脂誘導肥胖小鼠脂質(zhì)代謝相關基因表達的影響

王宏偉，鄔應龍*

（四川農(nóng)業(yè)大學食品學院，四川 雅安 625014）

目的：觀察不同RS4型抗性淀粉對小鼠脂質(zhì)代謝及相關基因表達的影響，探討抗性淀粉干預脂質(zhì)代謝的機制。方法：選用年齡和體質(zhì)量合適的雄性C57BL/6J小鼠，分別飼喂含有羥丙基交聯(lián)、交聯(lián)酯化、檸檬酸乙?；适淼矸?種RS4型抗性淀粉和甘薯原淀粉的高脂飼料12周。12周后，測定小鼠血清指標、體質(zhì)量及觀察小鼠肝臟組織形態(tài)變化；并采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應技術檢測各組小鼠肝組織中脂肪酸合成酶（fatty acid synthese，F(xiàn)AS）、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c（sterol regulatory element binding protein-1c，SREBP-1c）、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutary coenzyme a reductase，HMGCR）的mRNA表達水平。結(jié)果：飼喂添加3種RS4型抗性淀粉的高脂飼料后，高脂誘導雄性C57BL/6J肥胖小鼠體質(zhì)量、血清甘油三酯水平明顯降低，肝細胞脂肪變性程度明顯減輕、肝臟組織中SREBP-1c mRNA表達水平明顯下調(diào)；添加檸檬酸乙酰化甘薯淀粉對FAS、SREBP-1c、HMGCR 的mRNA表達水平均有不同程度的下調(diào)。結(jié)論：檸檬酸乙?；适淼矸鄣萊S4型抗性淀粉可對高脂誘導雄性C57BL/6J肥胖小鼠的脂質(zhì)代謝起到一定的干預作用，并可下調(diào)其肝臟組織中SREBP-1c mRNA等基因的表達。

抗性淀粉；脂質(zhì)代謝； 肝臟功能；基因表達； 高脂飼料

近年來，由于飲食中過多的脂肪和體力活動的減少，肥胖和超重的現(xiàn)象急劇增加。特別是飲食中高脂肪 供給量過度增加，通過改變?nèi)撕蛧X類動物中血漿和組織中總膽固醇（total cholesterol，TC）和甘油三酯（triglyceride，TG）的水平，成為了肥胖癥、高脂血癥、心血管疾病和糖尿病的一個重要危險因素[1]。

近年來，抗性淀粉和含有抗性淀粉的食物受到了特別的注意，因為它們能像膳食纖維一樣降低心血管疾病的發(fā)生、高脂血癥、糖尿病發(fā)病率以及對腸道菌群有一定的功能和影響。RS4型抗性淀粉，相比原淀粉更不易消化，更耐酸和高溫[2]。飲食中，添加不消化的碳水化合物減少能量攝入，被認為是降低肥胖的一種可能的方法。一些化學改性淀粉相比未改性的淀粉，無論在體內(nèi)還是體外，都更不易被酶消化，被稱為RS4型抗性淀粉[3]?？剐缘矸墼隗w內(nèi)和體外能產(chǎn)生像膳食纖維一樣的生理作用[4-6]。本研究采用C57BL/6J小鼠動物實驗方法，以不同類型的RS4型抗性淀粉為研究對象，研究其對膳食引起的肥胖小鼠的血脂和肝組織形態(tài)的影響，并采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應技術（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測肝組織中脂肪酸合成酶（fatty acid synthese，F(xiàn)AS）、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（sterol regulatory element binding protein-1c，SREBP-1c）、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A 還原酶（3-hydroxy-3-methylglutary coenzyme A reductase，HMGCR）mRNA表達水平，初步探討抗性淀粉降血膽固醇的分子生物學機制，從而為以后進一步研究抗性淀粉的血脂調(diào)節(jié)作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘薯原淀粉（sweet potato starch，SPS）、羥丙基交聯(lián)甘薯淀粉（hydroxypropylated and cross-linked SPS，HPCL-SPS）、交聯(lián)酯化甘薯淀粉（cross-linking and octenyl succinic anhydride modified SPS，CLOSA-SPS）、檸檬酸乙酰化甘薯淀粉（citric acid-treated and acetylated SPS，CAAC-SPS） 本實驗室自制[7]；3種RS4型抗性淀粉定量測定參照參考文獻[8]方法。

RNAiso plus、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTM日本TaKaRa公司；瓊脂糖 上海純優(yōu)生物科技有限公司；熒光定量八連板 美國Bio-Rad公司；氯仿、異丙醇、無水乙醇（分析純）；焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水。

1.2 儀器與設備

杜邦AR全自動生化分析儀 美國Dade Behring 公司；普通PCR儀器、熒光定量PCR儀器、凝膠成像系統(tǒng)美國Bio-Rad公司；微量移液器、Centrifuge 5810R高速低溫離心機 德國Eppendorf公司；水平電泳槽、DYY-8C電泳儀 北京六一儀器廠。

1.3 實驗動物及飼養(yǎng)

1.3.1 動物來源及飼料

雄性C57BL/6J小鼠72只，體質(zhì)量（20±2）g，購自四川大學實驗動物中心（動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）-09-2006，合格證編號：0024070）飼料以AIN93為標準，稍微改動[7-8]，表1為動物實驗飼料配方表。

表1 動物實驗飼料配方表Table 1 Composition of experimental diets g/kg飼料

1.3.2 分組與飼養(yǎng)

適應性喂養(yǎng)1周后，根據(jù)體質(zhì)量將72只小鼠隨機分為6組：飼喂基礎飼料的基礎組（CL）、飼喂高脂飼料的高脂組（HF）、高脂＋羥丙基交聯(lián)甘薯淀粉組（HF-HPCL-SPS）、高脂＋交聯(lián)酯化甘薯淀粉組（HFCLOSA-SPS）、高脂＋甘薯原淀粉組（HF＋SPS）、高脂＋檸檬酸乙?；适淼矸劢M（HF-CAAC-SPS），每組12只。飼養(yǎng)小鼠自由采食、飲水，10 h/14 h白晝交替喂養(yǎng)12周。

1.4 方法

1.4.1 血清指標測定和肝組織切片

實驗結(jié)束時，眼球取血，每只小鼠的血樣分別放置在4℃靜置12 h后，4℃、3 000 r/min離心15 min，取其上清液（即血清），－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用全自動生化儀測定血清各項指標，其中動脈粥樣硬化指數(shù)（atherogenic index，AI）計算見下式。

將小鼠處死，并取肝臟，立即放入液氮保存，用來提取RNA。其中一部分肝臟固定，石蠟切片，蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosinstaining，HE）染色。

1.4.2 小鼠肝組織FAS、SREBP-1c、HMGCR mRNA相對表達量分析

依Trizol總RNA提取試劑盒提取。取30～70 mg肝臟，加入1 mL Trizol試劑，勻漿后于4℃、12 000×g離心10 min，上清液經(jīng)1/5體積氯仿抽提后，再以1/2體積異丙醇沉淀RNA，沉淀經(jīng)適量75%乙醇洗滌后晾干，溶于適量DEPC水，－80℃保存?zhèn)溆?。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明在普通PCR儀上進行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。PCR引物見表2，再以逆轉(zhuǎn)錄反應產(chǎn)物為模板，按照熒光實時定量PCR試劑盒的說明，冰上配制PCR反應體系，RT-PCR條件按說明書操作。目的基因相對表達量的分析以GAPDH基因作為內(nèi)參基因，選擇一校準樣本，比較待測樣本相對校準樣本的表達差異，利用2-ΔΔCt法進行相對定量分析。

式中：ΔΔCt=（Ct目的基因－CtGAPDH）待測樣本－（Ct目的基因－CtGAPDH）校準樣本。

表2 引物序列和退火溫度Table 2 Primer sequences, annealing temperatures and PCR amplicons

1.5 統(tǒng)計學分析

采用 SPSS19.0 統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)據(jù)均以表示。采用單因素方差分析，方差齊時組間比較采用Duncan法，方差不齊時組間比較采用DunnettsT3法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2. 1 小鼠體質(zhì)量

±s，n=12）=12Table 3 Changes in body weight in C57BL/6J mice (x表3 C57BL/6J小鼠體質(zhì)量變化（x±s, , n = 12) 12)

由表3可見，分別飼喂小鼠不同飼料12周后，發(fā)現(xiàn)高脂飼料飼喂的HF組小鼠較基礎飼料飼喂的CL組，小鼠體質(zhì)量明顯增加，有顯著差異（P＜0.05），表明肥胖模型建立成功；HF組小鼠體質(zhì)量與HF-SPS組相比沒有顯著性差異，表明添加甘薯原淀粉于高脂飼料中不能降低肥胖小鼠的體質(zhì)量。但HF-HPCL-SPS、HF-CLOSA-SPS與HF-CAAC-SPS組小鼠的體質(zhì)量均小于HF組小鼠的體質(zhì)量，并有顯著性差異（P＜0.05），表明添加3種RS4型抗性淀粉于高脂飼料中均會影響肥胖小鼠的能量攝入，可以使肥胖小鼠體質(zhì)量變輕。3種變性淀粉之間相比，小鼠體質(zhì)量沒有顯著性差異。

2.2 血清指標

表4 飼喂RS4型抗性淀粉小鼠血脂水平（x±s，n=12）Table 4 Effect of RS4 starch on serum lipid levels in rats fed on experimental diettss ((x ±s,n = 12)

由表4可知，與CL組相比，HF組TC含量、TG含量有顯著升高（P＜0.05），表明高脂血癥模型建立成功。與HF組比較，HF-SPS組及各RS4型抗性淀粉組（HF-CLOSA-SPS、HF-CAAC-SPS、HF-HPCLSPS組）TC含量沒有顯著性差異，TG含量則顯著降低（P＜0.05）。各RS4型抗性淀粉組之間TG含量沒有顯著性差異，但與HF-SPS組相比有顯著性差異（P＜0.05）。與CL組相比，HF組高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）含量有所提高，但沒有顯著性差異，各淀粉組之間也幾乎沒有變化，差異不顯著；HFCLOSA-SPS、HF-CAAC-SPS、HF-HPCL-SPS組HDL-C含量與HF組相比也沒有顯著性差異。低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）含量，實驗各組之間幾乎沒有變化，無顯著性差異。極低密度脂蛋白膽固醇（very low density lipoprotein-cholesterol，VLDL）HF組與CL組有顯著性差異（P＜0.05），各淀粉組與HF組相比顯著降低（P＜0.05）。AI是心血管疾病的一個危險系數(shù)，與HF組相比，抗性淀粉組的系數(shù)都有降低，但沒有顯著性差異。通過這些血脂指標可以表明，抗性淀粉可能對脂代謝紊亂的小鼠有一定的影響。

2.3 抗性淀粉對小鼠肝組織形態(tài)的影響

圖1 C57BL/6J小鼠肝組織形態(tài)變化（×40000）Fig.1 Morphological changes in liver tissue of C57BL/6J mice (× 400)

光鏡下觀察CL組小鼠的肝臟組織結(jié)構(gòu)較完整（圖1A），細胞索以中央靜脈為中心向四周呈放射狀，肝細胞索排列整齊，肝竇清晰，肝細胞形態(tài)大小正常，細胞質(zhì)豐富，核仁明顯，單核或雙核，細胞界限清楚，未見肝細胞內(nèi)出現(xiàn)脂滴。HF組肥胖小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝細胞索排列紊亂，呈點、片狀壞死，肝細胞內(nèi)出現(xiàn)大量的大小不等、數(shù)量不一的圓形脂肪空泡，并有融合的現(xiàn)象，細胞核被擠向周邊或消失，肝細胞呈彌漫性脂變性（圖1B）。HF-SPS組肥胖小鼠肝組織形態(tài)類似HF組（圖1C）。各RS4型抗性淀粉組肥胖小鼠肝細胞內(nèi)也出現(xiàn)一定程度的脂肪變性，但與HF組相比，肝小葉內(nèi)脂肪變性細胞數(shù)量少，變性程度減輕，肝細胞內(nèi)脂滴空泡明顯減小， 肝細胞索排列較高脂模型組整齊（圖1D～F）。表明抗性淀粉的介入，可以防止肝組織變性程度的增加，減少肝細胞內(nèi)脂滴，使肝細胞索排列整齊，肝小葉細胞結(jié)構(gòu)趨于正常。

2.4 抗性淀粉對小鼠肝臟脂質(zhì)代謝相關基因表達水平的影響

2.4.1 F AS mRNA的表達

由圖2可見，與HF組小鼠相比，HF-CAAC-SPS組、HFHPCL-SPS組肝臟FAS表達水平有顯著的差異（P＜0.05）；與HF組小鼠相比，HF-CLOSA-SPS組、HF-SPS組肝臟FAS mRNA表達水平差異不顯著。

圖2 肝臟FAS mRNA表達水平比較（x±s，n=6）Fig.2 The mRNA expression levels of hepatic FAS (x ±s,, n = 6)

2.4.2 SREBP-1c mRNA的表達

圖3 肝臟SREBP-1c mRNA表達水平比較（x±s，n=6）Fig.3 The mRNA expression levels of hepatic SREBP-1c (x ±s,, n = 6)

由圖3可見，與HF組小鼠相比，HF-CAAC-SPS組、HF-HPCL-SPS組、HF-CLOSA-SPS組肝臟SREBP-1c mRNA表達水平有顯著差異；與HF組小鼠相比，HF-SPS組肝臟SREBP-1c mRNA表達水平差異不顯著。

2.4.3 HMGCR mRNA的表達

圖4 肝臟HMGCR mRNA表達水平比較（x±s，n=6）Fig.4 The expression levels of hepatic HMGCR mRNA (x±s, n = 6)

由圖4可見，與HF組小鼠相比，HF-CLOSA-SPS組、HF-CAAC-SPS組肝臟HMGCR mRNA表達水平有顯著的差異（P＜0.05）；HF-HPCL-SPS組、HF-SPS組肝臟HMGCR mRNA表達水平差異不顯著。

總之，與HF組小鼠相比，CLOSA-SPS對肝臟FAS mRNA表達水平、HPCL-SPS對肝臟HMGCR mRNA表達水平?jīng)]有明顯影響，SPS對肝臟FAS、SREBP-1c、HMGCR的mRNA表達水平均沒有明顯影響。但是，CAAC-SPS對肝臟組織中3個脂質(zhì)代謝相關基因FAS、SREBP-1c、HMGCR的mRNA表達水平均有不同程度的下調(diào)；各RS4型抗性淀粉對REBP-1c的mRNA表達水平均有明顯的下調(diào)。

3 討 論

本研究探討了RS4 型抗性淀粉是否會影響高脂膳食飼喂小鼠的體質(zhì)量、血清指標及脂代謝相關基因的表達。高脂膳食飼喂的雄性C57BL/6J肥胖小鼠在飼料中添加RS4型抗性淀粉后，均有不同程度的體質(zhì)量減輕、肝細胞脂肪變性程度明顯減輕現(xiàn)象，血清TG也有所降低，但是各RS4型抗性淀粉組之間沒有明顯的差異；各RS4型抗性淀粉對肝臟組織中3種脂質(zhì)代謝相關基因的表達也有一定影響，盡管存在CLOSA-SPS對FAS mRNA表達影響不明顯、HPCL-SPS對HMGCR mRNA表達影響不明顯的情況，但是，CAAC-SPS對3個脂質(zhì)代謝相關基因FAS、SREBP-1c、HMGCR mRNA表達水平均有不同程度的下調(diào)，各RS4型抗性淀粉對REBP-1c mRNA表達水平均有明顯的下調(diào)。這可能是不同抗性淀粉種類對C57BL/6J肥胖小鼠脂質(zhì)代謝相關基因的調(diào)控存在差異所致[1-2]。

脂質(zhì)代謝為三大物質(zhì)代謝之一，其信號轉(zhuǎn)導途徑具有復雜而精細的調(diào)控網(wǎng)絡，它主要參與了機體的能量供應及貯存，生物膜的構(gòu)成以及其他一些重要的生命過程。脂代謝信號轉(zhuǎn)導途徑主要有：過氧化物酶體增殖物激活受體信號轉(zhuǎn)導途徑、肝X受體信號轉(zhuǎn)導途徑、SREBPs信號轉(zhuǎn)導途徑等[9]。SREBPs、SREBP-1c主要調(diào)控與TG合成有關的基因表達，如脂肪酸合成酶、乙酰CoA合成酶等，是脂肪合成相關基因的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。高脂飲食誘使小鼠肝臟發(fā)生了成脂性改變，促進脂肪變性的肝細胞向脂肪細胞分化，使之具有脂肪細胞的部分功能，可能造成肝細胞中SREBP-1c的過度表達。應用轉(zhuǎn)基因方法使小鼠肝臟SREBP-1c表達增強，可通過誘導其靶基因，如乙酰輔酶A羧化酶、FAS等的表達而促進肝臟合成脂質(zhì)[10]。本研究中，HF組小鼠由于高脂飲食的誘導，可能造成肝細胞中SREBP-1c的過度表達，飼喂添加CLOSA-SPS、CAAC-SPS、HPCL-SPS的各組中，SREBP-1c表達水平都有明顯的下調(diào)，但是各組之間沒有顯著性差異，HF-SPS組與HF組之間相比，表達有所下調(diào)，沒有顯著性差異；HF組中FAS表達較CL組有明顯升高，有顯著性差異，HF-SPS組與HF相比，F(xiàn)AS表達降低，但沒有顯著性差異，添加CAAC-SPS、HPCL-SPS組的FAS表達水平較HF組有顯著性下調(diào)?？赡苁怯捎诘矸鄣南詴绊懜闻K葡萄糖的代謝及TC和TG的吸收，從而影響SREBP-1c的表達，誘導FAS的表達下調(diào)。Goda等[11]研究表明高直鏈玉米比低直鏈玉米更難消化和吸收，降低血糖的反應，結(jié)果使脂肪組織和肝臟脂質(zhì)合成減少。Kim等[12]也報道了小鼠攝食高抗性淀粉水平的玉米淀粉，可以降低其肝臟中TC和TG水平，表明抗性淀粉的降血脂作用可能是通過干擾腸道膽固醇和膽汁酸的吸收而對其造成影響。Liu Xiong等[13]研究表明，抗性淀粉可以降低小鼠血清中的TG水平，小鼠飼喂含有抗性淀粉的飼料可能降低肝臟中脂肪生成和VLDL的分泌，導致血漿中TG的減少。由于血漿中TG的量受到從小腸中吸收的TG控制，因此抗性淀粉的難消化性使TG的吸收變慢，結(jié)果可能導致飼喂抗性淀粉飼料的小鼠血清中TG的降低。Tsuda等[14]研究中，紫玉米色素能下調(diào)肝臟中SREBP-1c的表達水平，進而可能調(diào)節(jié)其成熟形式的釋放導致FAS mRNA水平的下降。Ide等[15]研究表明，含有芝麻素的飲食能通過減少SREBP-1 mRNA水平而降低脂肪生成酶的基因表達水平。

HMGCR作為膽固醇合成的限速酶參與膽固醇代謝，對于維持細胞膽固醇動態(tài)平衡起著重要的作用。而且，它受著多種因素的調(diào)節(jié)，尤其是SREBPs對它的調(diào)節(jié)，使它在膽固醇代謝和脂肪代謝方面有著不可忽視的作用[16]。Hara等[17]已經(jīng)報道稱飼喂膳食纖維血清膽固醇降低可能是由于盲腸內(nèi)容物產(chǎn)生的有機酸對其肝臟中膽固醇合成抑制造成的。肝臟膽固醇的變化不僅受到內(nèi)源性合成的變化，還受到飲食中膽固醇的吸收及通過肝細胞加強膽固醇攝入的影響。Udagawa等[18]研究表明，小鼠飼喂添加高溫高濕玉米淀粉和玉米淀粉的高膽固醇/高動物油的膳食，其中HMGCR表達水平無顯著性差別，而且肝臟膽固醇合成的增加與高溫高濕玉米淀粉攝入后對血清和肝臟膽固醇提高的影響無關。Vanhoof等[19]報道稱在喂養(yǎng)1%膽固醇和0.1%膽鹽的膳食中加抗性淀粉能降低血清膽固醇含量。Udagawa等[20]報道稱外源性膽固醇的攝入會抑制其內(nèi)源性膽固醇合成，影響肝臟中膽固醇的合成。Jones等[21]研究表明，餐后胰島素水平的減少可以降低膽固醇的合成，因為胰島素能增加HMGCR的活性[22]，餐后胰島素水平的減少導致HMGCR還原酶活性的降低，抑制膽固醇合成。本研究中并未添加膽固醇和膽鹽，而且抗性淀粉變性方法不同，使用的原料也不相同，盡管血清膽固醇基本沒有變化，但是HMGCR基因表達水平可能會降低。

本研究中，RS4抗性淀粉的攝入，降低了C57BL/6J小鼠的體質(zhì)量，同時也影響了肝臟中脂質(zhì)合成相關基因的表達水平。這些發(fā)現(xiàn)可能對抗性淀粉對脂質(zhì)代謝的影響機制研究提供線索，對于以后進一步研究抗性淀粉的減肥作用提供一定的參考。

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Effect of RS4-Type Resistant Starch on the Expression of Lipid Metabolism-Related Genes in Mice with High-Fat Diet-Induced Obesity

WANG Hong-wei, WU Ying-long*
(College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

Objective：To investigate the effect of different RS4-type resistant starches on the mRNA expression of lipid metabolism-related genes in mice with high-fat (HF) diet-induced obesity and to elucidate the underlying mechanism. Methods: Weight- and age-matched male C57BL/6J mice were fed for 12 weeks on a high-fat diet containing unmodified sweet potato starch (SPS), hydroxypropylated and cross-linked starch (HPCL), cross-linking and octenyl succinic anhydride modified starch (CLOSA), citric acid-treated and acetylated starch (CAAC), respectively. After the feeding period, serum lipid levels, body weight and morphological changes of liver tissue in mice were examined. Meanwhile, the mRNA expression levels of fatty acid synthese (FAS), sterol regulatory element binding protein-1c (SREBP-1), 3-hydroxy-3-methylglutary coenzyme A reductase (HMGCR) were examined. Results: The mice fed on the RS4 diet had significantly lower body weight. The expression level of SREBP-1c mRNA was significantly lower than in those fed on either unmodified starch or the HF diet. The levels of serum triglyceride and the mRNA expression levels of FAS and HMGCR were also reduced in mice fed on the RS4 diet. Conclusion: Owing to the alteration of the expression of related genes, the mice fed on the RS4 diet had a significantly lower hepatic lipogenesis capacity in those with HF diet-induced obesity. In conclusion, dietary supplementation with RS4-type resistant starch attenuates high fat diet-induced obesity effectively, which may be attributable to the decreased lipogenesis in the liver.

resistant starch; lipid metabolism; hepatic function; gene expression; high-fat diet

TS231

A

1002-6630（2014）05-0193-06

10.75 06/spkx1002-6630-201405038

2013-01-09

四川省科技支撐計劃項目（2009NZ0077-007）；四川農(nóng)業(yè)大學“211”工程雙支計劃項目（2010）

王宏偉（1988—），男，碩士研究生，研究方向為功能性食品。E-mail：717053312@qq.com

*通信作者：鄔應龍（1963—），男，教授，博士，研究方向為功能性食品。E-mail：wuyinglong99@163.com