周 康，魏 君，蔣翠蓮，韓新鋒，劉書亮

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014）

乳酸乳球菌SQ117在不同溫度和pH值條件下的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)

周 康，魏 君，蔣翠蓮，韓新鋒，劉書亮

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014）

本實(shí)驗(yàn)針對(duì)發(fā)酵乳制品中分離鑒定得到的乳酸乳球菌SQ117，在不同的溫度和pH值條件下進(jìn)行其生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的研究，采用以Baranyi模型為基礎(chǔ)在線軟件DMFit建立了一級(jí)模型，采用Ratkowsky模型建立了二級(jí)模型，最后對(duì)模型進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明：DMFit在線軟件能很好的擬合實(shí)驗(yàn)所得的生長(zhǎng)曲線，是一種簡(jiǎn)單可靠的模型軟件，通過(guò)一級(jí)模型獲得的生長(zhǎng)參數(shù)在二級(jí)模型的建立和驗(yàn)證中也具有很好的擬合屬性。此外，將預(yù)測(cè)微生物學(xué)的理論應(yīng)用于以乳酸乳球菌為代表的益生菌，還可以很好地描述其生長(zhǎng)。

預(yù)測(cè)微生物學(xué)；DMFit在線軟件；溫度；pH值；乳酸乳球菌

乳酸菌通常被認(rèn)為是一類有益于人類健康的重要微生物，它的菌體和代謝產(chǎn)物都具有益生作用[1-2]。因而，含有乳酸菌的益生菌產(chǎn)品在食品工業(yè)、飼料生產(chǎn)和臨床醫(yī)學(xué)上都有著廣泛的應(yīng)用[3-4]。

結(jié)合預(yù)測(cè)微生物學(xué)對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)進(jìn)行研究，在國(guó)內(nèi)還處于起步階段，在已有的研究報(bào)道中，利用預(yù)測(cè)微生物模型的方法對(duì)乳酸菌進(jìn)行的研究主要是將其視為腐敗菌[5-6]或研究其致死模型[7]，而將其視為益生菌對(duì)于其生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型的研究還未見報(bào)道。而在國(guó)外，已有很多采用預(yù)測(cè)微生物學(xué)的方式對(duì)乳酸菌發(fā)酵特性進(jìn)行研究的報(bào)道，一般都通過(guò)預(yù)測(cè)微生物學(xué)中常見的一級(jí)模型研究其生長(zhǎng)特性和代謝特性[8-9]，進(jìn)而采用二級(jí)模型研究環(huán)境因素對(duì)于其生長(zhǎng)和代謝的影響[10]，從而達(dá)到模型化和定量化研究益生菌生長(zhǎng)和代謝的目的。因此，通過(guò)微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的方法對(duì)乳酸菌，尤其是一些益生菌進(jìn)行研究，不僅在理論研究方面十分必要，在實(shí)際的應(yīng)用中也具有很強(qiáng)的指導(dǎo)價(jià)值[11]。

本研究以從四川發(fā)酵乳制品中分離鑒定得到的乳酸乳球菌SQ117為研究對(duì)象，采用以Baranyi模型為基礎(chǔ)的在線軟件DMFit網(wǎng)頁(yè)版對(duì)該菌在不同溫度和pH值條件下的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，同時(shí)對(duì)所建立的二級(jí)模型進(jìn)行驗(yàn)證。為預(yù)測(cè)微生物學(xué)的研究范圍提出了新的思路，也為乳酸乳球菌發(fā)酵特性研究提供了新的方法。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

菌株SQ117分離自四川本地的發(fā)酵乳制品，經(jīng)生理生化鑒定及分子鑒定為乳酸乳球菌，本實(shí)驗(yàn)室保藏。經(jīng)37℃活化3次后用于生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)。

選用乳酸菌（De Man，Rogosa and Sharpe，MRS）培養(yǎng)基作為微生物生長(zhǎng)培養(yǎng)基（g/100 mL）：葡萄糖2、蛋白胨1、牛肉膏1、酵母膏0.5、磷酸氫二鉀0.2、乙酸鈉0.5、檸檬酸氫二銨0.2、硫酸鎂0.058、硫酸錳0.025、吐溫-80 0.1%，pH 6.5。

1.2 方法

1.2.1 生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線測(cè)定

將活化好的菌株以1%的接種量接種于MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，選擇適當(dāng)時(shí)間取樣測(cè)定其生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線。每次實(shí)驗(yàn)取3個(gè)稀釋梯度以平板計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)，每個(gè)稀釋梯度3個(gè)平行。

實(shí)驗(yàn)所選溫度為10、20、30、37 ℃和42 ℃。pH值為2.5、3、4、5和6.2。

1.2.2 模型的建立

1.2.2.1 一級(jí)模型的建立

采用以Baranyi模型[12]為基礎(chǔ)的在線軟件DMFit[13]對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，該軟件基于網(wǎng)頁(yè)，將復(fù)雜的數(shù)學(xué)建模通過(guò)后臺(tái)運(yùn)算完成，并對(duì)用戶所提供的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合回歸，進(jìn)而獲得所需的一級(jí)模型參數(shù)。

1.2.2.2 二級(jí)模型的建立

采用Ratkowsky模型對(duì)不同溫度（式（1））和pH值（式（2））條件下所獲得的一級(jí)模型參數(shù)，最大生長(zhǎng)速率（μmax）和延滯期（λ）進(jìn)行二級(jí)模型的建立。采用Excel中的規(guī)劃求解進(jìn)行二級(jí)模型的建立。

式中：k為μmax/h-1或1/λ/h-1；a、b、c為模型參數(shù)；Tmin和Tmax為預(yù)測(cè)的最小溫度和最大溫度/℃；pHmin為預(yù)測(cè)的最小pH值。

將一級(jí)模型求得的μmax、λ和對(duì)應(yīng)的溫度及pH值變量代入上式中，擬合出模型參數(shù)a、b、c、Tmin、Tmax和pHmin[14-15]。

1.2.2.3 模型的驗(yàn)證

通過(guò)判定系數(shù)R2，均方誤差（mean square error，MSE），偏差因子（bias factor，Bf）和準(zhǔn)確因子（accuracy factor，Af）來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證，公式如下：

式中：μ觀測(cè)為實(shí)驗(yàn)所得生長(zhǎng)速率/h-1；μ預(yù)測(cè)為根據(jù)模型計(jì)算所得生長(zhǎng)速率/h-1；n為實(shí)驗(yàn)次數(shù)。

通過(guò)以Baranyi模型為基礎(chǔ)的在線軟件DMFit對(duì)各溫度條件下細(xì)胞生長(zhǎng)曲線進(jìn)行一級(jí)模型的擬合，可獲得其決定系數(shù)R2。R2（0＜R2＜1）越大說(shuō)明建立的模型與實(shí)際測(cè)量越接近；MSE（MSE＞0）越小，說(shuō)明建立的模型與實(shí)際測(cè)量越接近。

偏差因子（Bf）是描述觀測(cè)值所處位置為預(yù)測(cè)值所構(gòu)成曲線的上方、下方還是正好在曲線上的參數(shù)，同時(shí)該值還能度量觀測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間存在差距的大小，即該模型結(jié)構(gòu)性誤差的多少。當(dāng)該值小于1時(shí)，即預(yù)測(cè)值的平均大于觀測(cè)值的平均。

準(zhǔn)確因子（Af）描述了各觀測(cè)值所得到的點(diǎn)與預(yù)測(cè)值構(gòu)成的曲線之間的平均距離。值越大說(shuō)明模型平均準(zhǔn)確性越低，當(dāng)該值為1時(shí)說(shuō)明預(yù)觀測(cè)與預(yù)測(cè)完全吻合，當(dāng)該值為2時(shí)說(shuō)明預(yù)測(cè)與觀測(cè)有兩個(gè)單位的不同[16-17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度和pH值條件下乳酸乳球菌的生長(zhǎng)曲線和一級(jí)模型的建立

圖1 不同溫度下乳酸乳球菌的生長(zhǎng)曲線及其一級(jí)模型Fig.1 Growth curves and primary models of L. lactis under different temperatures

由圖1可知，乳酸乳球菌SQ117在10 ℃條件下仍然可以緩慢地生長(zhǎng)，其生長(zhǎng)速率通過(guò)模型回歸后為0.097 8 h-1，延滯期為6.6 h。而在37 ℃時(shí)其生長(zhǎng)速率最快、延滯期最短，反映了該菌在該溫度下的生長(zhǎng)優(yōu)于其他條件。在42 ℃條件下，該菌的生長(zhǎng)受到高溫的抑制，生長(zhǎng)速率為0.187 4 h-1，較37 ℃時(shí)0.346 1 h-1明顯緩慢，最大細(xì)胞濃度也低于37 ℃。通過(guò)一級(jí)模型的擬合，可獲得其決定系數(shù)R2均大于0.95，說(shuō)明該模型和軟件可對(duì)生長(zhǎng)數(shù)據(jù)進(jìn)行良好的擬合。這一結(jié)果也于相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道認(rèn)為乳酸乳球菌最適生長(zhǎng)溫度為37 ℃，并能在45 ℃以下生長(zhǎng)[18]，甚至能在50 ℃以下存活是一致的[19]。

由圖2可知，通過(guò)不同的pH值對(duì)菌株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，pH值為2.5和3時(shí)，菌株生長(zhǎng)情況基本一致。通過(guò)模型擬合得到其生長(zhǎng)速率和延滯期分別為0.128 2、0.133 5 h-1和5.61、5.81 h。菌株在pH值為6時(shí)生長(zhǎng)最迅速，生長(zhǎng)速率和延滯期分別為0.342 3 h-1和1.44 h。通過(guò)一級(jí)模型的擬合，各生長(zhǎng)曲線的決定系數(shù)R2均高于0.95，說(shuō)明采用DMFit軟件所建立的模型能對(duì)生長(zhǎng)曲線進(jìn)行很好的表述。

此外，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH值為2.5和3時(shí)，當(dāng)培養(yǎng)至穩(wěn)定期后，其pH值并未像其他較高pH值條件一樣下降，反而升高到了2.88和3.12，其生理狀況與一般乳酸乳球菌生長(zhǎng)時(shí)產(chǎn)酸降低pH值相異。已有研究者對(duì)pH值在發(fā)酵過(guò)程中的變化進(jìn)行了一定研究[20-21]，但其在一般環(huán)境中和逆境中生長(zhǎng)相異的機(jī)理仍值得進(jìn)行進(jìn)一步的探討。

圖2 不同pH值下乳酸乳球菌的生長(zhǎng)曲線及其一級(jí)模型Fig.2 Growth curves and primary models of L. lactis under different pH values

2.2 二級(jí)模型的建立

圖3 不同溫度和pH值對(duì)生長(zhǎng)速率和延滯期的影響及二級(jí)模型Fig.3 Secondary models describing growth rate and lag phase as a function of temperature and pH value

通過(guò)一級(jí)模型的擬合，得到不同條件下相應(yīng)的最大生長(zhǎng)速率μmax和延滯期參數(shù)λ，對(duì)其進(jìn)行二級(jí)模型的擬合。從圖3a、b可以看出，在不同的溫度條件下，菌株的最大生長(zhǎng)速率隨著溫度的升高而增加，延滯期隨著溫度的升高而降低。但當(dāng)溫度超過(guò)其最適溫度37 ℃時(shí)，其最大生長(zhǎng)速率明顯降低，延滯期明顯延長(zhǎng)。其二級(jí)模型擬合公式分別為：

通過(guò)二級(jí)模型分別對(duì)μmax和λ的擬合可以看出，其預(yù)測(cè)的最小溫度和最大溫度分別為－12.836、－12.857 ℃和42.338、42.199 ℃，數(shù)值之間差異極小，說(shuō)明模型能夠針對(duì)不同的生長(zhǎng)參數(shù)預(yù)測(cè)出一定條件下微生物的特定生長(zhǎng)特性。

圖3c、d為在不同pH值條件下μmax和λ的二級(jí)模型，可以看出μmax隨著pH值的升高而增加，λ隨著pH值的升高而縮短。因而對(duì)其進(jìn)行線性回歸，可得其二級(jí)模型擬合公式為：

2.3 模型的驗(yàn)證

表1 二級(jí)模型的驗(yàn)證Table 1 Validation of the secondary models

為驗(yàn)證二級(jí)模型是否能很好的描述微生物的生長(zhǎng)特點(diǎn)，采用了3種常見的驗(yàn)證參數(shù)對(duì)數(shù)據(jù)和模型進(jìn)行驗(yàn)證。通過(guò)表1可以看出，二級(jí)模型回歸所得MSE值在兩種條件下對(duì)兩對(duì)生長(zhǎng)參數(shù)的擬合中均小于0.01，體現(xiàn)了模型良好的擬合特性。一般認(rèn)為Bf值在0.90～1.05的范圍，該模型能夠很好地預(yù)測(cè)微生物生長(zhǎng)速度和生長(zhǎng)狀況；Bf值在0.70～0.90或者1.06～1.15范圍，則該模型是可以被接受的；如果Bf值＞1.15或者＜0.70，則說(shuō)明該模型是失敗的[17]。本文所有的Bf值都在1左右，落入了0.90～1.05的最佳擬合區(qū)間。此外，Af值均在1.17附近，也說(shuō)明了模型良好的擬合特性。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)自四川本地發(fā)酵乳制品中分離鑒定得到的乳酸乳球菌SQ117進(jìn)行生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)研究，建立了其在不同溫度和pH值條件下的一級(jí)模型和二級(jí)模型，并對(duì)模型的擬合性進(jìn)行了驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)采用以Baranyi模型為基礎(chǔ)的在線軟件DMFit對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了擬合，避免了傳統(tǒng)預(yù)測(cè)微生物進(jìn)行數(shù)學(xué)建模時(shí)所進(jìn)行了繁復(fù)演算和擬合，為本領(lǐng)域的研究介紹了一種簡(jiǎn)單可靠的新方法。通過(guò)預(yù)測(cè)微生物學(xué)在益生菌中的研究，可以更加定量地對(duì)益生菌所產(chǎn)生的有益代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，將實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)更有效的用于生產(chǎn)實(shí)際中[22]。

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Growth Dynamics of Lactococcus lactis SQ117 under Different Temperatures and pHs

ZHOU Kang, WEI Jun, JIANG Cui-lian, HAN Xin-feng, LIU Shu-liang
(College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

In this study, we used the isolated strain from fermented milk, which was identified as Lactococcus lactis SQ117, to study its dynamic growth under different temperatures and pH values. We used DMFit web-edition, which is based on the Baranyi model, to establish the primary model, and Ratkowsky model was applied for the secondary model. Both models were validated. The results showed that this DMFit software simulated the growth curve with an excellent goodnessof-fit indicating that DMFit is a functional and handy software. Furthermore, we also found that the theory of predictive microbiology had a good potential to describe the growth of lactic acid bacteria.

predictive microbiology; DMFit web-edition; temperature; pH; Lactococcus lactis

TS254

A

1002-6630（2014）07-0192-04

10.7506/spkx1002-6630-201407038

2013-11-26

周康（1983—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸飳W(xué)。E-mail：kang_zhou@163.com