郭培培，郭卓雨，趙艷萌，高麗萍*

（北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點實驗室，北京 100083）

葡萄籽原花青素對順鉑導(dǎo)致H9c2細胞毒性的保護作用

郭培培，郭卓雨，趙艷萌，高麗萍*

（北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點實驗室，北京 100083）

目的：研究葡萄籽原花青素對順鉑誘導(dǎo)大鼠H9c2心肌細胞損傷的影響并探討其可能機理。方法：體外培養(yǎng)H9c2細胞，噻唑藍法測定葡萄籽原花青素、順鉑對H9c2細胞生長的影響及葡萄籽原花青素對順鉑所致H9c2細胞毒性的影響，觀察細胞的形態(tài)變化，并通過檢測H9c2細胞及培養(yǎng)液中超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量研究其可能機理。結(jié)果：葡萄籽原花青素能明顯改善順鉑所致H9c2細胞形態(tài)變化，并抑制順鉑所致H9c2細胞及培養(yǎng)液中超氧化物歧化酶活性的降低、丙二醛含量的升高。結(jié)論：體外培養(yǎng)條件下葡萄籽原花青素能改善順鉑誘導(dǎo)的H9c2細胞的損傷，其作用機制可能與調(diào)高H9c2細胞的抗氧化能力有關(guān)。

葡萄籽原花青素；順鉑；H9c2細胞；抗氧化

順鉑（cis-diamminedichloroplatinum，CDDP）是臨床上腫瘤治療中常用的化療藥物之一，但隨著使用劑量增加，其毒負效應(yīng)也隨之增多，腎毒性是其主要負效應(yīng)，有研究報道CDDP治療一般也伴隨心臟毒性[1]，CDDP和其他抗癌藥物聯(lián)合使用常會引起嚴重的心肌病。多種研究表明CDDP的毒負效應(yīng)和氧化應(yīng)激有密切的關(guān)系[2-6]。原花青素是一種廣泛存在于植物界的多酚類化合物，主要位于植物的籽、皮、核部位[7-8]，近半個世紀以來人們對從多種植物中提取的原花青素開展了大量研究，尤以葡萄籽原花青素（grape seed proanthocyanidin extract，GSPE）的研發(fā)工作進行地最為深入和廣泛。迄今為止，相關(guān)研究人員已經(jīng)從葡萄的籽和皮中分離、鑒定出了20余種類的原花青素，實驗證實其在體內(nèi)的抗氧化能力是VE的50倍、VC的20倍，強抗氧化能力使得原花青素這一天然、無毒、安全、高效的物質(zhì)受到人們的廣泛關(guān)注及重視[9]；此外，原花青素被發(fā)現(xiàn)具有抗疲勞、抗衰老、抗病毒、抗腫瘤、降血脂、降血壓、健腦益智、改善免疫功能等多種生理活性[10-16]，如今以原花青素為主要成分的保健食品風(fēng)靡全球；原花青素還被作為防腐劑用于食品工業(yè)中以延長食品貨架期，在普通的食品配料、添加劑中也有應(yīng)用以達到強化營養(yǎng)的功效。

GSPE因富含酚羥基而具有較強的自由基清除能力，可以拮抗各種原因所致氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而發(fā)揮強抗氧化活性[12]。本實驗利用CDDP誘導(dǎo)H9c2細胞產(chǎn)生損傷，研究GSPE對CDDP誘導(dǎo)心肌細胞損傷的影響，并從氧化應(yīng)激角度探討其可能機理，相關(guān)研究報道較為少見，以期為開發(fā)新型GSPE保健食品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

H9c2細胞購自中國科學(xué)院細胞中心。

CDDP （注射用粉劑） 齊魯制藥公司；GSPE（純度≥95%） 天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司；新生牛血清 美國Gibico公司；Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium（DMEM）培養(yǎng)液 美國Hycolon公司；噻唑藍、胰酶、雙抗 美國Sigma公司；Bicinchonininc acid（BCA）蛋白濃度測定試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及藥物處理

H9c2心肌細胞常規(guī)培養(yǎng)于含有20%新生胎牛血清和含有1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱環(huán)境為37 ℃、含5%CO2，飽和濕度。待細胞融合至80%～90%時傳代，每隔2 d換一次培養(yǎng)基，每4～5 d傳代1次，取對數(shù)生長期細胞接種于培養(yǎng)瓶中。CDDP用生理鹽水溶解配制溶液，GSPE用雙蒸水溶解配制溶液，使用培養(yǎng)基稀釋到所需濃度[2]。

1.2.2 細胞活力實驗

1.2.2.1 CDDP對H9c2細胞生長的影響

將100 ?L細胞密度為1.5×105個/mL的H9c2細胞懸液接種到96孔板中，待細胞生長到融合狀態(tài)，加入終質(zhì)量濃度分別為0、20、40、60、80、160 ?g/mL的CDDP，每組設(shè)5個復(fù)孔，培養(yǎng)箱孵育24 h，后加入噻唑藍使其終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，繼續(xù)孵育4 h，棄上清加二甲基亞砜200 ?L/孔，適當(dāng)混勻570 nm波長處檢測吸光度（A），以CDDP終濃度為0孔作為空白對照孔，按式（1）計算細胞抑制率，由此確定CDDP誘導(dǎo)H9c2細胞損傷模型的最佳使用濃度。

1.2.2.2 GSPE對H9c2細胞生長的影響

處理方法同上，GSPE終質(zhì)量濃度依次為：0、25、50、80、100、120 ?g/mL，按式（2）計算細胞生長存活率，由此確定GSPE保護H9c2細胞的最佳濃度。

1.2.2.3 GSPE對CDDP誘導(dǎo)H9c2細胞毒性的影響

實驗分為空白對照組、CDDP模型組、GSPE保護組1（GSPE 80 ?g/mL）、GSPE保護組2（GSPE 100 ?g/mL）。處理方法同上，加入CDDP前30 min加入GSPE，藥物組加藥時其他相應(yīng)組加入同體積的生理鹽水或雙蒸水。計算細胞生長存活率。

1.2.3 細胞形態(tài)觀察

實驗分組同1.2.2.3節(jié)，使用倒置顯微鏡取像，觀察CDDP對H9c2細胞形態(tài)的影響及GSPE對CDDP誘導(dǎo)H9c2細胞形態(tài)改變的影響。

1.2.4 H9c2細胞蛋白含量測定及MDA含量、SOD活力測定

實驗分組、細胞培養(yǎng)同上，待藥物處理結(jié)束，收集細胞培養(yǎng)液，消化細胞并收集，后磷酸鹽緩沖液洗兩遍，離心棄上清，使用細胞裂解液（含苯甲基磺酰氟）進行低溫裂解30 min，后進行凍解（－80 ℃、15 min，37 ℃、5 min，連續(xù)3次），12000 r/min離心10 min，取上清按照試劑盒測定SOD活力、MDA含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 結(jié)果與分析

2.1 CDDP對H9c2細胞生長的影響

圖1 CDDP對H9c2細胞生長的影響Fig.1 Effect of CDDP on the survival of H9c2 cells

由圖1可見，與空白對照組比較，隨CDDP質(zhì)量濃度升高，細胞生長抑制率逐漸升高，CDDP質(zhì)量終濃度為60 μg/mL時細胞生長率為44/%，接近半數(shù)致死質(zhì)量濃度，選此作為造模質(zhì)量濃度。

2.2 GSPE對H9c2細胞存活率的影響

由圖2可見，與空白對照組比較，隨GSPE終質(zhì)量濃度的提高，細胞存活率先升高后下降，以80、100、120 ?g/mL的GSPE質(zhì)量濃度效果最為明顯，選此作為保護組質(zhì)量濃度。

圖2 GSPE對H9c2細胞生長的影響Fig.2 Effect of GSPE on the survival of H9c2 cells

2.3 GSPE對CDDP誘導(dǎo)H9c2細胞毒性的影響

圖3 GSPE對CDDP誘導(dǎo)H9c2細胞毒性的影響Fig.3 Effect of GSPE on CDDP-induced toxicity in H9c2 cells

由圖3可知，CDDP模型組與空白對照組相比細胞存活率明顯下降，80、100 ?g/mL的GSPE能使CDDP誘導(dǎo)的細胞存活率下降明顯提升（P＜0.05），選二者質(zhì)量濃度作為保護質(zhì)量濃度分別為GSPE1、GSPE2進行后續(xù)實驗。

2.4 GSPE對CDDP誘導(dǎo)細胞形態(tài)變化的影響

圖4 GSPE對CDDP誘導(dǎo)細胞形態(tài)變化的影響（×20）Fig.4 Effect of GSPE on CDDP-induced morphologic change of H9c2 cells (×20)

由圖4可知，CDDP可明顯誘導(dǎo)細胞形態(tài)變化，導(dǎo)致細胞由正常梭形、貼壁、密集狀態(tài)變?yōu)槠?、聚團、稀疏甚至自溶狀態(tài)，而GSPE保護組可以改善CDDP引起的漂浮、聚團、自溶情況。

2.5 GSPE對CDDP誘導(dǎo)的H9c2細胞MDA含量變化的影響

圖5 GSPE對CDDP誘導(dǎo)的H9c2細胞培養(yǎng)液MDA含量變化的影響Fig.5 Effect of GSPE on CDDP-induced changes in MDA content of H9c2 cell culture medium

圖6 GSPE對CDDP誘導(dǎo)的H9c2細胞中MDA含量變化的影響Fig.6 Effect of GSPE on CDDP-induced changes in MDA content of H9c2 cells

由圖5、6可知，CDDP可引起細胞內(nèi)MDA含量的升高，而GSPE可以對其產(chǎn)生拮抗即使得CDDP誘導(dǎo)的細胞MDA含量的升高下降，且這種拮抗作用效果明顯（P＜0.05），尤以80 μg/mL的GSPE效果較為明顯。

2.6 GSPE對CDDP誘導(dǎo)的H9c2細胞SOD活性變化的影響

圖7 GSPE對CDDP誘導(dǎo)的H9c2細胞培養(yǎng)液中SOD活性變化的影響Fig.7 Effect of GSPE on CDDP-induced changes in SOD activity of H9c2 cell culture medium

圖8 GSPE對CDDP誘導(dǎo)的H9c2細胞中SOD活性變化的影響Fig.8 Effect of GSPE on CDDP-induced changes in SOD activity of H9c2 cells

由圖7、8可知，CDDP模型組與空白對照組相比較，細胞、細胞培養(yǎng)液中SOD活性都明顯下降，GSPE保護組能使CDDP誘導(dǎo)的SOD活性的下降明顯提升（P＜0.05），80 μg/mLGSPE的保護效果較為明顯。

3 討 論

CDDP自用于癌癥治療以來表現(xiàn)出廣泛的抗癌活性[17-19]且療效顯著，然而同時伴隨多種毒副效應(yīng)[19-21]，相關(guān)研究證實了氧化應(yīng)激在CDDP所致毒負效應(yīng)中的重要性，該藥可以引起活性氧類物質(zhì)的產(chǎn)生如超氧化物陰離子自由基、羥自由基等[22]。近年來各種方法用于減輕CDDP導(dǎo)致的毒負效應(yīng)，其中抗氧化物質(zhì)的效果良好，本實驗就從抗氧化能力較強的葡萄籽原花青素著手研究了其在順鉑誘導(dǎo)心肌細胞損傷中的影響。

自由基是機體代謝的一種中間產(chǎn)物，有強氧化性且能產(chǎn)生連鎖反應(yīng)對機體造成損傷，同時使細胞代謝受到影響甚至導(dǎo)致細胞凋亡[23]，在化療藥物導(dǎo)致的心臟繼發(fā)性損害中它是一個重要成因，可以引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)導(dǎo)致心肌細胞膜的損傷、破壞其完整性[24]。MDA作為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的一種重要代謝產(chǎn)物，其含量增加量與膜損傷的嚴重程度有關(guān)，可用于間接判斷氧自由基對細胞造成的損傷。本實驗結(jié)果中CDDP模型組細胞中MDA含量明顯增加，說明CDDP使心肌組織中的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)加強導(dǎo)致了心臟毒性，細胞培養(yǎng)基中MDA含量也明顯升高這提示CDDP誘發(fā)的自由基破壞了細胞膜的完整性使得MDA透過細胞膜發(fā)生了外滲；GSPE使MDA含量明顯下降，說明GSPE可以通過抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的作用發(fā)揮心肌細胞的保護功能，這與使用噻唑藍法“觀察GSPE對CDDP誘導(dǎo)細胞損傷的影響”結(jié)果一致，即在CDDP模型組細胞存活率明顯下降而GSPE保護組細胞存活率明顯提升（P＜0.05）。SOD是生物體內(nèi)的一種天然抗氧化酶，可以清除自由基提高機體的抵抗能力，若機體活性氧增多，該物質(zhì)會因消耗而使自身活性下降，進而降低機體的抗氧化能力[25]。實驗中CDDP模型組細胞SOD活性明顯下降，可能是CDDP進入機體后誘發(fā)產(chǎn)生自由基，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強及自由基引發(fā)的連鎖反應(yīng)進一步產(chǎn)生了新的自由基，消耗大量SOD并使其活性下降，細胞膜的不完整性使得SOD破膜外滲，這一現(xiàn)象在細胞培養(yǎng)液也可以觀察得到，機體的抗氧化能力下降，進一步引發(fā)CDDP對機體的損傷；使用GSPE后細胞SOD活性明顯提升，表明GSPE一方面具有較強的抗氧化能力，一方面可與SOD協(xié)同提高了機體抗氧化體系的抗氧化能力，阻礙了CDDP誘發(fā)的自由基對機體的氧化侵襲。

本研究表明GSPE可以拮抗CDDP引發(fā)的氧化應(yīng)激效應(yīng)、減輕CDDP誘導(dǎo)的心肌細胞損傷，這與前人研究的氧化應(yīng)激在CDDP毒副作用中的重要性結(jié)論一致。為GSPE應(yīng)用于臨床以提高CDDP的療效、為腫瘤治療患者提供潛在的醫(yī)用鋪助品或營養(yǎng)保健品提供了理論依據(jù)，同時有助于變廢為寶、充分開發(fā)葡萄籽的實用價值，創(chuàng)造潛在的社會收益和經(jīng)濟收益。對于CDDP的心肌細胞毒性產(chǎn)生機制及GSPE產(chǎn)生的拮抗作用是否有其他機制參與，有待進一步研究。

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Protective Effect of GSPE on Cisplatin-Induced Nephrotoxicity in H9c2 Cells

GUO Pei-pei, GUO Zhuo-yu, ZHAO Yan-meng, GAO Li-ping*
(Beijing Municipal Key Laboratory of Biological Active Substance and Functional Food, College of Arts and Sciences, Beijing Union University, Beijing 100083, China)

Aim: To explore the effect of grape seed proanthocyanidin extract (GSPE) on cis-diamminedichloroplatinum (CDDP)-induced damage in H9c2 cells and its mechanism. Methods: H9c2 cells were cultured in vitro. The effects of CDDP individually and in combination with GSPE on the growth of H9c2 cells were determined by MTT method. Meanwhile, the morp hologic change of the cells was observed. SOD activity and MDA content in both cells and medium were determined to explore its mechanism. Results: GSPE could improve CDDP-induced morphologic change and suppress the decrease in SOD activity as well as the increase in MDA content in H9c2 cells and culture solutions. Conclusion: GSPE can ameliorate CDDP-induced damage in H9c2 cells in vitro. Its mechanism may be correlated with increased antioxidant capacity in H9c2 cells.

GSPE; cis-diamminedichloroplatinum; H9c2 cells; antioxidant

R318.0

A

1002-6630（2014）03-0213-04

10.7506/spkx1002-6630-201403043

2013-02-23

北京聯(lián)合大學(xué)人才強校計劃人才資助項目（20111101）

郭培培（1987—），女，碩士研究生，研究方向為功能性食品生化作用。E-mail：guopeipei29@126.com

*通信作者：高麗萍（1962—），女，教授，博士，研究方向為功能性食品生化作用。E-mail：gaolip62@163.com