魏 巍，余夢(mèng)瑤，許曉燕，江 南，葉利明，羅 霞,*

（1.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院 中藥細(xì)胞與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041；2.四川大學(xué)華西藥學(xué)院，四川 成都 610041）

不同羊肚菌菌株的遺傳差異性與胃黏膜保護(hù)作用的比較研究

魏 巍1，余夢(mèng)瑤1，許曉燕1，江 南1，葉利明2，羅 霞1,*

（1.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院 中藥細(xì)胞與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041；2.四川大學(xué)華西藥學(xué)院，四川 成都 610041）

為研究不同羊肚菌菌株之間的遺傳差異性和比較不同菌株的胃黏膜保護(hù)作用。采用簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間（inter-simple sequence repeats，ISSR）分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)羊肚菌進(jìn)行了遺傳差異性分析；以菌絲體干質(zhì)量為指標(biāo)，比較不同菌株液體發(fā)酵的菌絲體生物量；研究不同菌株對(duì)酒精引起的小鼠急性胃黏膜損傷的保護(hù)作用。結(jié)果表明：16株羊肚菌菌株可分為2組，羊肚菌M1～M10生物量較高，羊肚菌M1、M2、M3的胃黏膜保護(hù)作用最好。不同羊肚菌菌株在液體發(fā)酵生物量和胃黏膜損傷的保護(hù)作用方面存在較大的差異。

羊肚菌；簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間；生物量；胃黏膜保護(hù)

我國(guó)羊肚菌資源豐富，分布廣泛，據(jù)記載，在中國(guó)發(fā)現(xiàn)的羊肚菌有8個(gè)種，在全國(guó)20多個(gè)省均發(fā)現(xiàn)。羊肚菌不僅味道鮮美而且具有極高營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值?！吨腥A本草》記載：羊肚菌消食和胃，化痰理氣。主治消化不良，痰多咳嗽。還可以增強(qiáng)免疫[1]、抗輻射[2]、抗腫瘤[3]、保肝[4]、促進(jìn)胃排空與加強(qiáng)小腸推進(jìn)[5-6]。最近的研究報(bào)道，尖頂羊肚菌對(duì)多種實(shí)驗(yàn)型動(dòng)物胃潰瘍具有保護(hù)作用[7-8]，但是尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道這種胃黏膜保護(hù)作用是否在菌株之間存在差異。本實(shí)驗(yàn)利用分子生物學(xué)的手段研究了16株野生羊肚菌的遺傳差異性，并比較了這16株野生羊肚菌對(duì)酒精引起的胃黏膜損傷的保護(hù)作用，研究了胃黏膜保護(hù)作用在菌種之間的差異性，為開(kāi)發(fā)具有功效的羊肚菌新產(chǎn)品在菌株選擇上提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株和培養(yǎng)基

羊肚菌M1～M16于2004—2006年在四川省攀枝花、阿壩州與甘孜州等地采集，通過(guò)組織或孢子分離而得，4℃條件下保存于PDA綜合培養(yǎng)基上，每6個(gè)月活化傳代一次（表1）。羊肚菌子實(shí)體為市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)尖頂羊肚菌。

表1 菌株信息表Table 1 Information about Morechella strains

1.2 引物

所用引物參照加拿大哥倫比亞大學(xué)UBC公司公布的第9套簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間（inter-simple sequence repeats，ISSR）引物序列（http://www.biotech.ubc.ca/services/naps/ primers/Primers.pdf），共100個(gè)引物。

1.3 動(dòng)物

昆明種小鼠，雌雄各半，18～22 g，由四川省中醫(yī)藥科學(xué)研究院動(dòng)物室提供（SPF級(jí)，合格證號(hào)：SCXK（川）2005-19），動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。

1.4 ISSR聚類(lèi)分析

1.4.1 DNA提取

采用十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethy ammonium bromide，CTAB）法提取DNA[9]。

1.4.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系[10]：模板DNA（100 ng/μL）1 μL、10×PCR Buffer （Mg2+free）2.0 μL、ISSR引物（10 μmol/L） 0.2 μL、Opti-Taq （2.5 U/μL）0.4 μL、dNTPs Mixture （each 2.5 mmol/L）1.6 μL、Mg2+（25 mmol/L）1.6 μL、ddH2O 13.2 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃充分變性5 min；94 ℃變性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；反應(yīng)完成后，PCR產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，EB染色后利用凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.4.3 引物的篩選

根據(jù)條帶清晰度、多態(tài)性以及重復(fù)性進(jìn)行PCR反應(yīng)，以對(duì)100個(gè)ISSR引物進(jìn)行篩選，篩選獲得引物見(jiàn)表2。

表2 ISSR所用引物Table 2 Primers used in ISSR

1.4.4 PCR產(chǎn)物的電泳圖譜分析

對(duì)各個(gè)分子標(biāo)記的PCR產(chǎn)物的電泳圖譜進(jìn)行分別分析。具有條帶記為“1”，沒(méi)有條帶記為“0”，對(duì)每一菌株和每一引物進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，進(jìn)而將電泳圖譜轉(zhuǎn)化一個(gè)僅包含“0”“1”的矩陣。采用NTSY Spc version 2.1軟件，運(yùn)用非加權(quán)組平均（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）法進(jìn)行聚類(lèi)分析。

1.5 生物量的測(cè)定與樣品的提取

1.5.1 菌絲體的制備

使用前將保存菌種轉(zhuǎn)入新鮮斜面活化，于25 ℃活化1周；將活化的斜面瓊脂塊（1 cm2）接入液體種培養(yǎng)基中，于25 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)7 d[10]。液體種子按體積分?jǐn)?shù)10%接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，于25 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)7 d。

1.5.2 生物量的測(cè)定

發(fā)酵液3 000 r/min離心10 min，收集菌絲體，用蒸餾水洗滌菌絲3次，離心后菌絲體冷凍干燥后，置于干燥器中保存。

1.5.3 樣品提取

菌絲體冷凍干燥后，以20、15、10、10倍蒸餾水在功率800 W，超聲提取4次，每次30 min，超聲時(shí)間5 s，間隔5 s。將4次提取液混合，60 ℃減壓濃縮至0.1 g/mL（即每0.1 g羊肚菌菌絲提取后濃縮至1 mL），－20 ℃保存。

1.6 胃黏膜保護(hù)作用比較

130只KM種小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為13組，給藥組每日灌胃羊肚菌水提液或子實(shí)體水提液2 g生藥/kg（即提取液20 mL/kg），空白組和模型組給予等量蒸餾水，小鼠連續(xù)灌胃9 d，實(shí)驗(yàn)前1 d禁食不禁水24 h，第10天各組灌胃樣品30 min后，除空白組外，各組灌胃95%乙醇10 mL/kg，1 h后頸椎脫臼處死取胃，用磷酸鹽緩沖液沖洗胃內(nèi)雜質(zhì)，每只灌注3 mL福爾馬林固定液后結(jié)扎幽門(mén)，置入福爾馬林固定液固定2 h。沿胃大彎剪開(kāi)胃，在解剖鏡下記錄觀察胃黏膜損傷情況。按Guth評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算胃黏膜損傷指數(shù)，并計(jì)算損傷抑制率[12]。 0

為比較各個(gè)菌株之間的胃黏膜保護(hù)作用的差別，統(tǒng)計(jì)采用單因素方差分析，P＜0.05認(rèn)為有顯著差異，各組之間的比較采用Duncan’s新復(fù)極差法比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR多態(tài)性分析

將表2中15個(gè)引物應(yīng)用于正式實(shí)驗(yàn)。通過(guò)15條引物對(duì)16個(gè)樣本的擴(kuò)增（圖1），共得到擴(kuò)增產(chǎn)物324條，無(wú)共有條帶，多態(tài)性100%。

圖1 16株羊肚菌擴(kuò)增ISSR圖譜分析結(jié)果Fig.1 ISSR profile of 16 Morchella strains

2.2 聚類(lèi)分析

采用UPGMA法構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。由圖2可知，在相似系數(shù)0.51處截取聚類(lèi)線(xiàn)，可將16株羊肚菌菌株可分為2組，即M15、M7、M13、M2、M1、M4、M5、M9等8株菌株一組，M16、M14、M12、M10、M8、M6、M3等8株菌株一組。

圖2 16株羊肚菌ISSR聚類(lèi)樹(shù)Fig.2 Dendrogram of 16 Morchella strains based on ISSR bands

2.3 液體發(fā)酵生物量比較

圖3 16株羊肚菌液體發(fā)酵生物量比較Fig.3 Comparison of biomass among 16 Morchella strains

由圖3可知，16株羊肚菌的液體發(fā)酵生物量差異較大，其中羊肚菌M1的生物量最高，達(dá)9.4 g/L，其次為羊肚菌M2～M10，生物量在6～8 g/L之間，可以進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，羊肚菌M11～M16生物量較低，最高僅有2.12 g/L，M14～M16幾乎法進(jìn)行液體培養(yǎng)。因此，在對(duì)酒精引起的急性胃黏膜損傷的保護(hù)作用比較實(shí)驗(yàn)中，只選用生物量較高的羊肚菌M1～M10。

2.4 胃黏膜保護(hù)作用比較

圖4 小鼠胃黏膜損傷指數(shù)（n=10）=10Fig.4 Lesion index of gastric mucosa in mice ( (n=10)=10)

由圖4可知，灌胃羊肚菌M1、M2、M3、M7、M9以及羊肚菌子實(shí)體水提液的小鼠胃黏膜損傷指數(shù)明顯低于模型組（P＜0.05），其抑制率分別為82.39%、73.58%、73.58%、40.87%、32.71%和50.49%，羊肚菌M1、M2、M3效果最好，3組之間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。羊肚菌M4、M5、M6、M8、M10損傷指數(shù)雖然低于模型組，但是與模型組比較無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

3 討 論

羊肚菌的人工栽培雖然已有成功報(bào)道[13-14]，但是成本高、工序復(fù)雜、重復(fù)性差等問(wèn)題，至今仍無(wú)法大面積的推廣和應(yīng)用。而羊肚菌液體發(fā)酵技術(shù)比較成熟[15-17]并且有著：原料來(lái)源廣泛，價(jià)格低廉；生產(chǎn)周期短；污染率低；無(wú)季節(jié)性等諸多優(yōu)勢(shì)，適合工業(yè)化生產(chǎn)，具有替代子實(shí)體開(kāi)發(fā)的潛力。結(jié)果中也發(fā)現(xiàn)部分液體發(fā)酵菌絲體的胃黏膜保護(hù)作用較子實(shí)體強(qiáng)，其作用機(jī)制與增加胃黏液的分泌和抗氧化作用有關(guān)[18]。但是菌種之間的藥理作用是否具有差異尚未有研究報(bào)道。

通過(guò)對(duì)16株羊肚菌采用ISSR分子標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物表明，ISSR多態(tài)性豐富，重復(fù)性較高。采用UPGMA法對(duì)ISSR結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)2組羊肚菌的遺傳差異較大。遺傳背景上存在差異，導(dǎo)致它們代謝產(chǎn)物或活性物質(zhì)存在差異，引起藥效的差異，有研究[19]表明，靈芝不同菌株間在主要成分和藥效上就存在明顯的差異。提示各組間羊肚菌在功效上也可能存在較大的差異。在其胃黏膜保護(hù)作用的比較研究發(fā)現(xiàn)，羊肚菌的這種生物活性在菌株間也存在較大差異，其中保護(hù)作用較強(qiáng)的有羊肚菌M1、M2和M3，保護(hù)作用較弱的羊肚菌菌株有M4、M5、M8和M10。通過(guò)后續(xù)的研究，經(jīng)形態(tài)學(xué)和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列（internal transcribed spacer，ITS）的鑒定方法將其中保護(hù)作用較強(qiáng)的羊肚菌M1鑒定為尖頂羊肚菌（M. conica）[20]。這種在親緣關(guān)系很接近的菌株中存在生物活性的較大差異的現(xiàn)象，可能是由于生長(zhǎng)條件、生長(zhǎng)方式和生長(zhǎng)階段的不同導(dǎo)致的，具體原因尚有待研究。

[1] 孫曉明, 張衛(wèi)明, 昊寨玲, 等. 羊肚菌免疫調(diào)節(jié)作用研究[J]. 中國(guó)野生植物資源, 2001, 20(2): 12-13; 20.

[2] 呂曉蓮, 郭宏, 賈建會(huì), 等. 羊肚菌發(fā)酵產(chǎn)物功能性研究[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(1): 311-314.

[3] 陳彥, 潘見(jiàn), 周麗偉, 等. 羊肚菌胞外多糖抗腫瘤作用的研究[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(9): 553-555.

[4] 孫玉軍, 陳彥, 周正義, 等. 羊肚菌胞內(nèi)多糖對(duì)小鼠急性肝損傷的影響[J]. 中國(guó)食用菌, 2008, 27(2): 41-42; 45.

[5] 吳映明. 羊肚菌對(duì)小鼠胃排空的影響[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 9(4): 170-171.

[6] 吳映明, 陳奮, 林建新, 等. 羊肚菌對(duì)小鼠小腸推進(jìn)功能的研究[J].廣東教育學(xué)院學(xué)報(bào), 2005, 25(3): 80-82.

[7] 高明燕, 鄭林用, 余夢(mèng)瑤. 尖頂羊肚菌菌絲體水提液對(duì)實(shí)驗(yàn)型胃潰瘍的作用[J]. 菌物學(xué)報(bào), 2011, 30(2): 325-330.

[8] 任丹, 羅霞, 余夢(mèng)瑤, 等. 具有胃黏膜保護(hù)作用的羊肚菌菌株的篩選及液體發(fā)酵[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(17): 240-244.

[9] YU Mengyan, MA Bo, LUO Xia, et al. Molecular diversity of Auricularia polytricha revealed by inter-simple sequence repeat and sequence-related ampli ed polymorphism markers[J]. Current Microbiology, 2008, 56(3): 240-245.

[10] ZHENG Linyong, JIA Dinghong, FEI Xiaofan, et al. An assessment of the genetic diversity within Ganoderma strains with AFLP and ITS PCR-RFLP[J]. Microbiological Research, 2009, 164: 312-321.

[11] RICHARD S W. Cultural studies of Morchella elata[J]. Mycological Research, 2006, 110: 612-623.

[12] HIROTO Y, SATOSHI T, KAORU T, et al. Intracisternal injection of orexin-A prevents ethanol-induced gastric mucosal damage in rats[J]. Journal of Gastroenterol, 2007, 42: 336-341.

[13] 趙琪, 徐中志, 楊祝良, 等. 羊肚菌仿生栽培關(guān)鍵技術(shù)研究初報(bào)[J].菌物學(xué)報(bào), 2007, 26(增刊1): 360-363.

[14] 李素玲, 尚春樹(shù). 羊肚菌子實(shí)體培育研究初報(bào)[J]. 中國(guó)食用菌, 2000, 19(1): 8-10.

[15] 邢增濤, 孫芳芳, 劉景圣. 尖頂羊肚菌液體培養(yǎng)條件的研究[J]. 食用菌學(xué)報(bào), 2004, 11(4): 38-43.

[16] 李曉明, 趙嘉平, 唐周斌. 羊肚菌液體發(fā)酵的研究[J]. 西北林學(xué)院學(xué)報(bào), 2004, 19(3): 116-118.

[17] 王瑩, 樸美子, 孫永海. 基于遺傳算法的羊肚菌液體發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型的建立[J]. 生物工程學(xué)報(bào), 2008, 24(8): 1454-1457.

[18] 羅霞, 魏巍, 余夢(mèng)瑤, 等. 尖頂羊肚菌對(duì)急性酒精性胃黏膜損傷保護(hù)作用研究[J]. 菌物學(xué)報(bào), 2011, 30(2): 319-324.

[19] 鄭林用. 不同靈芝的遺傳特異性和藥效差異的比較研究[D]. 成都:四川大學(xué), 2008.

[20] WEI Wei, LUO Xia, ZHENG Linyong, et al. Isolation of a wild Morchella spp. strain and the effects of its extract on ethanol-induced gastric mucosal lesions in rats[J]. Zeitschrift für Naturforschung C, 2011, 66(1/2): 55-62.

Genetic Differences and Gastric Protective Effect of Morchella Strains

WEI Wei1, YU Meng-yao1, XU Xiao-yan1, JIANG Nan1, YE Li-ming2, LUO Xia1,*
(1. Celluar and Molecular Laboratory of Chinese Materia Medica, Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences, Chengdu 610041, China; 2. West China School of Pharmacy, Sichuan University, Chengdu 610041, China)

In this study, inter-simple sequence repeats (ISSR) molecular labeling technology was used to explore the genetic diversity of Morchella strains on the basis of mycelium biomass in submerged culture, and their gastric protective effects on ethanol-induced acute gastric mucosal injury model in mice were compared. Results showed that 16 Morchella strains were divided into two groups. The biomass of M1－M10 was higher than that of other strains, and the gastric protective effect of M1, M2 and M3 was better than that of other strains. Mycelium biomasses and gastric protective effects varied in different Morchella strains.

Morchella; inter-simple sequence repeats (ISSR); biomass; gastric protective effects

S567.3

A

1002-6630（2014）07-0160-04

10.7506/spkx1002-6630-201407032

2013-04-29

菌類(lèi)藥材研究與開(kāi)發(fā)四川省青年科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2011JTD0021）；四川省“十二五”省農(nóng)作物育種攻關(guān)項(xiàng)目（2011NZ0098-12-04）；四川省科技廳食藥用菌現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)鏈關(guān)鍵技術(shù)研究集成與產(chǎn)業(yè)化示范項(xiàng)目（2012NZ0003）；四川省精深加工研究崗位建設(shè)項(xiàng)目（川農(nóng)業(yè)（2009）75號(hào)）

魏巍（1982—），男，助理研究員，博士，主要從事食藥用菌的研究與開(kāi)發(fā)。E-mail：21822546@qq.com

*通信作者：羅霞（1974—），女，副研究員，博士，主要從事食藥用菌的研究與開(kāi)發(fā)。E-mail：lx1443_cn@163.com