許 琴 林素香 鄭水華

珠海第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東珠海 519000

呼吸道合胞病毒是嬰幼兒呼吸道嚴(yán)重感染的最重要的病毒病原之一，流行面廣、發(fā)病率高[1-2]。目前尚無特異預(yù)防措施，RSV感染及其預(yù)后是嚴(yán)重的公共健康問題?；鶎俞t(yī)院迫切需要一種快速、可靠、易推廣的RSV早期診斷方法。本研究選擇50例PCR-熒光探針和臨床確診的RSV感染患兒鼻咽分泌物，分別用雙抗體夾心ELISA、直接免疫熒光法(DFA)、免疫層析金標(biāo)法（ICA）、橋聯(lián)酶標(biāo)法(APAAP)檢測呼吸道RSV抗原，為基層醫(yī)院篩選快速、準(zhǔn)確、方便的檢測方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2014年3-4月珠海第二人民醫(yī)院住院患兒50例 （男28、女 22 例）,年齡（0～12 歲），經(jīng) PCR-熒光探針和臨床確診的RSV感染患兒的鼻咽分泌物。

1.2 試劑與儀器

D3UltraTMDFA試劑盒(Quidel)、雙抗體ELISA試劑盒（北京科斯塔）、單克隆抗體橋聯(lián)酶標(biāo)診斷試劑盒（上海瑞齊）、RSV金標(biāo)免疫法（深圳賽爾）、熒光顯微鏡（Olympus）。

1.3 方法

1.3.1 DFA法檢測RSV病毒抗原 患兒鼻咽分泌物1 mL，加PBS，吸管吹打，2000rpm離心棄上清、吸取細(xì)胞懸液25 μL，點(diǎn)于帶孔玻片丙酮固定。滴加熒光標(biāo)記的抗體37℃30 min，洗片后封片，熒光顯微鏡觀察。

1.3.2 金標(biāo)法ICA法 向反應(yīng)板標(biāo)本孔滴加標(biāo)本,15 min后觀察反應(yīng)板孔中C端和T端有無紅色圓斑。

1.3.3 雙抗體夾心ELISA法 取試劑盒包被板每孔滴加稀釋液和標(biāo)本,陰陽對照孔分別加入陰、陽對照液，置37℃40min，洗滌甩干加酶標(biāo)記物,置37℃20 min,洗滌甩干加底物液。酶標(biāo)儀450nm波長比色,空白孔調(diào)零，標(biāo)本OD值與陰性對照孔OD值比值≥2.1為陽性。

1.3.4 堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶橋聯(lián)酶標(biāo)法 (APAAP)樣本加PBS吹打離心棄上清，細(xì)胞懸液加封閉液后沖洗；加一抗后沖洗；加二抗后沖洗；加底物液5g/L甲基綠負(fù)染沖洗，普通光學(xué)鏡下(10×40)鏡檢。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 10.0軟件,對計(jì)數(shù)資料進(jìn)行χ2檢驗(yàn),比較各方法間陽性率的差別。

2 結(jié)果

DFA法：熒光顯微鏡下細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)黃綠色熒光為陽性，未發(fā)生抗原抗體特異性反應(yīng)的細(xì)胞，被Evans藍(lán)染成紅色。放大200倍時，在視野中找到≥2個陽性細(xì)胞，判為標(biāo)本陽性，50例標(biāo)本中44為陽性，RSV陽性檢出率為88%。ICA法：反應(yīng)板孔C端和T端均出現(xiàn)紅色圓斑為RSV陽性，反應(yīng)板孔C端出現(xiàn)紅色圓斑，T端不出現(xiàn)紅色圓斑為RSV陰性,反應(yīng)板孔C端或C端、T端均不出現(xiàn)紅色圓斑為失效，50例標(biāo)本中42為陽性，陽性率84%。雙抗體夾心ELISA法：50例鼻咽分泌物陽性20例，陽性率40%。APAAP法：普通光學(xué)顯微鏡下，RSV感染的鼻咽分泌物纖毛柱狀上皮細(xì)胞胞質(zhì)和膜可特異地染成玫瑰紅色，核呈淡藍(lán)色或無色，≥3個以上典型著色細(xì)胞判為陽性，50例標(biāo)本中40為陽性，陽性率80%。見表1。

表1 四種快速檢測RSV陽性率(%)比較

3 討論

呼吸道合胞病毒是引起嬰幼兒下呼吸道感染最常見的病毒,這種病毒性肺炎也是嬰兒猝死的病因之一[3-4]。目前臨床常用檢測RSV感染的方法有分離培養(yǎng)鑒定、間接熒光免疫法、直接熒光免疫法、橋聯(lián)酶標(biāo)免疫法、核酸檢測、ELISA法。病毒分離培養(yǎng)雖是金標(biāo)法，但費(fèi)時、實(shí)驗(yàn)要求及成本高，不易獲得成功，不適合臨床早期診斷和應(yīng)急診斷需要。核酸雜交、RT-PCR技術(shù)檢測RSA感染，敏感性、特異性高，能進(jìn)行微量檢測及RSA分型（A、B亞型），但實(shí)驗(yàn)條件要求嚴(yán)格，成本高，難以在基層醫(yī)院普及。故本研究用DFA、ICA、APAAP、雙抗體夾心ELISA四種方法檢測RSV抗原，以篩選快速、準(zhǔn)確、方便的適合基層醫(yī)院檢測方法。

標(biāo)本選自2014年3—4月確診RSV感染小兒鼻咽分泌物。DFA、ICA、APAAP、雙抗體夾心ELISA四種方法檢測出的RSV陽性率依次為 88%(44/50)、82%(42/50)、80%(40/50)、40%(20/50)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，前3種方法,無顯著差異;雙抗體夾心ELISA法與前三種方法相比，RSV陽性檢出率明顯低于其它三種檢驗(yàn)方法,差異有顯著性。RSV成熟時,RSV病毒大部分在細(xì)胞內(nèi)[5]。雙抗體夾心ELISA法檢測的是細(xì)胞外的病毒蛋白,當(dāng)濃度低于ELISA法檢測蛋白靈敏度的下限時檢測不到病毒蛋白；另感染RSV后,需要一定的時間才能產(chǎn)生RSV-Ag,且RSV-Ag效價低也直接影響檢測，因此該方法易造成陽性樣本漏檢。Koetz報(bào)道,ELISA檢測RSV病毒其靈敏度不如免疫熒光技術(shù)，與本研究結(jié)果相符。ELISA法雖然易掌握，快速，但陽性率低，不適合臨床應(yīng)用。DFA法檢測的是細(xì)胞內(nèi)的病毒蛋白,故病毒蛋白的質(zhì)量濃度相對較高,此外DFA靈敏度高，能檢出病毒的最低濃度為1.0PFU，陽性檢出率88%為四種方法中最高。與其它三種方法相比，直接免疫熒光法靈敏度、特異性高[6]、操作簡便，更符合基層醫(yī)院的快速、簡單、準(zhǔn)確的診斷要求。國外對呼吸道病毒的檢測大多采用DFA檢測[7]。金標(biāo)ICA法陽性率為84%，與DFA法相比，兩種檢測方法靈敏度無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,與文獻(xiàn)報(bào)道一致[8]。金標(biāo)法操作簡便快速,30min可出結(jié)果,不需要貴重儀器,故金標(biāo)法可作為基層醫(yī)院門診篩查。APAAP法在普通光學(xué)顯微鏡下可辨認(rèn)，基層APAAP可開展,但與DFA相比，操作步驟多，易出現(xiàn)非特異性著色，時間長（3～4 h）。

綜上所述，ELISA靈敏性、操作性最差，不適合臨床推廣使用；APAAP法步驟多，耗時長，不宜推廣；金標(biāo)法靈敏度較高，可作為基層醫(yī)院門診篩查；直接免疫熒光法簡單、快速、敏感度和特異性高，是基層醫(yī)院RSV感染早期診斷的優(yōu)選方法，適合基層醫(yī)院推廣應(yīng)用。

[1]Robinson J.Preventingres piratorysyncy tialvirusinfections[J].Paediatr Childealth,2011,16(8):487-490.

[2]GernJE,PappasT,VisnessCM.Comparison of th eetiology of viral respiratory illnesses ininner cityand Suburban infants[J].Infect Dis,2012,206(9):1342-1349.

[3]程可萍,胡源,郎平,等.新生兒呼吸合胞病毒下呼吸道感染臨床分析[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2011,21(18):3823-3825.

[4]祝查,華子瑜.新生兒呼吸道合胞病毒肺炎182例臨床及流行病學(xué)特點(diǎn)[J].實(shí)用兒科臨床雜志,2011,26(22):1719-1721.

[5]ZhengX，Quianzon S，MuY，et a1.Comparison oftwo new rapid antigen detection assays for respiratory syncytial viru s with another assay and vial culture[J].J wrol，2004，31(2)：130-133.

[6]俞小衛(wèi),王亞楠,程寶金，等.直接免疫熒光法病毒抗原測定在呼吸道感染性疾病診斷中的應(yīng)用[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2013,28(1):76-79.

[7]Sadeghi CD,Aebi C,Gorgievski-Hrisoho M,et a1.Twelve years detection of respiratory viruses by immunofluorescence in hospitalised children:impact of the introduction of a new respiratory picornavirus assay[J].BMC Infect Dis，2011（7）:11，41.

[8]郭虹，金正江，胡興文.金標(biāo)法和直接兔疫熒光法檢測呼吸道合胞病毒的比較[J].現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2013,3（28）:51-52.