楊學(xué)山，王本啟，王正娟，楊佐青，李遠(yuǎn)玲，康延良

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

月桂酰氯修飾羊血超氧化物歧化酶工藝優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)

楊學(xué)山，王本啟，王正娟，楊佐青，李遠(yuǎn)玲，康延良

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

以羊血為材料獲得超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）酶液，采用月桂酰氯修飾SOD，在修飾溫度、修飾時(shí)間、月桂酰氯添加量和丙酮添加量的單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化工藝參數(shù)，并比較修飾酶與天然酶的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明：10 mL酶比活力為4 348.6 U/mg的SOD樣液在修飾溫度60 ℃、修飾時(shí)間30 min、月桂酰氯用量0.1 mL、丙酮添加量為酶液體積的1.5倍條件下充分反應(yīng)，所得修飾酶活力最強(qiáng)；修飾酶熱穩(wěn)定性、pH值耐受性、半衰期等均優(yōu)于天然酶。月桂酰氯可用于修飾性能較優(yōu)的羊血超氧化物歧化酶。

羊血SOD；月桂酰氯；修飾；酶活力

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是需氧生物體內(nèi)唯一的超氧陰離子自由基清除劑，在抗炎、抗衰老及防輻射等方面有廣泛的用途[1-2]。迄今為止人們已從細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物、藻類(lèi)、昆蟲(chóng)、魚(yú)類(lèi)、植物和哺乳動(dòng)物等生物體內(nèi)分離到SOD，不同生物體內(nèi)SOD含量和活性各不相同，其中以哺乳動(dòng)物血液中含量和活性最高[3]。甘肅省是是全國(guó)五大牧區(qū)之一，具有豐富的羊血資源，可作為開(kāi)發(fā)SOD的絕佳原料[4]。SOD可廣泛應(yīng)用于食品、美容、保健和醫(yī)藥等行業(yè)[5-6]，但在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，存在體外穩(wěn)定性差、半衰期短、口服時(shí)易受胃蛋白酶分解等缺點(diǎn)[7-9]，限制了SOD相關(guān)產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)。

化學(xué)修飾是提高酶分子穩(wěn)定性的有效方法之一，脂肪酸[10]、低分子肝素[11]、右旋糖酐[12]、牛血清白蛋白[13]、聚乙二醇[14]等修飾劑都曾用于豬血、牛血來(lái)源SOD的化學(xué)修飾，取得了較為滿意的結(jié)果，但對(duì)羊血SOD的化學(xué)修飾，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。月桂酰氯是月桂酸的活化分子，在弱堿性條件下可與SOD分子表面非活性部位的賴氨酸殘基共價(jià)結(jié)合，形成?；疭OD[15]。酰化所產(chǎn)生的空間障礙和靜電斥力阻礙了蛋白水解酶和其他抑制劑對(duì)SOD活性部位的攻擊，使SOD穩(wěn)定性提高[16]。本研究擬利用新鮮羊血，采用月桂酰氯對(duì)分離純化的天然SOD進(jìn)行修飾，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，以期建立較為高效的修飾方法，為促進(jìn)羊血SOD深度開(kāi)發(fā)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮羊血采自蘭州小西湖屠宰場(chǎng)。

牛血清白蛋白 美國(guó)Pharmacia公司；月桂酰氯（純度度≥98%，分子質(zhì)量218.77 D） 上海諾泰化工有限公司；TritonX-100、CuSO4、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、EDTA、鄰苯三酚、丙酮、氯仿、乙醇、檸檬酸鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SL-1001電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；TGL-166臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；PHS-3C pH計(jì) 上海雷磁有限公司；TU1800型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 羊血SOD提取工藝流程

以本實(shí)驗(yàn)室建立的分離提取工藝進(jìn)行羊血SOD分離純化[17]，工藝流程如下：

新鮮羊血→預(yù)處理→收集紅血球→溶血→去除血紅蛋白→丙酮沉淀→磷酸鹽緩沖液溶解→熱變性處理→透析→DEAE-Sephadex A-50柱層析→真空冷凍干燥→酶比活力測(cè)定

其中蛋白含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[18]，SOD活性采用鄰苯三酚法測(cè)定[19]。酶活力單位（U）定義為：在25 ℃時(shí)，1 mL反應(yīng)液中1 min抑制鄰苯三酚自氧化速率達(dá)50%的酶量定義為1個(gè)酶活力單位。酶比活力（U/mg）是指每毫克SOD蛋白所具備的酶活力。

1.3.2 SOD化學(xué)修飾工藝流程

SOD樣液→加月桂酰氯（1 mol/L NaOH維持pH 9.0）→攪拌→丙酮沉淀→抽濾、洗滌→酶比活力測(cè)定

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別對(duì)不同修飾溫度、修飾時(shí)間、月桂酰氯添加量和丙酮添加量進(jìn)行單因素試驗(yàn)，重復(fù)3次。以修飾酶比活力為指標(biāo)，為正交試驗(yàn)選擇因素水平。

1.3.3.1 修飾溫度對(duì)修飾SOD比活力的影響

取5組10 mL SOD酶液，各加月桂酰氯0.1 mL，分別置于40、45、50、55、60 ℃條件下，水浴振蕩60 min（滴加1 mol/L NaOH維持pH 9.0），再加入1.5倍體積冷丙酮，4 000 r/min離心15 min。計(jì)算修飾酶比活力。

1.3.3.2 修飾時(shí)間對(duì)修飾SOD比活力的影響

取5組10 mL SOD酶液，各加月桂酰氯0.1 mL，55 ℃水浴振蕩15、30、45、60、75 min（滴加1 mol/L NaOH維持pH 9.0），再加入1.5倍體積冷丙酮，4 000 r/min離心15 min。計(jì)算修飾酶比活力。

1.3.3.3 月桂酰氯添加量對(duì)修飾SOD比活力的影響

取5組10 mL SOD酶液，分別加入0.075、0.100、0.125、0.150、0.175 mL月桂酰氯，55 ℃水浴振蕩30 min（滴加1 mol/L NaOH維持pH 9.0），再加入1.5倍體積冷丙酮，4 000 r/min離心15 min。計(jì)算修飾酶比活力。

1.3.3.4 丙酮添加量對(duì)修飾后SOD比活力的影響

取5組10 mL SOD酶液，加入0.1 mL月桂酰氯，55 ℃水浴振蕩30 min（滴加1 mol/L NaOH維持pH 9.0），分別加入酶液體積0.75、1.00、1.25、1.50、1.75倍冷丙酮，4 000 r/min離心15 min。計(jì)算修飾酶比活力。

1.3.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定因素和水平，采用四因素三水平L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，計(jì)算月桂酰氯修飾SOD每一試驗(yàn)組合的酶比活力，重復(fù)3次。結(jié)果進(jìn)行直觀分析得到最優(yōu)組合，通過(guò)對(duì)最優(yōu)組合條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，確定月桂酰氯修飾SOD的最優(yōu)工藝。

1.3.5 修飾酶與天然酶穩(wěn)定性比較

1.3.5.1 溫度穩(wěn)定性

取天然酶和修飾酶各5組，分別在55、65、75、85、95 ℃條件下處理30 min，測(cè)定天然酶和修飾酶的相對(duì)酶活力（以起始酶活力為100%計(jì)）。重復(fù)3次。

1.3.5.2 pH值穩(wěn)定性

分別配制pH值為3、5、7、9、11的Tris-HCl緩沖液，取天然酶和修飾酶各5組，每組加入上述不同pH值溶液，室溫靜置1 h，測(cè)定其相對(duì)酶活力(以起始酶活力為100%計(jì))，比較修飾酶和天然酶的pH值穩(wěn)定性。重復(fù)3次。

1.3.5.3 半衰期測(cè)定

將同批次制備的天然酶和液態(tài)修飾酶貯于4 ℃，每隔4 d測(cè)其酶活力變化，重復(fù)3次。分別以第1天與第5天、第5天與第9天所得酶活力值代入下式計(jì)算半衰期[20]。

式中：t1/2為半衰期/d（即修飾酶活力下降為最初活力一半時(shí)所經(jīng)歷的連續(xù)工作時(shí)間）；E0為原始酶活力/（U/ mL）；t為時(shí)間/d；E為t時(shí)的酶活力/（U/ mL）。最后將所得t1/2求平均值，計(jì)算得修飾酶和天然酶的半衰期。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊血SOD分離純化

根據(jù)1.3.1節(jié)的方法，獲得羊血SOD提取液酶活力為861.1 U/ mL，蛋白含量為0.198 mg/mL，經(jīng)計(jì)算酶比活力為4 348.6 U/mg。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 修飾溫度對(duì)修飾SOD比活力的影響結(jié)果

圖1 修飾溫度對(duì)SOD比活力的影響Fig.1 Effect of modification temperature on SOD specific activity

由圖1可知，修飾溫度為55 ℃時(shí)SOD比活力最高，修飾效果最好，且和40、45、50、60 ℃之間在5%水平上差異顯著。45、50、60 ℃之間在5%水平上差異不顯著性，所以選擇55 ℃為SOD修飾的反應(yīng)溫度。SOD屬于蛋白質(zhì)，溫度較低時(shí)蛋白質(zhì)殘基與修飾劑的耦合不充分，溫度較高時(shí)修飾劑與氨基酸殘基耦合過(guò)多均導(dǎo)致酶比活力下降。

2.2.2 修飾時(shí)間對(duì)修飾SOD比活力的影響結(jié)果

圖2 修飾時(shí)間對(duì)SOD比活力的影響Fig.2 Effect of modification time on SOD specific activity

由圖2可知，修飾時(shí)間在15、60、75 min時(shí)差異不顯著；修飾時(shí)間30 min時(shí)所得到的SOD酶比活力最高，且與15、45、60、75 min之間在5%水平上有顯著性差異，所以應(yīng)選擇30 min為較佳修飾時(shí)間。當(dāng)溫度一定時(shí)，較短的修飾時(shí)間，月桂酰氯與SOD氨基酸殘基耦合不充分，而時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致月桂酰氯與SOD活性中心氨基酸殘基耦合導(dǎo)致SOD比活力下降。

2.2.3 月桂酰氯添加量對(duì)修飾SOD比活力的影響結(jié)果

圖3 月桂酰氯添加量對(duì)SOD比活力的影響Fig.3 Effect of lauroyl chloride dosage on SOD specific activity

由圖3可知，當(dāng)10 mL酶液中月桂酰氯用量為0.100 mL時(shí)，修飾后的SOD酶比活力最高，且和月桂酰氯的用量為0.075、0.125、0.150、0.175 mL之間在5%水平上差異顯著，而月桂酰氯的用量為0.075、0.125、0.150、0.175 mL之間在5%水平上差異不顯著。月桂酰氯作為SOD的修飾劑，用量過(guò)少會(huì)造成月桂酰氯與SOD氨基酸殘基耦合不充分；用量過(guò)多，對(duì)SOD活性中心與非活性中心氨基酸殘基均發(fā)生反應(yīng)，使SOD比活力下降。

2.2.4 丙酮添加量對(duì)修飾后SOD比活力的影響結(jié)果

圖4 丙酮添加量對(duì)SOD比活力的影響Fig.4 Effect of acetone dosage on SOD specific activity

由圖4可知，丙酮添加量為酶液體積的1.5倍時(shí)所沉淀的SOD修飾酶比活力最高，且和其他水平差異顯著。丙酮作為SOD的沉淀劑，體積分?jǐn)?shù)較小時(shí)，沉淀不完全，溶液中有游離SOD；體積分?jǐn)?shù)較大時(shí)，可將修飾液中其他雜蛋白充分沉淀，導(dǎo)致酶比活力下降。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

采用L9（34）試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化修飾羊血SOD工藝條件，結(jié)果如表1所示。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Design and results of L9((34) orthogonal array experimenttss

由表1極差值可知，影響月桂酸修飾SOD因素的主次順序?yàn)椋篈＞B＞C＞D。由K值可以確定月桂酸修飾SOD正交試驗(yàn)的最優(yōu)組合是A3B2C2D2，即確定的最優(yōu)工藝參數(shù)為修飾溫度60 ℃、修飾時(shí)間30 min、月桂酰氯用量0.1 mL/10 mL酶液、丙酮添加量為酶液體積的1.5倍。

用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，其結(jié)果如表2所示。因素A、B差異顯著P＜0.05，因素C、D不顯著，表明修飾溫度和修飾時(shí)間對(duì)本試驗(yàn)的影響較大。

表2 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 2 Analysis of variance for the experimental results of orthogonal array design

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由于最優(yōu)組合在L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中未出現(xiàn)，需對(duì)正交試驗(yàn)得到的最優(yōu)組合進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。在修飾溫度60 ℃、修飾時(shí)間30 min、月桂酰氯添加量0.1 mL/10 mL酶液、丙酮添加量為酶液體積的1.5倍條件下修飾SOD，重復(fù)3次。測(cè)得SOD修飾酶平均比活力為3 398.3 U/mg，活力保留率為78.1%，比正交試驗(yàn)中其它組合得到的酶比活力都高，可見(jiàn)其為正交試驗(yàn)確定的最佳工藝參數(shù)。

2.5 修飾酶與天然酶的穩(wěn)定性比較

2.5.1 酶的溫度穩(wěn)定性

圖5 修飾酶和天然酶對(duì)不同溫度穩(wěn)定性的比較Fig.5 Stability of modified and natural SOD at different temperatures

由圖5可知，在55 ℃以下時(shí)，修飾酶和天然酶的相對(duì)酶活力大致相同，隨著溫度逐漸升高至95 ℃，天然酶的相對(duì)酶活力急劇下降，低至10%，而修飾酶的相對(duì)活力下降幅度較小，仍在原來(lái)酶活力48%以上。

2.5.2 酶的pH值穩(wěn)定性

圖6 修飾酶和天然酶對(duì)不同pH值穩(wěn)定性的比較Fig.6 Stability of modified and natural SOD at different pHs

由圖6可知，修飾酶及天然酶的最適pH值均為7.0，隨著pH值的升高或減小，兩種酶活力都有所下降，但在極端酸堿條件下，修飾酶相對(duì)酶活力高達(dá)67.1%，而天然酶相對(duì)酶活力僅為35.4%。

2.5.3 修飾酶和天然酶半衰期測(cè)定

經(jīng)計(jì)算在4 ℃保存條件下，天然酶半衰期為4 d，修飾酶半衰期為141.5 d，比天然酶提高了137.5 d。

與天然SOD酶學(xué)性質(zhì)相比較，由于在修飾SOD過(guò)程中，月桂酰氯耦合在了SOD的非活性基團(tuán)上，在酸堿強(qiáng)度較大、溫度較高條件下不易影響SOD酶活性中心，從而使修飾酶活性保持較好的穩(wěn)定性。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以新鮮羊血中提取的SOD原料，根據(jù)不同單因素條件試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)月桂酰氯修飾羊血SOD的主要影響因素進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化，確定的最優(yōu)工藝參數(shù)為10 mL酶比活力為4 348.6 U/mg的SOD樣液、修飾溫度60 ℃、修飾時(shí)間30 min、月桂酰氯用量0.1 mL、丙酮添加量為酶液體積的1.5倍，在此條件下修飾SOD，所得SOD平均比活力為3 398.3 U/mg。

天然酶與修飾酶理化性質(zhì)測(cè)定結(jié)果表明：SOD經(jīng)月桂酸修飾后熱穩(wěn)定性、pH值耐受性、半衰期等均優(yōu)于天然酶。月桂酰氯酸修飾SOD擴(kuò)展了SOD的實(shí)用價(jià)值，有利于它在食品、日化及藥物等方面的實(shí)際應(yīng)用。

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Optimized Preparation and Enzymatic Characterization of Lauroyl Chloride Modified SOD from Sheep Blood

YANG Xue-shan, WANG Ben-qi, WANG Zheng-juan, YANG Zuo-qing, LI Yuan-ling, KANG Yan-liang
(College of Life Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

The process condition for modifying SOD from sheep blood by lauroyl chloride was explored. Four experimental parameters including reaction temperature, reaction time and the amounts of lauroyl chloride and acetone added to SOD solution were investigated by one-factor-at-a-time experiments and optimized by orthogonal array design. The highest enzyme activity was observed for SOD with a specific activity of 4 348.6 U/mg in a 10 mL aqueous solution when modified by reaction with 0.1 mL of lauroyl chloride and 15 mL of acetone for 30 minutes at 60 ℃. The modified SOD exhibited improved heat stability, pH tolerance and half-life compared to the intact one. Therefore, lauroyl chloride can be used to modify sheep blood SOD for better enzymatic performance.

sheep blood SOD; lauroyl chloride; modification; enzyme activity

TS251.9

A

1002-6630（2014）07-0128-04

10.7506/spkx1002-6630-201407026

2013-04-12

甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究與應(yīng)用開(kāi)發(fā)項(xiàng)目（GNSW-2010-03）；甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生科研訓(xùn)練計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（20120803）

楊學(xué)山（1977—），男，副教授，碩士，主要從事生物化學(xué)與生物制品開(kāi)發(fā)研究。E-mail：yangxs@gsau.edu.cn