王 茝

山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，山西太原 030001

隨著經(jīng)濟(jì)、社會、及交通等各方面的發(fā)展，腦損傷的發(fā)生率呈不斷上升趨勢，腦損傷也成為國內(nèi)外法醫(yī)學(xué)研究的主要死因之一。內(nèi)皮素（Endothelin）是上世紀(jì)80年代由日本學(xué)者Yanagisaw等[1]從豬主動脈內(nèi)皮細(xì)胞分離出的一種活性肽，是迄今研究人體內(nèi)最強(qiáng)的縮血管物質(zhì)之一。ET-1是內(nèi)皮素家族中含量最多而且功能最主要的一種。本實(shí)驗(yàn)參照Feeney's法建立大鼠腦損傷模型，應(yīng)用酶聯(lián)免疫法檢測大鼠腦損傷后不同時(shí)間點(diǎn)ET-1的表達(dá)規(guī)律。為法醫(yī)學(xué)腦損傷的推斷及研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

2013年11月—12月，選取健康成年SD大鼠40只，雌雄不限，體重250g～300g,隨機(jī)分為正常組，假損傷對照組和腦損傷組1h、6h、24h、48h、3d、7d 共 8 組，每組 5 只。

1.2 動物模型制備

參照Feeney's法[2]建立大鼠腦損傷模型，大鼠稱重后，以10%水合氯醛進(jìn)行腹腔麻醉，采取俯臥位固定于打擊臺上，將大鼠頂枕部常規(guī)消毒備皮，于正中線處將頭皮切約4 cm切口，剝離骨膜，以人字縫前3 mm，顱骨正中線旁3 mm處用骨鉆鉆一直徑約為5 mm的圓形骨窗，使硬腦膜充分暴露，并保持完好，自制一打擊墊放入骨窗，模擬自由落體打擊裝置，以50 g砝碼沿導(dǎo)管于40 cm高處落下打擊骨窗處，觀察片刻后以骨臘封閉骨窗，縫合頭皮。正常組不做任何處理，對照組SD大鼠僅做鉆孔處理，不做自由落體打擊，不致腦損傷。遂將大鼠置于室內(nèi)安靜、清潔的鼠籠中進(jìn)行正常飼養(yǎng)，然后依據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)損傷時(shí)間點(diǎn)取材。

1.3 ET-1的測定

腦損傷組按損傷時(shí)間后 1h、6h、24h、48h、3d及 7d時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行10%水合氯醛麻醉，采血4 mL,將4 mL血液標(biāo)本加入10%EDTA 60 uL和 80 uL抑肽酶,混合20 min后，3000轉(zhuǎn)/分離心 20 min，分離血漿后，嚴(yán)格按照（ET-1）ELISA試劑盒說明書操作，測血漿內(nèi)皮素-1含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本實(shí)驗(yàn)全部數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件處理分析，計(jì)量數(shù)據(jù)結(jié)果描述均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

腦損傷組大鼠血漿ET-1含量在損傷后1h與假損傷對照組相比明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其在損傷后24h內(nèi)呈持續(xù)升高狀態(tài)。24h血漿ET-1含量水平達(dá)到高峰，隨后逐漸下降，3d時(shí)仍高于對照組，并且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）.至7d時(shí)，血漿ET-1含量趨于正常組，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

表1 ELISA法測定正常組，假損傷對照組及損傷后不同時(shí)間的血漿ET-1 含量（±s）The ET-1 level in plasma between each groups by ELISA

表1 ELISA法測定正常組，假損傷對照組及損傷后不同時(shí)間的血漿ET-1 含量（±s）The ET-1 level in plasma between each groups by ELISA

注：與對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，*P<0.05。

組別（n=5） 血漿 ET-1（pg/mL）正常組假損傷對照組損傷后1h組損傷后6h組損傷后24h組損傷后48h組損傷后3d組損傷后7d組40.16±1.47 46.24±2.93 65.68±3.02*80.49±8.26*102.29±15.82*68.46±10.24*56.63±5.48*43.22±2.05

3 討論

ET是由21種氨基酸組成的活性肽物質(zhì)，是目前已知體內(nèi)最強(qiáng)的縮血管物質(zhì)。ET-1是唯一存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)皮素。ET-1是內(nèi)皮素家族中含量最多而且功能最主要的一種。目前，還沒有研究發(fā)現(xiàn)在生理?xiàng)l件下內(nèi)皮細(xì)胞可以釋放ET，但在化學(xué)或是機(jī)械刺激下對ET的合成有誘導(dǎo)作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大鼠于腦損傷1h后ET-1表達(dá)即明顯增強(qiáng)，24h達(dá)到高峰，48h開始下降，提示ET-1參與了顱腦損傷的過程。顱腦損傷后ET-1含量增高的機(jī)制尚不完全明確，其原因可能有：①腦損傷后引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，使腎上腺素分泌增加，誘導(dǎo)ET-1的合成[3]。②腦損傷后血管內(nèi)皮受損，刺激血小板粘附，血栓形成，紅細(xì)胞破壞釋放出氧合血紅蛋白，可刺激血管內(nèi)皮產(chǎn)生ET-1[4]。③腦損傷后，引發(fā)腦水腫，顱內(nèi)壓升高，腦組織血流灌注量降低，腦缺血，缺氧狀態(tài)下可誘發(fā)血管內(nèi)皮釋放ET-1[5]。④中樞神經(jīng)系統(tǒng)應(yīng)激反應(yīng)，內(nèi)包括內(nèi)皮細(xì)胞，神經(jīng)元，膠質(zhì)細(xì)胞等釋放ET-1。⑤腦損傷后，局部缺血，或是出血，凝血酶增加，也可導(dǎo)致ET-1的釋放。⑥機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)下，交感神經(jīng)興奮使腎上腺皮質(zhì)激素分泌增加刺激外周血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放ET-1。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與段國賢等[6]研究內(nèi)皮素-1在大鼠彌漫性腦損傷時(shí)的改變結(jié)果有所差異，其模型鼠傷后3h血漿ET-1含量增加，6h達(dá)高峰，24h開始下降。差異的存在可能與實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的選取、損傷方式的不同及損傷程度有關(guān)。

近年來，有關(guān)ET-1的研究有很多，但ET-1與損傷時(shí)間之間的關(guān)聯(lián)性研究卻鮮有涉及，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著損傷時(shí)間的不同，ET-1含量的表達(dá)程度不同，表明血漿ET-1的表達(dá)與損傷時(shí)間有一定關(guān)聯(lián)性。為法醫(yī)實(shí)踐工作中損傷時(shí)間的推斷提供了參考依據(jù)。但由于動物實(shí)驗(yàn)存在多種不可抗拒因素和樣本的局限性，統(tǒng)計(jì)學(xué)上可能存在誤差。所以與實(shí)際運(yùn)用還存在著差距。在今后的研究中，應(yīng)結(jié)合臨床，以及腦損傷程度的分級來加以研究，總之，血漿ET-1用于法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，還有待進(jìn)一步的探索和研究。

[1]Yanagisawa M，Kurihara H，Kimura S，et al.A novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cell[J].Nature，1988,332:411-415.

[2]Feeney DM,Boyeson MG,Linn RT,et al.Responses to cortical injury Methodology and local effect of contusions in the rat[J].Brain Res,1981,211:67-77.

[3]Miyauchi T,Yanagisawa M,Tomizawa T，et al.Increased plasma concentrations of ET-1 and big ET-1 in acute myocardial plasma infarction[J].Lancet，1989（2）:53-54.

[4]陶進(jìn),李真保,許安定.血漿內(nèi)皮素的變化與顱腦損傷程度及預(yù)后關(guān)系[J].急診醫(yī)學(xué)，2009,9(2):101-102.

[5]Highsmith RF,Pang DC,Rappoport RM,et al.Endothelia cell-derived vasoconstrictors,mechanism of action in vascular smooth muscle.[J].Cardiovasc Pharmacol，1989，13(5):36-44.

[6]段國賢，周開順.內(nèi)皮素-1在大鼠彌漫性腦損傷時(shí)的改變和意義.[J]臨床神經(jīng)病學(xué)雜志，2003，16(3):179-180.