周曉春，王靜鳳，胡世偉，石 迪，薛長湖*

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003）

冰島刺參巖藻糖基化硫酸軟骨素對高脂飲食誘導的糖尿病小鼠腎臟的保護作用

周曉春，王靜鳳，胡世偉，石 迪，薛長湖*

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003）

目的：研究冰島刺參巖藻糖基化硫酸軟骨素（fucolysated chondroitin sulfate from Cucumaria frondosa，Cf-CHS）對高脂飲食誘導的糖尿病小鼠腎臟的保護作用。方法：以高脂高糖飼料飼喂誘導Ⅱ型糖尿病小鼠模型，飼喂含不同劑量Cf-CHS的高脂高糖飼料連續(xù)19 周，檢測空腹血糖并收集尿液，分別檢測小鼠尿液中尿糖、微量白蛋白（microalbumin，mAlb）、尿總蛋白、尿素氮（urea nitrogen，UN）、尿酸（uric acid，UA）、肌酐（creatinine，Cr）濃度和β-N-乙酰葡萄糖苷酶（N-acetyl-β-glucosaminidase，NAG）排泄率，摘取腎臟觀察腎臟組織的顯微結(jié)構(gòu)。結(jié)果：Cf-CHS可顯著降低糖尿病小鼠的尿糖、mAlb、尿總蛋白、UN、UA、Cr濃度和NAG排泄率（P＜0.01），改善腎臟組織的顯微結(jié)構(gòu)。結(jié)論：Cf-CHS可顯著改善糖尿病小鼠的腎臟功能。

糖尿病腎??；冰島刺參；巖藻糖基化硫酸軟骨素；尿蛋白；β-N-乙酰葡萄糖苷酶；腎臟保護

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是常見的糖尿病微血管并發(fā)癥[1]，最終引起腎小球病變，目前已成為導致糖尿病患者死亡的主要原因之一。海參是傳統(tǒng)的珍貴滋補品，海參多糖是海參體壁的主要成分之一，包括巖藻糖基化硫酸軟骨素（fucolysated chondroitin sulfate，CHS）和海參巖藻聚糖硫酸酯兩類[2-3]。其中CHS是一種帶巖藻糖支鏈的酸性黏多糖，糖鏈上有部分羥基發(fā)生硫酸酯化（硫酸酯基類含量在32%左右）[4]。

研究發(fā)現(xiàn)，海參CHS具有抗凝血[5]、抗血栓[6-7]和抗腫瘤[8-9]等生理活性，對神經(jīng)細胞、黏膜細胞、腎細胞等具有保護作用，且活性很大程度上與巖藻糖支鏈含量和硫酸基取代情況相關(guān)[9-11]。冰島刺參（Cucumaria frondosa）是產(chǎn)于冰島水域的深海野生海參，產(chǎn)量大，價格低廉，本課題組前期對不同種類海參體壁的CHS含量及單糖組成進行了分析比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以冰島刺參為主的寒帶海參體壁含有豐富的CHS，巖藻糖含量較高[4]，提示其可能具有生理活性。Hu Shiwei等[12]以冰島刺參巖藻糖基化CHS（Cf-CHS）為研究對象，發(fā)現(xiàn)其可以明顯改善Ⅱ型糖尿病小鼠的糖代謝。故本實驗觀察Cf-CHS對糖尿病并發(fā)癥——糖尿病腎病有無影響，探討其對以高脂高糖飼料誘導的糖尿病小鼠腎臟的保護作用，以期進一步發(fā)掘冰島刺參的營養(yǎng)保健作用，為其高值化利用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

冰島刺參干品，購于青島市水產(chǎn)品市場。

1.2 動物

C57BL/6J小鼠，雄性，體質(zhì)量19～21 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2009-0007。

1.3 試劑

羅格列酮（rosiglitizone，RSG） 美國Sigma公司；氯化十六烷基吡啶（cetylpyridinium chloride，CPC） 生工生物工程（上海）股份有限公司；葡萄糖試劑盒 北京中生北控生物科技股份有限公司；肌酐（creatinine，Cr）、尿素氮（urea nitrogen，UN）、尿酸（uric acid，UA）、β-N-乙酰葡萄糖苷酶（N-acetyl-βglucosaminidase，NAG）測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；尿微量白蛋白（microalbuminuria，mAlb）測定試劑盒 上海太陽生物技術(shù)有限公司；蘇木精 上海藍季科學發(fā)展有限公司；醇溶性伊紅 上海試劑三廠。

1.4 儀器與設備

Model680型酶標儀 美國Bio-Rad公司；GL-20M型高速冷凍離心機 上海盧湘離心機儀器有限公司；ALPHA 1-4 LO型凍干機 德國Christ公司；LABOROTA 4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國Heidolph公司；1100型高效液相色譜儀 美國Agilent公司；TSK-gel G4000 PWxl色譜柱 Tosoh Bioscience公司；BH-2型顯微鏡、DP72型顯微照相系統(tǒng) 日本Olympus公司。

1.5 方法

1.5.1 Cf-CHS的制備和檢測

參照文獻[4]制備Cf-CHS。干冰島刺參粉碎，丙酮浸泡脫脂 24 h，室溫晾干。向干物中（以下提取步驟均以1 g干物計算）加入100 mg木瓜蛋白酶，60 ℃水浴條件下攪拌反應24 h，離心得上清。向上清液中加入1.6 mL質(zhì)量分數(shù)10% 的CPC溶液，室溫靜置24 h后離心，棄上清。沉淀溶解于15 mL 3 mol/L NaCl-乙醇（100∶15，V/V）溶液中，4 ℃靜置24 h，離心棄沉淀。向上清液中加入20 mL體積分數(shù)95%乙醇溶液繼續(xù)沉淀。棄上清，蒸餾水溶解沉淀，用截留分子質(zhì)量為10 kD的透析袋透析脫鹽，濃縮，凍干，得海參粗多糖。粗多糖過DEAE-52陰離子交換柱，以0～1.4 mol/L NaCl緩沖鹽溶液連續(xù)梯度洗脫，每7 mL收集一管。洗脫液過液相TSK4000柱檢測組分單一的管，收集后透析，凍干，得Cf-CHS純品。本課題組前期研究顯示，Cf-CHS分子質(zhì)量為14.76 kD，主要由葡萄糖醛酸、氨基半乳糖和巖藻糖3 種單糖組成，且三者的物質(zhì)的量比為1.00∶1.50∶1.16，其硫酸根含量為31.07%[11]。

1.5.2 動物分組及模型建立

C57BL/6雄性小鼠，4～5 周齡，適應性喂養(yǎng)7 d，隨機分成正常對照組、模型對照組、陽性對照組、純品Cf-CHS組、低劑量Cf-CHS+RSG組和高劑量Cf-CHS+RSG組。正常對照組飼喂正常飼料，其他組喂高糖高脂飼料。飼料配方參照美國營養(yǎng)學會1993年頒布的嚙齒類實驗動物純化飼料標準（American Institute of Nutrition-93 purified diets for laboratory rodents，AIN-93）。正常飼料中不含糖類，蛋白質(zhì)和脂肪分別占20%和5%，能量3.85 kcal/g；高糖高脂飼料糖類、蛋白質(zhì)和脂肪的相對含量分別為20%、20%和25%，能量4.85 kcal/g。陽性對照組、純品Cf-CHS組、低劑量Cf-CHS+RSG組和高劑量Cf-CHS+RSG組飼料中分別以體質(zhì)量為基礎添加RSG（1 mg/（kg?d））、Cf-CHS（80 mg/（kg?d））、Cf-CHS+RSG（20 mg/（kg?d）+1 mg/（kg?d））和Cf-CHS+RSG（80 mg/（kg?d）+1 mg/（kg?d））。喂養(yǎng)期間，每月尾靜脈取血檢測各組小鼠的空腹血糖，每組3 只。第18周檢測數(shù)據(jù)顯示不同組小鼠的空腹血糖出現(xiàn)顯著性差異，提示造模成功。連續(xù)喂養(yǎng)19 周后收集標本。實驗期間小鼠自由進食、飲水，每天記錄攝食量，每3 d記錄小鼠體質(zhì)量。

1.5.3 標本收集

小鼠代謝籠單只適應24 h后，收集24 h 尿液，離心分裝，4 ℃保存待測。小鼠末次給藥后禁食不禁水5 h，尾靜脈取血10 μL，參照試劑盒離心并測定血糖水平。

1.5.4 尿糖濃度的測定

參照試劑盒說明書測定。

1.5.5 尿mAlb、總蛋白含量的測定

尿總蛋白含量的測定采用雙縮脲法；尿mAlb含量的測定參照試劑盒說明書進行。

1.5.6 尿Cr、UN、UA含量的測定

參照試劑盒說明書測定。

1.5.7 尿NAG排泄率的測定

參照試劑盒說明書測定尿NAG濃度。尿NAG排泄率為尿NAG濃度與24 h尿量的乘積。

1.5.8 腎臟組織的顯微觀察

小鼠脫頸椎處死，迅速摘取雙腎，將腎皮質(zhì)小塊置于10%的中性甲醛中固定24 h，脫水、透明、常規(guī)石蠟包埋、切片、染色后，于光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS11.0軟件進行單因素方差分析，同時進行最小顯著差異（least significant difference，LSD）兩兩比較。以P＜0.05為差異顯著。實驗結(jié)果均以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cf-CHS對糖尿病小鼠空腹血糖和尿糖濃度的影響

表1 Cf-CHS對糖尿病小鼠空腹血糖和尿糖濃度影響（x ± s，n=10）Table 1 Effect off Cf-CHS on the levels of fasting blood glucose and urinary glucose (x ± s, n =10)

血糖升高和尿糖是糖尿病的主要臨床癥狀之一。如表1所示，模型對照組小鼠的血糖和尿糖濃度顯著均高于正常對照組（P＜0.01），提示所造糖尿病小鼠模型成功。喂食含Cf-CHS的高脂飼料后，相對于模型對照組，3個實驗組的血糖濃度和尿糖濃度均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。其中，純品Cf-CHS小鼠的尿糖濃度降低了27.8%，低劑量Cf-CHS+RSG組和高劑量Cf-CHS+RSG組分別降低了33.1%和45.6%。表明Cf-CHS具有與陽性藥物類似的效果，可以顯著改善糖尿病小鼠的尿糖癥狀。

2.2 Cf-CHS對糖尿病小鼠尿mAlb和總蛋白含量的影響

表 22 CCff-CHS對糖尿病小鼠mAlb、總蛋白、Cr、UN和UA含量的影響（x± s，n=10）Table 2 Effect of Cf-CHS on the levels of mAlb, total protein, Cr, UN, and UA in urine (x ± s,n=10)

尿mAlb及總蛋白是糖尿病腎臟病變的診斷指標，反映腎小球的濾過功能[13]。如表2所示，相比正常對照組，模型對照組小鼠的尿mAlb和總蛋白含量顯著升高（P＜0.01），表明小鼠出現(xiàn)了腎臟病變。相對于模型對照組，喂食Cf-CHS的純品組、低劑量Cf-CHS+RSG組和高劑量Cf-CHS+RSG組小鼠的尿mAlb含量分別降低了37.3%、41.6%和52.6%（P＜0.01），總蛋白含量分別降低了18.8%、23.9%和35.3%（P＜0.01）。與陽性對照組相比，復配高劑量組降低尿總蛋白含量的作用更顯著，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。表明Cf-CHS可以顯著抑制糖尿病小鼠尿微量白蛋白的排出，降低尿總蛋白的排出量，對糖尿病腎病有一定治療作用，并且Cf-CHS可以協(xié)同增加RSG的降尿總蛋白作用效果。

2.3 Cf-CHS對糖尿病小鼠尿Cr、UN、UA含量的影響

Cr、UN和UA分別為體內(nèi)肌酸、蛋白質(zhì)和嘌呤代謝產(chǎn)物，3 種物質(zhì)均經(jīng)腎小球濾過后隨尿排出，是反映腎小球受損的靈敏指標[14]。由表2可知，模型對照組小鼠尿液中三者的水平均顯著升高（P＜0.01），反映其腎小球已受損。與模型對照組相比，3 個實驗組的尿Cr、UN和 UA水平均顯著降低（P＜0.01）。其中，純品組、低劑量Cf-CHS+RSG組和高劑量Cf-CHS+RSG組的尿Cr含量分別下降了31.3%、29.1%和44.6%，UN含量分別下降了33.0%、45.0%和53.5%，UA含量分別下降了8.0%、26.6%和30.1%。與陽性對照組相比，Cf-CHS與RSG復配后降尿Cr、UN的作用顯著，表明Cf-CHS有一定修復腎小球損傷的作用，且與RSG有一定的協(xié)同作用。

2.4 Cf-CHS對糖尿病小鼠NAG排泄率的影響

圖 11 CCff-CHS對糖尿病小鼠NAG排泄率的影響（x± s，n=10）Fig.1 Effect of Cf-CHS on the excretion amount of NAG in urine of diabetic mice (x ± s,n=10)

NAG是來自腎近端曲小管溶酶體水解酶，當腎小管細胞受損時尿NAG活性顯著升高，反映腎小管早期損傷[15]。由圖1可知，模型對照組的NAG排泄率比正常對照組顯著升高，有極顯著性差異（P＜0.01）。飼喂含Cf-CHS的高脂高糖飼料后，與模型對照組相比，純品Cf-CHS組、低劑量Cf-CHS+RSG組和高劑量Cf-CHS+RSG組的NAG排泄率均有所降低，分別降低了13.7%、45.3%和59.1%，作用效果極顯著（P＜0.01）。復配高劑量組比陽性對照組效果更優(yōu)，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。提示Cf-CHS能夠降低糖尿病小鼠的尿NAG活性，抑制NAG排出，改善糖尿病腎病引起的腎小管損傷，與RSG復配后效果更顯著。

2.5 Cf-CHS對糖尿病小鼠腎臟組織顯微結(jié)構(gòu)的影響

圖2 2 CfCf-CHS對糖尿病小鼠腎臟組織形態(tài)學的影響（HE染色，×400）400Fig.2 Effect of Cf-CHS on kidney microstructure of diabetic mice (HE stain, ×400)

如圖2所示，光鏡下正常對照組小鼠腎小球外形飽滿規(guī)則，腎小囊邊界清晰，腎小管結(jié)構(gòu)正常；模型對照組小鼠的腎小囊變窄，腎小球體積增大。以Cf-CHS干預后，3 個實驗組小鼠的腎小球和腎小囊病變程度較模型組明顯減輕，其中，高劑量Cf-CHS+RSG組小鼠的腎臟組織接近正常。

3 討 論

糖尿病腎病是最嚴重最常見的糖尿病并發(fā)癥之一，主要臨床特征有尿蛋白和腎功能受損，特征性的病理改變是腎小球系膜區(qū)無細胞性增寬和腎小球基底膜彌漫性增厚，漸至腎小球硬化和肥大，末期腎功能衰竭[16-17]。DN的檢測以尿指標為主，因尿液成分可以直接反映血液成分的變化和腎臟對血液的濾過能力。尿糖是尿液中糖含量的總稱，只有當血糖很高時才能形成尿糖，而高血糖對糖尿病病人腎臟發(fā)生病變至關(guān)重要[18]。因此檢測尿糖水平可以了解糖尿病的嚴重程度和發(fā)生腎病的危險。DN的主要診斷指標有尿mAlb、總蛋白、UN、Cr、UA和NAG等，其中尿mAlb、總蛋白、UN、Cr和UA是反映腎小球受損的指標，NAG反映腎小管受損程度[19]。而尿蛋白還對腎小球系膜有毒性作用，損害腎小管間質(zhì)等[14-15]。

本實驗以高脂高糖飼料飼喂小鼠以誘導Ⅱ型糖尿病模型，通過檢測尿糖、尿mAlb、總蛋白、UN、Cr、UA和NAG等，綜合評價糖尿病小鼠糖尿病和腎臟病變的嚴重程度。結(jié)果顯示，模型對照組小鼠各項尿指標水平都顯著升高，造模成功。飼喂含Cf-CHS飼料可顯著降低尿液中糖、mAlb、總蛋白、UN、Cr、UA和NAG的水平，說明Cf-CHS可以有效抑制尿糖、尿蛋白和NAG等的排出，對糖尿病引起的腎臟病變有一定的修復作用。與糖尿病常規(guī)治療藥物RSG復配后，降低效果更為顯著，提示Cf-CHS與RSG有一定的協(xié)同效應，進一步促進RSG對Ⅱ型糖尿病引起的腎臟變的修復作用。

糖尿病腎病的發(fā)生是多因素綜合作用的結(jié)果，包括糖代謝異常、腎臟血流動力學的改變和多種細胞因子的作用[15]。本研究中的冰島刺參硫酸軟骨素富含巖藻糖支鏈，研究表明，巖藻糖分支結(jié)構(gòu)與CHS的多種生物學活性相關(guān)，其特異性的空間排列是CHS抗凝活性的基礎，還與抗血栓、降血脂、促進臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖和移位、促進血管再生和抑癌活性等密切相關(guān)[9,16,20]。本研究結(jié)果顯示，冰島刺參巖藻糖基化硫酸軟骨素可促進糖尿病腎病引起的腎細胞損傷的修復，可能與可改善糖尿病小鼠的高血糖癥狀，降低某些引起腎小球和腎小管病變的關(guān)鍵細胞因子的表達等有關(guān)，具體作用機制還需進一步實驗探討。

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Protective Effect of Fucolysated Chondroitin Sulfate from the Sea Cucumber Cucumaria frondosa on Kidney of High Fat Diet-Induced Diabetic Mice

ZHOU Xiao-chun, WANG Jing-feng, HU Shi-wei, SHI Di, XUE Chang-hu*
(College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Objective: In this study, the protective effect of fucolysated chondroitin sulfate from the sea cucumber Cucumaria frondosa (Cf-CHS) on kidney was accessed in high fat diet-(HFD) induced diabetic mice. Methods: To establish diabetic models, mice were fed with HFD. The diabetic mice were administered with different doses of Cf-CHS daily for 19 weeks. Urine was collected to analyze the levels of glucose, microalbumin (mAlb), total protein, urea nitrogen (UN), uric acid (UA), creatinine (Cr) and the excretion of N-acetyl-β-glucosaminidase (NAG). Kidney tissue was collected to make microscope slides. Results: Cf-CHS could significantly (P ＜ 0.01) decrease the levels of glucose, mAlb, total UN, UA, Cr, and NAG in urine and observably improve kidney tissue of diabetic mice. Conclusion: Cf-CHS has a remarkably protective effect on kidney of diabetic mice.

diabetes mellitus; Cucumaria frondosa; fucolysated chondroitin sulfate(CHS); urine protein; N-acetyl-βglucosaminidase(NAG); kidney protection

R285.5

A

1002-6630（2014）13-0236-04

10.7506/spkx1002-6630-201413046

2013-08-29

公益性行業(yè)（海洋）科研專項（2011CX80201）；山東省自主創(chuàng)新專項（2012CX80201）；國家自然科學基金面上項目（31371876）

周曉春（1989—），女，碩士，研究方向為海洋生物活性物質(zhì)。E-mail：yyaimeishi@163.com

*通信作者：薛長湖（1964—），男，教授，博士，研究方向為水產(chǎn)品加工。E-mail：xuech@ouc.edu.cn