陳曉平，房丹丹

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118）

Spinigerin α抗菌肽中試化發(fā)酵條件的研究

陳曉平，房丹丹

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118）

在已獲得Spinigerin α抗菌肽搖瓶發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上，對其在50 L發(fā)酵罐中的初始甘油質(zhì)量濃度、補(bǔ)料方式、甲醇與山梨 醇混合比例、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)pH值和誘導(dǎo)時間進(jìn)行優(yōu)化，并對誘導(dǎo)階段甲醇與山梨醇混合體積比、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)pH值進(jìn)行正交試驗(yàn)。結(jié)果表明：甘油初始質(zhì)量濃度10 g/L、補(bǔ)料方式為變速補(bǔ)料、甲醇與山梨醇混合體積比1∶1、誘導(dǎo)時間96 h、誘導(dǎo)溫度24℃、誘導(dǎo)pH 5.0。在此最佳發(fā)酵條件下，50 L發(fā)酵罐的Spinigerin α抗菌肽產(chǎn)量較搖瓶條件提高20%。

spinigerin α抗菌肽；中試化；發(fā)酵條件

抗菌肽是由生物細(xì)胞特定基因編碼，經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類具有抗菌活性的小分子多肽，大小一般在2～7 kD左右，氨基酸組成小于100個，具有廣譜殺菌、強(qiáng)堿性、水溶性和熱穩(wěn)定性好等特點(diǎn)[1]。目前抗菌肽的制備主要是通過提取法、化學(xué)合成法及基因工程法，然而根據(jù)其各種特點(diǎn)來說，基因工程表達(dá)是大量獲得抗菌肽的有效途徑。

S p i n i g e r i n抗菌肽是一種來源于白蟻（Pseudacanthotermes spiniger）的線性抗菌肽[1]，包括25個氨基酸。該抗菌肽中的一個含有18個氨基酸的α-螺旋結(jié)構(gòu)（Lys4至Leu21）保留了抗菌活性，本研究室將其命名為Spinigerin α，并已成功構(gòu)建成外分泌型重組表達(dá)載體pPICZaA-Spinigerin α，將其轉(zhuǎn)入GS115酵母菌體內(nèi)獲得重組菌GS115-S α。經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)，證實(shí)其上清液對大多革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌）以及部分革蘭氏陰性菌（大腸桿菌、志賀氏菌）具有明顯的抑菌活性。

由于抗菌肽具有廣泛的應(yīng)用價值[2]，已受到國內(nèi)外研究者的高度重視，而關(guān)于抗菌肽的研究也只局限于基因的克隆與表達(dá)，對于后期大批量生產(chǎn)還沒有相關(guān)報道。畢赤酵母（Pichia pastoris）是一種能高效表達(dá)外源蛋白的表達(dá)系統(tǒng)，具有遺傳穩(wěn)定、表達(dá)水平高、蛋白可翻譯后加工、產(chǎn)物可分泌、可高密度發(fā)酵等許多優(yōu)點(diǎn)[3-5]，且畢赤酵母不會因發(fā)酵產(chǎn)物的累積影響正常生長代謝，也易于從搖瓶培養(yǎng)擴(kuò)大到大批量高密度發(fā)酵，因此具有用于高密度發(fā)酵的巨大潛力。

中試工藝是連接研發(fā)和生產(chǎn)的重要平臺，是科技成果向生產(chǎn)力轉(zhuǎn)化的重要環(huán)節(jié)[6]。本研究在前期實(shí)驗(yàn)獲得搖瓶發(fā)酵最佳條件的基礎(chǔ)上，通過對Spinigerin α抗菌肽50 L發(fā)酵罐中試化發(fā)酵條件的研究[7-9]，旨在獲得Spinigerin α抗菌肽中試化最佳生產(chǎn)條件，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

重組Spinigerin α抗菌肽菌株由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供；金黃色葡萄球菌 本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

1.2 試劑

氨芐青霉素（ampicillin，Amp） 鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心；蛋白胨、酵母提取物、瓊脂 長春科隆公司；山梨醇、無氨基酵母氮源（yeast nitrogen base，YNB）培養(yǎng)基、Zeocin 美國Invitrogen公司；甘油、甲醇等其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 儀器與設(shè)備

－80℃超低溫冰箱 美國Thermo Forma公司；恒溫?fù)u床 哈爾濱東明醫(yī)療器械廠；PYX-DHS恒溫培養(yǎng)箱上海躍華醫(yī)療器械廠；AUY220電子天平 日本島津制作所；T6紫外-可見光分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SDJ-5L-50L/C 50 L發(fā)酵罐 上海聯(lián)環(huán)生物工程設(shè)備有限公司。

1.4 培養(yǎng)基

酵母蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）：酵母提取物1 g/100 mL、蛋白胨2 g/100 mL、葡萄糖2 g/100 mL（固體培養(yǎng)基加入2 g/100 mL瓊脂）。

1/4基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基（basic salt medium，BSM）：85% H3PO46.67 mL/L、CaSO4·2H2O 0.23 g/L、K2SO44.55 g/L、MgSO4·7H2O 3.72 g/L、KOH 1.03 g/L、甘油10 g/L，121℃、30 min高壓滅菌。

甘油補(bǔ)料培養(yǎng)基：體積分?jǐn)?shù)50%甘油、PTM1 4.35 mL/L。甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)基：體積分?jǐn)?shù)50%甲醇、PTM1 12 mL/L。山梨醇補(bǔ)料培養(yǎng)基：體積分?jǐn)?shù)5 0%山梨醇、PTM1 12 mL/L。

P T M 1微量元素：C u S O4·5 H2O 6.0 g/L、MgSO4·H2O 3.0 g/L、H3BO30.02 g/L、ZnCl220.0 g/L、生物素0.20 g/L、NaI 0.08 g/L、Na2MoO40.2 g/L、CoCl20.5 g/L、FeSO4·2H2O 65 g/L、H2SO45.0 mL/L，0.22 μm濾膜過濾除菌4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 方法

1.5.1 種子培養(yǎng)

一級種子培養(yǎng)：取－80℃凍存的菌種，劃YPD平板（每100 mL含100 μL Zeocin），28℃培養(yǎng)2 d直至長出單菌落，挑取單菌落至50 mL液體YPD培養(yǎng)基中，28℃、300 r/min振蕩培養(yǎng)18 h，得一級種子。

二級種子培養(yǎng)：將一級種子按體積分?jǐn)?shù)10%接種量接種到含有2 L YPD培養(yǎng)基的5 L種子罐中，28℃、300 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，得二級種子。

1.5.2 發(fā)酵罐培養(yǎng)

二級種子液培養(yǎng)至OD600nm在2～6時，按照8%接種量接種到含有20 L BSM培養(yǎng)基的50 L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，通入無菌空氣（15 L/min）調(diào)節(jié)溶氧20%以上，轉(zhuǎn)速650 r/min，誘導(dǎo)前溫度控制在28℃，通過補(bǔ)加25%氨水控制pH值為6.0；初始培養(yǎng)基中甘油耗盡時，溶氧會突然上升至80%左右，此時開始補(bǔ)加甘油進(jìn)入細(xì)胞增殖階段；細(xì)胞增殖20 h后進(jìn)入誘導(dǎo)階段，每12 h補(bǔ)加甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)，保持發(fā)酵液中甲醇終體積分?jǐn)?shù)為1%左右；整個發(fā)酵持續(xù)120 h，發(fā)酵結(jié)束后4℃、12 000 r/min離心10 min收集上清液備用。

1.5.3 菌液濃度測定

發(fā)酵開始后每12 h取發(fā)酵液，測定OD600nm值，以相同體積的培養(yǎng)基做空白對照。

1.5.4 表達(dá)產(chǎn)物抑菌活性檢測

將處于對數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌懸浮液100 ?L，均勻涂于LB固體培養(yǎng)基平板上，用滅菌打孔器（直徑3 mm）打孔，滴加50 ?L待測的發(fā)酵液上清，以同體積pPICZα A空載體轉(zhuǎn)化酵母表達(dá)蛋白為陰性對照，以50 ?L Amp（100 ?g/mL）為陽性對照。37℃培養(yǎng)過夜后測量抑菌直徑。

1.5.5 總蛋白質(zhì)含量測定

用Bradford 蛋白定量試劑盒分別測定發(fā)酵罐上清液中的總蛋白質(zhì)含量、搖瓶條件表達(dá)上清液總蛋白質(zhì)含量、pPICZα A空載體轉(zhuǎn)化酵母表達(dá)上清液總蛋白質(zhì)含量。

1.5.6 發(fā)酵條件優(yōu)化的單因素試驗(yàn)

1.5.6.1 初始發(fā)酵培養(yǎng)基中甘油質(zhì)量濃度

將BSM基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中的初始甘油質(zhì)量濃度分別設(shè)為5、10、20、35、55 g/L，其他條件按照1.5.2節(jié)，培養(yǎng)20 h測定菌體濃度，重復(fù)7次取平均值。

1.5.6.2 甘油補(bǔ)料方式

分批補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)開始后，溶氧突然上升說明初始發(fā)酵培養(yǎng)基中甘油耗盡，一次加入終質(zhì)量濃度為40 g/L甘油培養(yǎng)4 h和變速補(bǔ)加甘油培養(yǎng)4 h，第1小時補(bǔ)加5 g/L、第2小時增加到10 g/L、第3小時繼續(xù)補(bǔ)加10 g/L、第4小時減少到8 g/L，其他條件按照1.5.2節(jié)，補(bǔ)加結(jié)束后取發(fā)酵液測菌體濃度，重復(fù)7次取平均值。

1.5.6.3 甲醇補(bǔ)料方式

甘油補(bǔ)料結(jié)束后，饑餓0.5 h，進(jìn)入甲醇誘導(dǎo)階段，分別以下列3種方式添加甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)。方法1：每12 h補(bǔ)加一次甲醇使其終體積分?jǐn)?shù)為1.0%；方法2：先補(bǔ)加發(fā)酵液總體積0.5%的甲醇，當(dāng)該體積分?jǐn)?shù)甲醇消耗完后開始每小時補(bǔ)加6 g/L甲醇，20 h后將補(bǔ)加量提高到20 g/L，并維持至發(fā)酵結(jié)束；方法3：誘導(dǎo)初期開始每小時添加6 g/L甲醇，20 h后將補(bǔ)加量提高到20 g/L，并維持至發(fā)酵結(jié)束。通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和通氣量使溶氧量在20%以上，保證發(fā)酵結(jié)束后誘導(dǎo)所用甲醇體積分?jǐn)?shù)相同，其他條件按照1.5.2節(jié)，收集上清液做抑菌實(shí)驗(yàn)，重復(fù)7次取平均值。

1.5.6.4 甲醇與山梨醇混合體積比

誘導(dǎo)階段采用混合碳源進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，甲醇與山梨醇體積比分別設(shè)為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，其他條件按照1.5.2節(jié)，發(fā)酵結(jié)束后收集上清液做抑菌實(shí)驗(yàn)，重復(fù)7次取平均值。

1.5.6.5 誘導(dǎo)時間

誘導(dǎo)過程中，分別在24、48、72、96、120 h收集上清做抑菌實(shí)驗(yàn)，重復(fù)7次取平均值。

1.5.6.6 誘導(dǎo)溫度

甘油補(bǔ)料結(jié)束后，饑餓0.5 h，進(jìn)入甲醇誘導(dǎo)階段之前，將溫度分別設(shè)定為22、24、26、28、30 ℃，然后進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，其他條件按照1.5.2節(jié)，發(fā)酵結(jié)束后收集上清液做抑菌實(shí)驗(yàn)，重復(fù)7次取平均值。

1.5.6.7 誘導(dǎo)pH值

甘油補(bǔ)料結(jié)束后，饑餓0.5 h，進(jìn)入甲醇誘導(dǎo)階段之前，將pH值分別設(shè)定為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，然后進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，其他條件按照1.5.2節(jié)，發(fā)酵結(jié)束后收集上清液做抑菌實(shí)驗(yàn)，重復(fù)7次取平均值。

1.5.7 正交試驗(yàn)篩選最佳發(fā)酵條件

將單因素優(yōu)化的甲醇與山梨醇混合體積比例、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)pH值進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，以期獲得最佳誘導(dǎo)條件組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳發(fā)酵條件的單因素試驗(yàn)

2.1.1 初始發(fā)酵培養(yǎng)基中甘油質(zhì)量濃度對發(fā)酵初期菌體密度的影響

圖1 初始發(fā)酵培養(yǎng)基中甘油質(zhì)量濃度對發(fā)酵初期菌體密度的影響Fig.1 Effect of initial glycerol concentration in the fermentation medium on cell density

初始發(fā)酵培養(yǎng)基中甘油濃度對發(fā)酵初期菌體密度影響如圖1所示。初始培養(yǎng)基中甘油質(zhì)量濃度10 g/L時，甘油會很快耗盡，補(bǔ)料時間提前，對補(bǔ)料前的生長階段非常有利。所以如果能夠在后期甘油補(bǔ)料過程中控制適當(dāng)?shù)母视唾|(zhì)量濃度，可使培養(yǎng)基中的菌體一直保持較好的狀態(tài)，從而有效地縮短發(fā)酵時間，提高菌體密度。

2.1.2 不同甘油補(bǔ)料方式對發(fā)酵初期菌體密度的影響

圖2 不同甘油補(bǔ)料方式對發(fā)酵初期菌體密度影響Fig.2 Effect of glycerol-feeding methods on cell density

不同甘油補(bǔ)料方式對發(fā)酵初期菌體密度的影響如圖2所示。一次性補(bǔ)加甘油時菌體密度增長不如變速式補(bǔ)加甘油增長的快，原因可能是瞬間甘油過量改變了培養(yǎng)基中各組分的比例，使酵母生長環(huán)境改變較大，對菌體生長產(chǎn)生一定限制。而變速式補(bǔ)加甘油使發(fā)酵液中甘油質(zhì)量濃度一直維持在菌體最適生長濃度從而有利于菌體快速增長，在對數(shù)期達(dá)到較高的菌體密度，為后期誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的目的產(chǎn)物提供基礎(chǔ)。

2.1.3 甲醇補(bǔ)料方式對發(fā)酵后期產(chǎn)物的影響

圖3 甲醇補(bǔ)料方式對發(fā)酵后期產(chǎn)物影響Fig.3 Effect of methanol-feeding methods on the antibacterial activity of fermentation end-products

甲醇補(bǔ)料方式對發(fā)酵后期產(chǎn)物影響結(jié)果如圖3所示。方法2抗菌肽的表達(dá)量最高，甲醇是在畢赤酵母產(chǎn)抗菌肽的過程中既是碳源又是誘導(dǎo)物，甲醇的體積分?jǐn)?shù)及其補(bǔ)加方式對抗菌肽的表達(dá)影響很大，甲醇體積分?jǐn)?shù)過高會對細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，而甲醇體積分?jǐn)?shù)過低則不能有效誘導(dǎo)醇氧化酶啟動子AOX的轉(zhuǎn)錄。而方法2使甲醇一直維持在誘導(dǎo)最適濃度，這樣對對外源蛋白高效表達(dá)非常有利。所以甲醇最終補(bǔ)加方式選擇方法2。

2.1.4 甲醇與山梨醇混合比例對發(fā)酵后期產(chǎn)物的影響

甲醇與山梨醇混合比例對發(fā)酵后期產(chǎn)物影響研究結(jié)果如圖4所示。甲醇與山梨醇混合體積比為1∶1時，抑菌效果要高于其他混合比例，因此確定最佳甲醇與山梨醇混合體積比為1∶1。

圖4 甲醇與山梨醇混合體積比對發(fā)酵后期產(chǎn)物影響Fig.4 Effect of methanol/sorbitol ratio on the antibacterial activity of fermentation end-products

2.1.5 誘導(dǎo)時間對發(fā)酵后期產(chǎn)物影響

圖5 誘導(dǎo)時間對發(fā)酵后期產(chǎn)物影響Fig.5 Effect of induction duration on the antibacterial activity of fermentation end-products

誘導(dǎo)時間對發(fā)酵后期產(chǎn)物影響研究結(jié)果如圖5所示。誘導(dǎo)96 h抗菌肽表達(dá)量最高，之后隨誘導(dǎo)時間的增長抗菌肽表達(dá)量有所下降，可能是由于代謝產(chǎn)物積累，導(dǎo)致抗菌肽降解所致。因此確定抗菌肽的最佳誘導(dǎo)時間為96 h。

2.1.6 誘導(dǎo)溫度對發(fā)酵后期產(chǎn)物影響

圖6 誘導(dǎo)溫度對發(fā)酵后期產(chǎn)物影響Fig.6 Effect of induction temperature on the antibacterial activity of fermentation end-products

誘導(dǎo)溫度對發(fā)酵后期產(chǎn)物影響研究結(jié)果如圖6所示。誘導(dǎo)階段的溫度過高會使菌體過早衰老，發(fā)酵周期縮短，降低蛋白表達(dá)量和活性，28 ℃比30 ℃抗菌肽的表達(dá)量高，因此確定最佳誘導(dǎo)溫度為28 ℃。

2.1.7 誘導(dǎo)pH值對發(fā)酵后期產(chǎn)物影響

誘導(dǎo)pH值對發(fā)酵后期產(chǎn)物影響研究結(jié)果如圖7所示。pH值對菌體生長和誘導(dǎo)表達(dá)都會產(chǎn)生影響，尤其是誘導(dǎo)時的pH值，不僅會影響蛋白表達(dá)量和活性，而且會通過影響蛋白酶活性，來改變蛋白的降解程度，選擇誘導(dǎo)pH值為5.5，此時抗菌肽表達(dá)量最高。

圖7 誘導(dǎo)pH值對發(fā)酵后期產(chǎn)物影響Fig.7 Effect of induction pH on the antibacterial activity of fermentation end-products

2.2 最佳發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)正交試驗(yàn)優(yōu)化方案及結(jié)果如表1所示。從極差R可以看出，3個因素的影響大小依次為：A＞C＞B，最優(yōu)組合為：A1B3C3，即甲醇與山梨醇體積比為1∶1、誘導(dǎo)pH 5.0、誘導(dǎo)溫度24 ℃，此條件下誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗菌肽表達(dá)量最高。

表1 抗菌肽中試化發(fā)酵條件正交試驗(yàn)（L9（33）設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 1 Orthogonal array design L9 (33) and resullttss

2.3 表達(dá)產(chǎn)物抑菌活性

圖8 Spinigerin 對金黃色葡萄球菌的抑制作用Fig.8 Inhibitory effect of Spinigerin α on Staphylococcus aureus

發(fā)酵罐表達(dá)上清液與搖瓶發(fā)酵表達(dá)上清液對金黃色葡萄球菌抑菌作用結(jié)果如圖8所示。畢赤酵母可以從搖瓶水平擴(kuò)大到發(fā)酵罐培養(yǎng)，且通過本實(shí)驗(yàn)對發(fā)酵罐中幾個影響發(fā)酵的因素進(jìn)行優(yōu)化使其產(chǎn)量較搖瓶水平有所提高，陽性對照顯示Spinigerin α抗菌肽抑菌活性較同體積Amp強(qiáng)，陰性對照無抑菌活性，因此排除了除Spinigerin α抗菌肽其他成分的抑菌作用，說明后期應(yīng)用畢赤酵母表達(dá)抗菌肽只要將影響發(fā)酵條件的因素全部找到并且進(jìn)行優(yōu)化，相信畢赤酵母表達(dá)抗菌肽可以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

2.4 蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果

通過發(fā)酵罐最終獲得Spinigerin α抗菌肽19.2 mg/L，搖瓶條件下Spinigerin α抗菌肽為16 mg/L，發(fā)酵罐比搖瓶條件下表達(dá)量提高了20%，抑菌活性也明顯提高。

3 討 論

溶氧是酵母生長過程中最重要的營養(yǎng)成分之一，可直接影響酵母的生長和代謝[10-13]，同時溶氧在一定程度上也反映了培養(yǎng)基中碳源的消耗情況，為及時補(bǔ)加碳源提供依據(jù)，溶氧逐漸下降說明菌體生長消耗了氧氣，溶氧突然上升表明菌體營養(yǎng)缺乏，需要補(bǔ)加營養(yǎng)物質(zhì)，但溶氧過低過高都不適合酵母生長。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)選擇了溶氧控制在20%的培養(yǎng)條件，酵母生長正常。

Spinigerin α抗菌肽發(fā)酵過程概括起來包括兩大部分，一是菌體的增殖階段，二是誘導(dǎo)表達(dá)階段，而后者直接影響了目的產(chǎn)物的產(chǎn)量，周祥山[14]、Chauhan[15]、Zhu Taicheng[16]等采用在低溫條件下，山梨醇與甲醇混合誘導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)了β-甘露聚糖酶迄今為止最高產(chǎn)量6 336 U/mL。汪志浩[17]、Soyaslan[18]等通過優(yōu)化pH值證明，在pH值大于5.0時山梨醇消耗速率下降，而當(dāng)pH值為4.5時紅細(xì)胞生成素最高產(chǎn)量為0.16 g/L。因此本實(shí)驗(yàn)在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，對誘導(dǎo)階段甲醇與山梨醇混合體積比、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)pH值三者的綜合影響進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)研究。結(jié)合菌體增殖階段優(yōu)化得到的最優(yōu)條件，實(shí)現(xiàn)了Spinigerin α抗菌肽50 L規(guī)?；a(chǎn)。一般而言，提高發(fā)酵規(guī)模，發(fā)酵能力會有所下降，而本實(shí)驗(yàn)卻有所提高，考慮可能與發(fā)酵罐中可以準(zhǔn)確的控制溶氧﹑控制細(xì)胞增殖與誘導(dǎo)階段補(bǔ)料量和整個發(fā)酵過程中采用變溫與變pH值發(fā)酵有關(guān)。

近幾年研究發(fā)現(xiàn)在畢赤酵母表達(dá)體系中，山梨醇和甲醇的混合補(bǔ)料不但可以增加細(xì)胞密度縮短誘導(dǎo)時間，最重要的是可以提高外源蛋白的表達(dá)量。由于甘油混合誘導(dǎo)會抑制啟動子AOX1的活性，不利外源蛋白的表達(dá)，而山梨醇則不會因?yàn)槠浞e累而抑制AOX1的活力[19-20]，因此本實(shí)驗(yàn)直接選用山梨醇與甲醇混合補(bǔ)料進(jìn)行研究。

Spinigerin α抗菌肽中試化生產(chǎn)的最佳發(fā)酵條件為：8%接種量接入裝有20 L BSM基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基的50 L發(fā)酵罐中，溶氧20%，轉(zhuǎn)速650 r/min，誘導(dǎo)前溫度為28 ℃、pH值為6.0進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；初始培養(yǎng)基中甘油耗盡后，溶氧急劇上升至80%左右，開始補(bǔ)加甘油，第1小時補(bǔ)加5 g/L，第2小時增加到10 g/L，第3小時繼續(xù)補(bǔ)加10 g/L，第4小時減少到8 g/L；待甘油耗盡溶氧再次上升至80%左右，此時饑餓0.5 h以將發(fā)酵液中殘存的阻遏性碳源物質(zhì)（甘油和乙醇）消耗盡，進(jìn)入甲醇與山梨醇混合誘導(dǎo)階段；控制誘導(dǎo)溫度為24 ℃，pH值為5.0，先向培養(yǎng)基中加入終體積分?jǐn)?shù)為0.5%的甲醇，待初始甲醇耗盡，開始每小時補(bǔ)加甲醇與山梨醇（體積比1∶1）6 g/L維持此速度誘導(dǎo)4 h，使菌體適應(yīng)甲醇誘導(dǎo)，之后速度增加到20 g/L，整個發(fā)酵過程持續(xù)96 h。在此最佳發(fā)酵條件下，Spinigerin α抗菌肽的50 L發(fā)酵罐產(chǎn)量較搖瓶條件下提高20%。

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Optimization of Pilot-Scale Fermentation Conditions for the Production of Spinigerin α as an Antibacterial Peptide

CHEN Xiao-ping, FANG Dan-dan
(College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

In this study, various fermentation conditions for the production of the antibacterial peptide Spinigerin α in a 50-L fermentor, including initial glycerol concentration, feeding methods, methanol/sorbitol ratio, induction temperature, pH and time were optimized based on the previously established shake flask fermentation conditions. An orthogonal array design involving methanol/sorbitol ratio (V/V), induction temperature and pH was used. Results showed that the optimal pilot-scale fermentation conditions were 10 g/L initial glycerol concentration, feeding at variable speeds, 1:1 methanol/sorbitol ratio (V/V) and induction at 24 ℃ and pH 5.0 for 96 h. The yield of Spinigerin α in a 50 L fermentor under the optimized conditions was increased by 20% than under shake flask fermentation conditions.

the antibacterial peptide Spinigerin α; pilot scale; fermentation conditions

TQ92

A

1002-6630（2014）07-0138-05

10.7506/spkx1002-6630-201407028

2013-03-31

吉林省科技廳科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20060208）

陳曉平（1963—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)與功能食品。E-mail：837340652@qq.com