劉 林，謝 和*

（貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)纖溶酶的19 L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)及其酶學(xué)性質(zhì)

劉 林，謝 和*

（貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

在搖瓶實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）GZJSI-12-7產(chǎn)纖溶酶最佳條件進(jìn)行19 L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：GZJSI-12-7在發(fā)酵罐中培養(yǎng)6 h時(shí)開始產(chǎn)纖溶酶，78 h后纖溶酶產(chǎn)量基本穩(wěn)定，達(dá)到4 178.39 IU/mL，產(chǎn)酶高峰比搖瓶發(fā)酵提前12 h左右。將發(fā)酵液經(jīng)離心除菌、硫酸銨分級鹽析、透析除鹽、Sephadex G-75凝膠過濾，得到纖溶酶的純化倍數(shù)為9.84倍，酶活力回收率為42.52%，比活力為48 073.193 IU/mg。對纖溶酶的酶學(xué)性質(zhì)研究表明，該酶的分子質(zhì)量約為30.2 kD，最適溫度和pH值分別為40 ℃、7.5；在40 ℃以下酶的穩(wěn)定性良好，超過50 ℃后酶活力迅速降低，耐熱性較差；金屬離子Mg2+、Ca2+、Mn2+對纖溶酶活性均有較強(qiáng)的激活作用，而Cu2+和Fe3+對酶活性具有明顯的抑制作用。

解淀粉芽孢桿菌；纖溶酶；發(fā)酵；分離純化；酶學(xué)性質(zhì)

近年來，隨著人口老齡化趨勢的加劇和生活水平的逐步提高，我國心腦血管栓塞性疾病的發(fā)病率不斷上升，給人們的健康造成了嚴(yán)重的威脅[1-2]。溶栓療法是治療血栓類疾病最有效的手段之一，作為溶栓藥物的重要來源，微生物由于具有種類多、繁殖快并能產(chǎn)生大量胞外蛋白酶的優(yōu)點(diǎn)，引起了人們的廣泛關(guān)注[3-4]。然而，目前國內(nèi)微生物源纖溶酶的研究尚處于實(shí)驗(yàn)室階段，幾乎還沒有微生物纖溶酶產(chǎn)品上市，主要是由于纖溶酶發(fā)酵產(chǎn)量較低的緣故，用野生型微生物進(jìn)行液體發(fā)酵時(shí)的纖溶酶活力一般可達(dá)200～1 500 U/mL，誘變優(yōu)化后可達(dá)600～3 000 U/mL，最高可達(dá)18 228 U/mL[5]。

本實(shí)驗(yàn)室前期對分離自醬香型白酒酒曲中的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）GZJSI-12通過紫外線和亞硝基胍的復(fù)合處理，獲得了1株高產(chǎn)纖溶酶的突變株GZJSI-12-7，搖瓶優(yōu)化后產(chǎn)酶活力高達(dá)4 789.08 IU/mL[6]。進(jìn)一步對解淀粉芽孢桿菌GZJSI-12-7的搖瓶最佳發(fā)酵條件進(jìn)行19 L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)，并對發(fā)酵液中的纖溶酶進(jìn)行分離純化和酶學(xué)性質(zhì)初步研究，為溶栓藥物的研究開發(fā)和纖溶酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）GZJSI-12-7由分離自醬香型白酒酒曲中的GZJSI-12誘變所得[6]，仍具有較好的產(chǎn)醬香能力，保存于貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基

固體斜面培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L，瓊脂20 g/L、pH 7.2～7.4，121 ℃滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L、蛋白胨10 g/L、Na2HPO42 g/L、NaH2PO41 g/L、CaCl20.2 g/L、MgSO40.5 g/L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基[6]：葡萄糖30 g/L、蛋白胨10 g/L、吐溫-80 5 g/L、CaCl20.4 g/L、MgSO40.847 g/L、Na2HPO42 g/L、NaH2PO46.988 g/L，pH 9.0，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑

纖維蛋白原、凝血酶 美國Sigma公司；葡聚糖凝膠G-75 北京博奧拓達(dá)科技有限公司；即用型蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（低） 日本TaKaRa公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純或進(jìn)口分裝。

1.1.4 儀器與設(shè)備

L1523小型發(fā)酵罐（19 L） 瑞士比歐生物工程公司；2-16K高速冷凍離心機(jī) 美國Sigma公司；DYY-4C穩(wěn)流穩(wěn)壓定時(shí)電泳儀 北京市六一儀器廠；Gel Doc XR＋凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；THZ-160D氣浴恒溫振蕩器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；SW-CJ-1FD標(biāo)準(zhǔn)型凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 纖溶酶酶活力測定

采用瓊脂糖-纖維蛋白平板法[7]測定纖溶酶酶活力，并以尿激酶（標(biāo)準(zhǔn)品）作纖溶酶酶活力標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

以考馬斯亮藍(lán)G-250法測定發(fā)酵液的蛋白質(zhì)含量，蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作參照文獻(xiàn)[8]。

1.2.3 19 L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)

對搖瓶優(yōu)化出的最佳培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件[6]（裝液量和搖床轉(zhuǎn)速除外）進(jìn)行19 L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)。發(fā)酵罐參數(shù)為：裝液量13 L，轉(zhuǎn)速設(shè)定為350 r/min、通氣量6 L/min、發(fā)酵96 h，每隔6 h取樣測纖溶酶活性。

1.2.4 纖溶酶的分離純化

1.2.4.1 分段鹽析提取纖溶酶

將GZJSI-12-7發(fā)酵液于4 ℃、8 000 r/min離心20 min，棄沉淀后加入硫酸銨至10%飽和度，4 ℃靜置過夜，冷凍離心（4 ℃、12 000 r/min、10 min），留取上清液備用。將上清液分為等量15份，分別加入不同量的硫酸銨使飽和度達(dá)到20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%，4 ℃條件下靜置過夜，冷凍離心，分別收集沉淀和上清液。將沉淀溶于巴比妥鈉-HCl緩沖液中，以纖維蛋白平板法分別測定沉淀和上清液的纖溶酶活性。

1.2.4.2 透析與濃縮

將鹽析后收集的沉淀溶于pH 7.5的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液中，4 ℃、8 000 r/min離心20 min后，將上清液裝入透析袋內(nèi)，在蒸餾水中于4 ℃充分透析至透析液經(jīng)BaCl2檢驗(yàn)無沉淀為止。后將其置于聚乙二醇20 000中濃縮。

1.2.4.3 葡聚糖凝膠層析

將經(jīng)過透析除鹽濃縮后的粗酶液用葡聚糖凝膠G-75進(jìn)行層析分離，以磷酸鹽緩沖液（pH 7.8）為洗脫液，每管接洗脫液10滴，檢測收集到的各管中蛋白質(zhì)和纖溶酶分布情況。

1.2.4.4 纖溶酶的分子質(zhì)量測定

參照文獻(xiàn)[9]的方法進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，選擇5%濃縮膠、12%分離膠。

1.2.5 纖溶酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

1.2.5.1 溫度對纖溶酶活性的影響

將純酶液作適當(dāng)稀釋后，取10 μL點(diǎn)樣于纖維蛋白平板上，將其置于不同溫度下（25、30、35、37、40、45、50、55、60 ℃）恒溫放置18 h，測量水解圈垂直直徑，比較纖溶酶在不同溫度下的活性。

1.2.5.2 纖溶酶的溫度穩(wěn)定性

將純酶液作適當(dāng)稀釋后，分別置于30、40、50、60 ℃水浴鍋中保溫1 h，期間每隔15 min取樣，測定酶的剩余酶活力，確定纖溶酶對溫度的耐受性。

1.2.5.3 pH值對纖溶酶活性的影響

用pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0、11.0的廣泛緩沖液分別與純酶液按體積比1∶1的比例混合，4 ℃放置1 h后，用纖維蛋白平板法測定纖溶酶酶活力，研究pH值對纖溶酶活性的影響。

1.2.5.4 金屬離子對纖溶酶活性的影響

配制含不同金屬離子的鹽溶液：NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、FeCl3、CuCl2、MnCl2。將鹽溶液分別加入純酶液中，使金屬離子的終濃度分別為5、10 mmol/L，并以不加金屬離子的酶液為對照，4 ℃放置1 h后測纖溶酶酶活力，比較金屬離子對纖溶酶活性的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 19 L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)

圖1 發(fā)酵罐中GZJSI-12-7的生長曲線和產(chǎn)酶曲線Fig.1 Growth and fibrinolytic activity curves of GZJS1-12-7 in 19 L fermenter

對搖瓶最優(yōu)條件進(jìn)行19 L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)，每6 h取樣，測其OD600nm光密度和纖溶酶酶活力，結(jié)果如圖1所示。菌株在發(fā)酵罐中培養(yǎng)時(shí)，1～2 h內(nèi)為延滯期，2 h后進(jìn)入對數(shù)生長期，并在12 h后進(jìn)入穩(wěn)定生長期，66 h后則進(jìn)入衰亡期。由發(fā)酵罐中的產(chǎn)酶曲線可以看出，培養(yǎng)6 h后菌株開始產(chǎn)生纖溶酶，并在48 h時(shí)達(dá)到一個(gè)高峰，此后的18 h內(nèi)纖溶酶產(chǎn)量穩(wěn)定，可能是由于發(fā)酵液中的纖溶酶濃度較高，對菌株產(chǎn)酶產(chǎn)生了反饋抑制所致；66 h后纖溶酶產(chǎn)量又逐漸增加，可能是進(jìn)入衰亡期后菌體細(xì)胞破裂，細(xì)胞內(nèi)的纖溶酶得以釋放，抑或是酶的二次誘導(dǎo)所致；進(jìn)入78 h后，纖溶酶的產(chǎn)量增加趨于平緩，考慮到經(jīng)濟(jì)效益，選擇78 h作為發(fā)酵終點(diǎn)，此時(shí)纖溶酶的產(chǎn)量為4 178.39 IU/mL。從菌體生長與產(chǎn)酶的關(guān)系來看，在進(jìn)入對數(shù)中后期時(shí)纖溶酶開始合成，并且在進(jìn)入穩(wěn)定期后繼續(xù)合成，屬于部分生長偶聯(lián)型[10]。

由圖1中搖瓶和發(fā)酵罐中產(chǎn)酶曲線的比較可以看出，發(fā)酵罐中的起始產(chǎn)酶時(shí)間比搖瓶提前6 h左右，并在9～24 h內(nèi)纖溶酶產(chǎn)量高于搖瓶，可能是由于在發(fā)酵罐中的穩(wěn)定期比搖瓶提前，生物量在這段時(shí)間內(nèi)多于搖瓶的緣故；30～48 h內(nèi)，搖瓶和發(fā)酵罐中產(chǎn)酶速率均處于較高的水平，纖溶酶產(chǎn)量迅速上升，可能是進(jìn)入穩(wěn)定期后纖溶酶的迅速積累；48 h后，搖瓶中的纖溶酶產(chǎn)量開始高于發(fā)酵罐，并一直處于領(lǐng)先水平，可能是由于發(fā)酵罐中前期原料（底物或碳源）消耗較快，后期相對于搖瓶原料（底物或碳源）匱乏的結(jié)果；60～78 h內(nèi)搖瓶中的纖溶酶產(chǎn)量趨于平穩(wěn)，之后又緩慢上升并在90 h時(shí)產(chǎn)酶達(dá)到高峰，為4 847.63 IU/mL，比發(fā)酵罐中的產(chǎn)酶高峰推遲了12 h左右。

2.2 硫酸銨分級鹽析

GZJSI-12-7發(fā)酵液經(jīng)不同飽和度硫酸銨鹽析后上清液和沉淀中的纖溶酶酶活力如圖2所示。當(dāng)硫酸銨飽和度小于35%時(shí)，纖溶酶不形成沉淀，酶活力基本存在于上清液中；35%～80%飽和度范圍時(shí)，纖溶酶的沉淀量隨硫酸銨飽和度的增加而增加；當(dāng)硫酸銨飽和度達(dá)到80%時(shí)，上清液中纖溶酶活力為零，酶基本被沉淀下來；但飽和度大于75%時(shí)，沉淀中纖溶酶活力并沒有顯著增加，由于高濃度樣品鹽析存在共沉淀的問題，因此，考慮用35%～75%飽和度的硫酸銨分段鹽析，可以把發(fā)酵液中的纖溶酶鹽析沉淀出來，并減少其他雜蛋白的干擾。

圖2 硫酸銨飽和度對纖溶酶鹽析效果的影響Fig.2 Effect of different saturation degrees of ammonium sulfate on salting out of fibrinolytic enzyme

2.3 葡聚糖凝膠層析結(jié)果

圖3 葡聚糖凝膠G-75層析各管蛋白質(zhì)含量和纖溶酶分布Fig.3 Distribution of protein content and plasmin activity by Sephadex G-75 chromatography

由圖3可見，粗酶液經(jīng)葡聚糖凝膠G-75層析分離后，蛋白質(zhì)主要分布在6～34管，且在第12管和第28管出現(xiàn)兩個(gè)活性峰，其中第12管蛋白質(zhì)含量最高，達(dá)到393.62 μg/mL；纖溶酶主要分布在第6～20管，其中在第12管出現(xiàn)一個(gè)峰值。由洗脫曲線還可以看出，纖溶酶酶活力峰基本上與蛋白質(zhì)濃度的前一個(gè)洗脫峰相重疊，纖溶酶集中在6～20管被洗脫出來，與21～34管的雜蛋白分離開。

經(jīng)分析比較之后，以7～17管的收集液作為純化分離后的酶液，經(jīng)濃縮后測定蛋白質(zhì)含量和纖溶酶活性，計(jì)算層析分離后酶的各項(xiàng)指標(biāo)。

2.4 纖溶酶的分子質(zhì)量

由圖4可知，純化后樣品的電泳圖譜檢測只顯示一條明顯的蛋白條帶，根據(jù)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白做標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定該纖溶酶的分子質(zhì)量約為30.2 kD，與Agrebi等[11]報(bào)道的從解淀粉芽孢桿菌An6發(fā)酵液中分離的纖溶酶的分子質(zhì)量相近。

圖4 純化纖溶酶電泳圖譜Fig.4 Eletrophoresis of purified fibrinolytic enzyme

2.5 纖溶酶的純化倍數(shù)與回收率

500 mL發(fā)酵液經(jīng)硫酸銨分級鹽析、Sephadex G-75層析后，各步驟酶的比活力、純化倍數(shù)及酶活力回收率如表1所示。

表1 纖溶酶純化效果Table 1 Purification of fibrinolytic enzyme

由表1可知，發(fā)酵粗酶液經(jīng)過一系列的分離純化步驟后，酶的純化倍數(shù)為9.84倍，酶活力回收率42.52%，比活力為48 073.193 IU/mg，純化效果明顯。

2.6 纖溶酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.6.1 溫度對纖溶酶酶活力的影響結(jié)果

圖5 溫度對纖溶酶活性的影響Fig.5 Effect of temperature on the activity of fibrinolytic enzyme

由圖5可知，溫度低于40 ℃時(shí)，纖溶酶活力隨著溫度的升高而提高；35～45 ℃的范圍內(nèi)，纖溶酶酶活力相對較高，并且在40 ℃時(shí)活性最大；當(dāng)溫度高于40 ℃時(shí)，酶活力隨著溫度的進(jìn)一步升高而降低，且當(dāng)溫度為60 ℃時(shí)，酶活力基本上喪失。

2.6.2 纖溶酶的溫度穩(wěn)定性結(jié)果

圖6 纖溶酶的溫度穩(wěn)定性Fig.6 Effect of temperature on the stability of fibrinolytic enzyme

由圖6可知，該酶在30 ℃時(shí)比較穩(wěn)定，酶活力基本保持不變，40 ℃保溫l h后酶活力損失不大。50 ℃時(shí)隨時(shí)間延長酶活力逐漸降低，1 h后酶活力損失約40%。60 ℃時(shí)隨著保存時(shí)間的延長，纖溶酶活力迅速下降，1 h后基本失活，與牛術(shù)敏等[12]報(bào)道的BS-26菌株纖溶酶熱穩(wěn)定性一致，說明該纖溶酶的耐熱性不是很好。

2.6.3 pH值對纖溶酶活性的影響結(jié)果

圖7 pH值對纖溶酶活性的影響Fig.7 Effect of pH on the activity of fibrinolytic enzyme

由圖7可知，pH 7.0～9.0時(shí)，纖溶酶酶活力相對穩(wěn)定，pH 7.5左右時(shí)，酶活力達(dá)到最高。pH值低于7.5時(shí)，酶活力隨著pH值的增大而提高。pH值高于7.5時(shí)，酶活力隨著pH值的增大而減小，pH 10.0后隨著pH值的增大酶活力迅速降低，由此推測該纖溶酶的最適pH值為7.5左右，且該纖溶酶在堿性范圍內(nèi)的穩(wěn)定性優(yōu)于在酸性環(huán)境中的穩(wěn)定性。

2.6.4 金屬離子對纖溶酶活性的影響結(jié)果

圖8 金屬離子對纖溶酶活性的影響Fig.8 Effects of metal ions on the activity of fibrinolytic enzyme

由圖8可知，Na+、K+對纖溶酶酶活力的影響不大；Mg2+、Ca2+、Mn2+對纖溶酶酶活力均有較強(qiáng)的激活作用，并且以Mn2+的激活作用最為明顯，但5 mmol/L和10 mmol/L的離子濃度對酶活力的影響差異均不顯著（P＞0.05）；Cu2+和Fe3+則明顯抑制纖溶酶的酶活力，且隨著濃度的增大，抑制作用增強(qiáng)（P＜0.05）。

3 結(jié) 論

目前國內(nèi)外關(guān)于纖溶酶類的研究非?；钴S，也取得了許多顯著的成果[13-15]，但是這些成果大多局限于實(shí)驗(yàn)室的搖瓶發(fā)酵，而搖瓶發(fā)酵的條件與發(fā)酵罐的發(fā)酵條件在一定程度上存在差異，往往存在著“放大效應(yīng)”，并且由于傳遞因素造成的影響導(dǎo)致?lián)u瓶實(shí)驗(yàn)難以實(shí)現(xiàn)精確在線檢測和調(diào)控，所以采用發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)仍是目前生物技術(shù)開發(fā)和實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的必由之路[16]。本實(shí)驗(yàn)對突變株GZJSI-12-7的搖瓶產(chǎn)纖溶酶最佳條件進(jìn)行19 L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，78 h后纖溶酶產(chǎn)量基本穩(wěn)定，達(dá)到4 178.39 IU/mL，與文獻(xiàn)相比仍處于較高的產(chǎn)酶水平[17-18]，下一步有望通過對發(fā)酵罐中培養(yǎng)基成分和發(fā)酵參數(shù)的優(yōu)化及基因工程菌的構(gòu)建來進(jìn)一步提高纖溶酶的發(fā)酵效價(jià)。

經(jīng)一系列的分離純化手段后獲得了純化的纖溶酶，酶的純化倍數(shù)為9.84倍，酶活力回收率42.52%，酶比活力為48 073.193 IU/mg，該比活力與已有文獻(xiàn)相比處于較高的水平[19-21]，可將其用于溶栓藥物的研究。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，該酶的分子質(zhì)量約為30.2 kD。最適溫度和pH值分別為40 ℃、7.5，接近于人體血液的微環(huán)境，說明該酶在人體正常生理環(huán)境下酶活力穩(wěn)定，開發(fā)為溶栓藥物的潛力巨大。在40 ℃以下酶的穩(wěn)定性良好，超過50 ℃后酶活力迅速降低，耐熱性較差。金屬離子Mg2+、Ca2+、Mn2+對纖溶酶活性均有較強(qiáng)的激活作用，其中Mn2+的激活作用最強(qiáng)，Cu2+和Fe3+對酶具有明顯的抑制作用，這與Jeong等[22]的研究結(jié)果差異較大，而與牛術(shù)敏等[12]的研究結(jié)果相似。

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Production and Characterization of Fibrinolytic Enzyme from Bacillus amyloliquefaciens in 19 L Fermenter and Investigation of Its Properties

LIU Lin, XIE He*
(College of Life Sciences, Guizhou University, Guiyang 550025, China)

As an extension of our previous fermentation experiments in shake flasks, the objective of this study was to optimize the fermentation conditions for the production of fi brinolytic enzyme by Bacillus amyloliquefaciens GZJSI-12-7 in a 19 L fermenter. The results showed that plasmin activity began to appear after incubation for 6 h and remained constant after 78 h at a level of 4 178.39 IU/mL. The peak of enzyme production occurred about 12 h earlier than in shake flasks. Fibrinolytic enzyme was purified from the fermented liquid medium by bactofugation, ammonium sulfate precipitation, dialysis and Sephadex G-75 gel filtration, with a purification fold of 9.84 and an activity recovery of 42.52%. The specific activity of the purified fibrinolytic enzyme was 48 073.193 IU/mg. Enzymatic characterization showed that the molecular weight of the fibrinolytic enzyme was about 30.2 kD, and its optimum temperature and pH were 40 ℃ and 7.5, respectively. The purified fibrinolytic enzyme was stable blow 40 ℃ but sharply decreased above 50 ℃. The enzymatic activity was markedly catalyzed by Mg2+, Ca2+and Mn2+, but strongly inhibited by Cu2+and Fe3+.

Bacillus amyloliquefaciens; fibrinolytic enzyme; fermentation; purification; characterization

TQ464.8

A

1002-6630（2014）07-0176-05

10.7506/spkx1002-6630-201407035

2013-06-23

劉林（1988—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)閼?yīng)用微生物學(xué)。E-mail：liulin6904@126.com

*通信作者：謝和（1963—），男，副教授，碩士，研究方向?yàn)橘Y源微生物學(xué)和應(yīng)用微生物學(xué)。E-mail：xieheh@163.com