欒春艷，李曉玲,*，鄭國斌，姚 娟，王 健

（1.三峽大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，湖北 宜昌 443002；2.安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443003）

23株釀酒酵母ISSR指紋圖譜分析及SCAR標(biāo)記的建立

欒春艷1，李曉玲1,*，鄭國斌2，姚 娟2，王 健2

（1.三峽大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，湖北 宜昌 443002；2.安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443003）

目的：構(gòu)建釀酒酵母菌株的簡單重復(fù)序列間多態(tài)性指紋圖譜數(shù)據(jù)庫并建立序列特異性擴(kuò)增區(qū)（sequence characterized amplifi ed region，SCAR）標(biāo)記技術(shù)，為釀酒酵母菌株的分類、遺傳親緣關(guān)系鑒定及菌種專利保護(hù)提供可靠的DNA分子標(biāo)記技術(shù)依據(jù)。方法：在簡單重復(fù)序列間多態(tài)性（inter-simple sequence repeat，ISSR）指紋數(shù)據(jù)分析基礎(chǔ)上進(jìn)行聚類分析并對菌種進(jìn)行分類鑒定，同時將釀酒酵母菌株9號和15號中擴(kuò)增獲得的ISSR特異性DNA帶轉(zhuǎn)化為可以直接用于菌株快速鑒定的SCAR分子標(biāo)記。結(jié)果：構(gòu)建23株釀酒酵母的ISSR指紋圖譜，并在相似系數(shù)為0.85水平上將23個供試菌株分為3大類，其中，1、2、4、7、15、16、17、19、20、21、23聚為第一類；10、11、12、13、14、18號菌株聚為第二類且10號和11號菌為同一菌株；3、5、6、8、9、22號菌聚為第三類且屬于同一菌株。此外，利用所獲得的2個特異性條帶成功轉(zhuǎn)化為序列特異性擴(kuò)增區(qū)分子標(biāo)記。結(jié)論：在生產(chǎn)上釀酒酵母菌株遺傳背景差異不大，常存在同物異名現(xiàn)象，而采用ISSR指紋及其SCAR分子標(biāo)記技術(shù)快速鑒定釀酒酵母菌株在工業(yè)生產(chǎn)上具有重要意義。

釀酒酵母菌；簡單重復(fù)序列間多態(tài)性；DNA指紋圖譜；序列特異性擴(kuò)增區(qū)

酵母菌是一類單細(xì)胞真菌，在自然界分布廣泛，目前已知的酵母菌有1 000多種，主要生長在偏酸性潮濕的含糖環(huán)境中，如水果、蔬菜、蜜餞的內(nèi)部和表面以及果園土壤中[1]。酵母菌除了應(yīng)用于食品生產(chǎn)（如酒精飲料、醬油、食醋、饅頭和面包的發(fā)酵等）中，其本身也具有很高的營養(yǎng)價值，除了蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂類以外，酵母還富含多種維生素、礦物質(zhì)和酶類[1]。在發(fā)酵生產(chǎn)過程中，隨著發(fā)酵環(huán)境的改變，有些酵母菌可能會發(fā)生變異退化而影響食品安全，有必要對食品生產(chǎn)、加工、保鮮和貯藏過程中酵母菌株的種屬進(jìn)行鑒定，以確定食品中哪些酵母菌是有益的，哪些是有害的，以及確定有著特定發(fā)酵特性的酵母菌是何種屬。因此，快速準(zhǔn)確的鑒定酵母菌種、分析發(fā)酵液遺傳多樣性、篩選有利菌種、對發(fā)酵過程進(jìn)行有效控制，既可以提高產(chǎn)品質(zhì)量，又能提高產(chǎn)量，增加經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義。

傳統(tǒng)的酵母菌鑒定一般要通過形態(tài)觀察和生理生化實驗，但這些表型性狀只反映了很有限的遺傳信息。由于酵母菌生長過程受到很多因素的控制，各種不同菌種之間生理生化差異不顯著，而且同種菌株在鑒別時的結(jié)果也不穩(wěn)定，常常導(dǎo)致鑒別出現(xiàn)誤差。這些不足之處使傳統(tǒng)的鑒定方法的應(yīng)用受到了很大的限制。因此，有必要用快速、簡單和可靠的鑒定方法確定酵母菌的種屬。

近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和各項新技術(shù)的廣泛應(yīng)用，酵母菌分類鑒定工作有了飛速發(fā)展。為了彌補(bǔ)分類方法的不足，新的技術(shù)和方法不斷地被引入酵母菌的分類研究中。其中核糖體DNA序列分析[2-3]、脈沖電場凝膠電泳技術(shù)[4]、染色體DNA的限制性片段長度多態(tài)性分析（restriction fragment length polymorphisma，RFLP）[5-6]、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）[7]、微衛(wèi)星多態(tài)性分析（simple sequence repeat，SSR）[8]、基于隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）建立菌株的序列特異性擴(kuò)增區(qū)（sequence characterized amplifi ed region，SCAR）[9]等方法開始廣泛應(yīng)用于不同酵母菌種的快速、準(zhǔn)確的鑒定中。而簡單重復(fù)序列間多態(tài)性（intersimple sequence repeat，ISSR）分子標(biāo)記技術(shù)兼具SSR、RAPD、RFLP、AFLP等分子標(biāo)記的優(yōu)點，與SSR相比，ISSR不需要預(yù)先獲知序列信息而使成本降低，且多態(tài)性更豐富；與RAPD相比，ISSR不僅具備RAPD的簡便、易操作等特點，且具有較高的重復(fù)性和穩(wěn)定性；與RFLP、AFLP相比，ISSR更快捷、成本較低、DNA用量小、安全性較高?；诨蚪M差異的ISSR及SCAR 等分子標(biāo)記技術(shù)已被應(yīng)用于葡萄座腔菌、黑粉菌株和土壤芽孢桿菌等[10-13]以及一些植物和真菌[14-20]的遺傳多樣性分析、指紋圖譜構(gòu)建以及菌株鑒定等方面，但尚未見應(yīng)用于酵母菌種的遺傳多樣性分析、指紋圖譜構(gòu)建及快速分類鑒定的報道。本研究以安琪酵母股份有限公司菌株保藏中心保藏的23株酵母菌為研究對象，構(gòu)建菌株ISSR分子標(biāo)記指紋圖譜并建立菌株的特異性SCAR標(biāo)記，為酵母菌的遺傳親緣關(guān)系分析和菌種分類鑒定提供分子生物技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

采用安琪酵母股份有限公司菌種保藏中心保藏的酵母菌，這些菌株是不同生產(chǎn)批次所保存的菌株和本實驗室針對不同的產(chǎn)品需求從自然界中篩選的菌株，主要用于釀酒生產(chǎn)中，分別編號為1～23，采用YPD培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)活化。

1.2 酵母菌基因組的DNA提取

取新鮮培養(yǎng)的酵母菌體，使用北京三博遠(yuǎn)志酵母基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）提取酵母基因組DNA。

1.3 ISSR多態(tài)性分析

引物參照哥倫比亞大學(xué)提供的序列（UBC801～UBC900），以部分供試菌DNA為模板，篩選出能擴(kuò)增出清晰條帶且條帶具有多態(tài)性的23條引物進(jìn)行ISSR分析，如表1所示。PCR反應(yīng)體系（總體積25 μL）：DNA 150 ng，Taq DNA 聚合酶1 U，10×PCR Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，20.0 mmol/L引物各0.5 μL，剩余體積用無菌水補(bǔ)齊。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s、52 ℃退火45 s、72 ℃延伸90 s、30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖于100 V電壓下電泳，在含有0.5 μg/mL溴化乙錠溶液中染色20～30 min，蒸餾水洗滌2～3次后在凝膠成像系統(tǒng)上觀察、拍照記錄。

表1 篩選出的ISSR引物擴(kuò)增出的總條帶數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)Table 1 The total bands and the polymorphic bands amplified with the screened ISSR primers

1.4 聚類分析和DNA指紋圖譜構(gòu)建

用所選出的23條引物對23個樣品基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。同一引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物，在同一位點上，有擴(kuò)增條帶為陽性，記錄為1；沒有條帶為陰性，記錄為0。從上到下逐條記錄，轉(zhuǎn)換成0、1矩陣，輸入Excel表格中，用NTSYS-pc聚類分析軟件進(jìn)行非加權(quán)組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）聚類分析，構(gòu)建23個菌株的聚類樹狀圖，并選擇穩(wěn)定的 ISSR多態(tài)性標(biāo)記譜帶用于構(gòu)建供試菌株的ISSR 指紋圖譜。

1.5 ISSR特異片段的回收 、克隆及測序

采用Biomiga的瓊脂糖凝膠回收純化試劑盒進(jìn)行特異條帶DNA的回收，純化后參照pMD18-T Vector（TaKaRa D101A）試劑盒說明書進(jìn)行連接實驗，轉(zhuǎn)化于E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取適合的菌落進(jìn)行PCR檢測，反應(yīng)體系及其擴(kuò)增程序與1.3節(jié)ISSR分析相同。檢測成功的樣品經(jīng)過含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中活化送北京鼎科公司測序。

1.6 SCAR分析

根據(jù)ISSR特異性條帶測序結(jié)果，應(yīng)用引物設(shè)計軟件Primer Premier5.0設(shè)計SCAR 標(biāo)記引物對，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物對。采用設(shè)計的特異性引物對23個菌株進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，驗證SCAR標(biāo)記。SCAR標(biāo)記的PCR 反應(yīng)體系：總體積25 μL，DNA 150 ng，Taq DNA聚合酶1 U，10×PCR Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL ，20.0 mmol/L正反引物各0.5 μL，剩余體積用無菌水補(bǔ)齊。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR擴(kuò)增多態(tài)性分析

從100條引物中篩選出23條有多態(tài)性的引物，23條引物共擴(kuò)增出條帶數(shù)351，其中多態(tài)性條帶數(shù)263，多態(tài)性比率66.7%（UBC 807）～93.9%（UBC 896），平均為74.9%。不同引物擴(kuò)增的總條帶數(shù)和多態(tài)性帶數(shù)有一定的差異，23條引物表現(xiàn)出較高的多態(tài)性。引物827和896的多態(tài)性比率最高為93.8%，引物817的多態(tài)性比率最低為54.5%。

2.2 ISSR聚類分析

根據(jù)ISSR標(biāo)記的擴(kuò)增結(jié)果，應(yīng)用NTSYS軟件對23個菌株進(jìn)行聚類分析，得到的聚類圖如圖1所示。在相似系數(shù)為0.85水平上將23個供試菌株分為三大類。其中，1、4、2、7、15、16、19、20、17、21、23號菌株聚為第一類；10、11、12、13、14、18號菌株聚為第二類；3、5、6、8、9、22號菌聚為第三類。其中第一大類又分為兩個亞類，一個亞類是1、4、2、7；另一個亞類是15、16、19、20、17、21、23。此外，從聚類分析結(jié)果也可看出10、11號菌株在100%水平聚為一類，可能為同一菌株；同樣的3、5、6、8、9、22號菌在100%水平聚為第三類，說明它們的遺傳背景相同，也可能為同一菌株。

圖1 ISSR聚類分析圖Fig.1 Dendrogram based on ISSR cluster analysis of the 23 S. cerevisiae strains

2.3 ISSR指紋圖譜的構(gòu)建

從100個引物中選擇23個多態(tài)性標(biāo)記譜帶，依次排序，用來構(gòu)建23個供試菌株ISSR指紋圖譜，如表2所示。

表2 釀酒酵母23個菌株的計算機(jī)指紋圖譜Table 2 Computerized ISSR fi ngerprinti ng of the 23 S. cerevisiae

表2 釀酒酵母23個菌株的計算機(jī)指紋圖譜Table 2 Computerized ISSR fi ngerprinti ng of the 23 S. cerevisiae

菌株編號 計算機(jī)化指紋圖譜 菌株編號 計算機(jī)化指紋圖譜1 00000001000101100010010 13 00001010000000110000100 2 00001000100001000010010 14 00000000000001010000100 3 11110100110010001101001 15 00000001001101000010010 4 00001000000101100000000 16 00010001001101000010010 5 11110100110010001101001 17 00000000001101000110000 6 11110100110010001101001 18 00000010000100100100010 7 00000001000101100010000 19 00000001001101100110010 8 11110100110010001101001 20 00000011001101100110010 9 11110100110010001101001 21 00000001001101000110010 10 00010000000101100000000 22 11110100110010001101001 11 00010000000101100000000 23 00000001001101010110010 12 00000010000000110000100

2.4 SCAR標(biāo)記的建立

對23個ISSR引物的擴(kuò)增圖進(jìn)行分析，已經(jīng)確定3、5、6、8、9、22號菌株具有相同的擴(kuò)增帶型，可視為同一個菌株，因此找尋特異性條帶是將以上6個菌株歸為同一種菌株，且以9號菌為代表。在所有擴(kuò)增圖中初步確定有2個特異性的DNA條帶，分別出現(xiàn)在引物UBC855對9號菌株的擴(kuò)增條帶中（圖2，箭頭所示）和引物UBC827對15號菌株的擴(kuò)增條帶中（圖3，箭頭所示）。

用1.0%的瓊脂糖膠檢測所回收2個菌株特異性DNA帶。根據(jù)DNA片段大小，初步判斷檢測到的DNA條帶正是所需的目標(biāo)DNA。通過菌落PCR電泳檢測并挑取有效克隆的菌體，分別進(jìn)行測序。據(jù)所測出的完整序列，應(yīng)用引物設(shè)計軟件Primer Premier 5.0設(shè)計相應(yīng)2對特異性引物，分別編號為S9-1和S9-2；S15-1和S15-2，其序列分別為：5’-TCCAGGTGGTATCGCTTAT-3’，5’-A G T T C T G C T C C A A T C G T G-3’；5’-C C A C G C T C A T T A T T T G T T-3’，5’-GGCTACTTATGCCATTCC-3’。用所設(shè)計的4對引物對23個菌株的總DNA進(jìn)行擴(kuò)增獲得預(yù)期結(jié)果：特異性引物只對特定的菌株有唯一的1條擴(kuò)增帶，通過比對大小可確定為所期望的目標(biāo)條帶，而在其他供試菌株中均無相應(yīng)的擴(kuò)增帶（圖4、5），這表明ISSR標(biāo)記已成功轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記。

圖2 引物UBC855對23個菌株的ISSR擴(kuò)增檢測結(jié)果Fig.2 The amplification results of the 23 S. cerevisiae strains by primer UBC855

圖3 引物UBC827對23個菌株的ISSR擴(kuò)增檢測結(jié)果Fig.3 The amplification results of the 23 S.cerevisiae strains by primer UBC827

圖4 引物對S9-1和S9-2對23個菌株的特異檢測結(jié)果Fig.4 The specificity of the primer pairs S3-1 and S3-2 for the 23 strains of S. cerevisiae

圖5 引物對S15-1和S15-2對23個菌株的特異檢測結(jié)果Fig. 5 The specificity of the primer pairs S15-1 and S15-2 for 23 S.cerevisiae strains

3 討 論

本研究采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對23個釀酒酵母菌株進(jìn)行指紋圖譜構(gòu)建，并進(jìn)行了聚類分析，結(jié)果表明23個菌株的遺傳背景相似度高，可能和選育過程中親本來源含有共有的骨干親本有關(guān)。此外，還鑒別出3、5、6、8、9和22號這6個菌株為同一菌株，10、11號菌為同一菌株，可能是同株不同名，當(dāng)然還需要結(jié)合其他分子標(biāo)記和表型形狀數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析確定，這些菌株是否真正是異名同株，或者是在菌株運輸、保存及使用過程中發(fā)生菌株混淆。

SCAR標(biāo)記是在RAPD技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。SCAR標(biāo)記是將目標(biāo)RAPD片段進(jìn)行克隆并對其末端測序，根據(jù)RAPD片段兩端序列設(shè)計特異引物，對基因DNA 片段再進(jìn)行PCR特異擴(kuò)增，把與原RAPD片段相對應(yīng)的單一位點鑒別出來。SCAR標(biāo)記是共顯性遺傳，待檢DNA 間的差異可直接通過有無擴(kuò)增產(chǎn)物來顯示。SCAR標(biāo)記方便、快捷、可靠，可以快速檢測大量個體，結(jié)果穩(wěn)定性好，重現(xiàn)性高等特點。2001年，Hermosa等[13]報道用SCAR標(biāo)記可對木霉菌種進(jìn)行鑒定，2005年吳學(xué)謙等[21]報道用SCAR標(biāo)記快速準(zhǔn)確地鑒定香菇菌株的真?zhèn)巍?011年，SCAR標(biāo)記方法在酵母菌株鑒定中也開始得到應(yīng)用，Wang Pinmei等[22]通過RAPD分析得到了用于酵母菌株鑒定的SCAR標(biāo)記。本實驗在構(gòu)建23個釀酒酵母菌株ISSR指紋圖譜的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步構(gòu)建9號和15號菌株的ISSRSCAR標(biāo)記。9號和15號菌株是生產(chǎn)中常用的釀酒酵母菌株，在高滲環(huán)境下具有較強(qiáng)的耐高滲能力。在工業(yè)生產(chǎn)中使用耐高滲能力強(qiáng)的菌種會極大地提高生產(chǎn)效率。因此篩選并鑒定耐高滲能力強(qiáng)的菌株已成為酵母菌種選育的一個重要方向。因此基于ISSR指紋圖譜的基礎(chǔ)上本實驗重點構(gòu)建9號和15號菌株的ISSR-SCAR，分別選取9號和15號菌株的特異性條帶回收、克隆及測序，然后設(shè)計特異性引物對23個菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，出現(xiàn)了目標(biāo)條帶，這表明ISSR標(biāo)記已成功轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記。

實際上本實驗中共找到了6個特異性條帶，但其中成功轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記的只有2個。雖然SCAR標(biāo)記可以由RAPD，ISSR等標(biāo)記轉(zhuǎn)化而來，但這個轉(zhuǎn)化過程確實相當(dāng)復(fù)雜，本實驗中轉(zhuǎn)化率只有33%。轉(zhuǎn)化失敗的原因可能是回收純化，引物設(shè)計或退火溫度沒有控制好等。在檢測SCAR標(biāo)記的過程中出現(xiàn)了所設(shè)計的特異性引物可以對多個菌株進(jìn)行擴(kuò)增的情況，可能是這些菌株的親緣關(guān)系太近造成的。SCAR標(biāo)記需要在較高的退火溫度下實現(xiàn)特異擴(kuò)增，一般比其Tm值高2～5 ℃，此外，特異引物的采用也排除了隨機(jī)引物結(jié)合位點之間的競爭，穩(wěn)定性和可重復(fù)性顯著提高，使得SCAR標(biāo)記的結(jié)果更加可靠。ISSR標(biāo)記本就具有較高的重復(fù)性，再加上SCAR標(biāo)記的快速、簡便、低廉的特點，通過大量ISSR引物篩選獲得每個菌株的特異 SCAR 標(biāo)記。本研究建立的SCAR標(biāo)記技術(shù)體系可有效區(qū)分目標(biāo)菌株和其他菌株，再結(jié)合本實驗室的脈沖電場凝膠電泳技術(shù)（另文發(fā)表），可以多技術(shù)互補(bǔ)，建立準(zhǔn)確高效的酵母鑒定體系，為酵母菌種的專利保護(hù)、遺傳育種、菌種改良和工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用奠定強(qiáng)有力的技術(shù)基礎(chǔ)。

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ISSR Fingerprint Analysis and SCAR Marker of 23 Strains of Saccharomyces cerevisiae

LUAN Chun-yan1, LI Xiao-ling1,*, ZHENG Guo-bin2, YAO Juan2, WANG Jian2
(1. College of Chemistry and Life Science, China Three Gorges University, Yichang 443002, China; 2. Angel Yeast Co. Ltd., Yichang 443003, China)

Objective: To construct inter-simple sequence repeat (ISSR) DNA fi ngerprinting database of Saccharomyces cerevisiae and to establish corresponding specifi c sequence characterized amplifi ed region (SCAR) markers for use in the classifi cation, identifi cation and analysis of the genetic relationship among S. cerevisiae strains and patent protection. Methods: On the basis of ISSR DNA fi ngerprinting analysis, 23 Saccharomyces cerevisiae strains were clustered by UPGMA and their classifi cation and identifi cation were conducted. Then two specifi c ISSR bands from strains 9 and 15 were converted into two SCAR markers for rapid strain identifi cation. Results: The 23 strains could be divided into three categories. Of these, category I included strains 1, 2, 4, 7, 15, 16, 17, 19, 20, 21 and 23, category II included strains 10, 11, 12, 13, 14 and 18 in which strains 10 and 11 were the same, and category Ⅲincluded strains 3, 5, 6, 8, 9 and 22 which belonged to the same strain with a similarity coeffi cient of 0.85. Furthermore, two specifi c bands were converted into SCAR marker for strain identifi cation. Conclusion: The development of ISSR fi ngerprints and SCAR markers for rapid identifi cation of Saccharomyces cerevisiae strains is signifi cant for industrial production because there is no signifi cant difference in genetic background of Saccharomyces cerevisiae strains and it is often occurs that the same strains are called different names.

Saccharomyces cerevisiae; inter-simple sequence repeat (ISSR); DNA fingerprint; sequence characterized amplified region (SCAR)

Q939.97

A

1002-6630（2014）03-0163-05

10.7506/spkx1002-6630-201403033

2013-03-12

安琪酵母股份有限公司分子生物學(xué)技術(shù)平臺建設(shè)項目（SDHZ20100138）

欒春艷（1988—），女，碩士研究生，研究方向為酵母分子生物學(xué)。E-mail：364595197@qq.com

*通信作者：李曉玲（1973—），女，副教授，博士，研究方向為分子生物學(xué)方法的應(yīng)用。E-mail：lixiaolinggz@126.com