李 娜，李向紅，劉永樂*，俞 健，王發(fā)祥，王建輝

(長沙理工大學食品與生物工程系，湖南 長沙 410004)

提取方法對米谷蛋白分子理化性質(zhì)的影響

李 娜，李向紅，劉永樂*，俞 健，王發(fā)祥，王建輝

(長沙理工大學食品與生物工程系，湖南 長沙 410004)

研究不同提取方法對米谷蛋白分子理化性質(zhì)的影響，采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfonate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、體積排阻高效液相色譜（size exclusion chromatography-high-performance liquid chromatography，SEC-HPLC）、掃描電鏡和差式掃描量熱法對所提取的米谷蛋白分子的性質(zhì)進行表征分析。結(jié)果表明：堿提法結(jié)合分步提取以及水洗工藝得到的米谷蛋白，蛋白含量達到（93.42±0.32）%；SDS-PAGE分析顯示其主要有3條清晰條帶（19、33、50 ku）；SEC-HPLC檢測到蛋白體系中的小分子部分和分子質(zhì)量＞106u大分子部分較少；微觀結(jié)構(gòu)觀察到其暴露出了蛋白質(zhì)的骨架結(jié)構(gòu)；同時這種方法所提取得的米谷蛋白焓值最高，熱穩(wěn)定性比較好。

米谷蛋白；提?。环肿咏Y(jié)構(gòu)

大米是大部分人能量和蛋白質(zhì)的主要來源[1]。大米中蛋白質(zhì)含量（干物質(zhì)計）為8.2%～15.2%，其氨基酸配比合理，具有高營養(yǎng)價值和低過敏性[2-3]，是谷物蛋白中營養(yǎng)價值較高的一種。稻谷在加工成大米的過程中會產(chǎn)生約15%的碎米；此外，大米淀粉糖生產(chǎn)中的副產(chǎn)品米渣，蛋白質(zhì)含量也在60%以上[4]。這些都是優(yōu)質(zhì)、豐富的蛋白質(zhì)來源，但多用作動物飼料，其價值遠未得到充分利用。利用這些廉價的原料開發(fā)優(yōu)質(zhì)蛋白，能顯著提高大米加工業(yè)的產(chǎn)品附加值。

大米蛋白的主要組分是米谷蛋白，占66%～78%[5]。米谷蛋白分子中高含量的谷氨酰胺及天冬酰胺之間通過氫鍵、疏水作用等聚集成致密分子，形成了一種大分子的蛋白質(zhì)聚合體[6-7]，造成其溶解度較低，限制了其在食品中的應(yīng)用。最新研究表明，通過蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶對米谷蛋白脫酰胺能顯著改善其溶解度及其他功能性質(zhì)，并且不會引起蛋白質(zhì)肽鏈的水解[8]。然而目前常用的大米蛋白提取方法是堿法和酶法[9-11]，所獲得的大米蛋白純度較低或者分子結(jié)構(gòu)受到了破壞，不利于蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶脫酰胺的作用。在之前研究的基礎(chǔ)上，本研究采用堿提酸沉，分別結(jié)合分步提取法、多次堿提和水洗等方法提純大米蛋白，并采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfonate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和體積排阻高效液相色譜（size exclusion chromatography-high-performance liquid chromatography，SEC-HPLC）分析所提取蛋白樣品的分子質(zhì)量分布[12-13]，掃描電鏡（scanning electron microscope, SEM）觀察蛋白質(zhì)表面結(jié)構(gòu)[14-17]，以及差式掃描量熱法（differential scanning calorimetry，DSC）分析蛋白樣品的熱穩(wěn)定性[18-19]，探討不同的提取方法對米谷蛋白分子理化性質(zhì)的影響。通過對現(xiàn)有大米蛋白的提取方法進行改進，獲得純度較高、分子結(jié)構(gòu)改變較少的蛋白底物，以利于酶法脫酰胺的順利、高效進行和后續(xù)改性研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

碎米（大米加工副產(chǎn)物），由湖南霞凝糧庫提供。

1.2 儀器與設(shè)備

DELTA320型pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；LD5-10型臺式低速離心機 北京京立離心機有限公司；FD-1A冷凍干燥機 上海博醫(yī)康實驗儀器有限公司；磁力攪拌器 江蘇金壇市金城國盛實驗儀器廠；JSM-6700F場發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本電子公司；DYY-5型穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀 北京市六一儀器廠；Q2000差示掃描量熱儀 美國TA儀器公司；LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理

碎米磨碎成粉，過120目篩，備用。

1.3.2 工藝流程

方法1：堿提→離心→酸沉→離心→洗滌→干燥→大米蛋白（樣品1）。方法2：堿提→離心→酸沉→離心→水提→離心→鹽提→離心→醇提→抽濾→堿提→離心→酸沉→離心→堿提→離心→酸沉→離心→干燥→大米蛋白（樣品2）。方法3：堿提→離心→酸沉→離心→洗滌→水提→離心→鹽提→離心→洗滌→醇提→抽濾→洗滌→干燥→大米蛋（樣品3）。方法4：堿提→離心→酸沉→離心→洗滌→水提→離心→鹽提→離心→洗滌→醇提→抽濾→洗滌→堿提→離心→酸沉→離心→洗滌→堿提→離心→酸沉→離心→洗滌→干燥→大米蛋白（樣品4）。

不同方法中提取大米蛋白操作要點如下：

1）堿提：最佳工藝條件均為：NaOH濃度為0.05 mol/L，固液比為1∶10，提取時間為1 h；2)酸沉：堿提分離后獲得的上清液中加入0.1 mol/L鹽酸，邊加邊攪拌，直到pH值降到約4.80；3)水提：將酸沉所獲得的蛋白質(zhì)加入去離子水中，固液比為1∶10，時間為1h。在水提時加入0.1 mol/L鹽酸，邊加邊攪拌，維持提取液pH值為7.0左右；4）鹽提：將水提所獲得的蛋白質(zhì)加入5%NaCl中，固液比為1∶10，時間為1 h；5）醇提：將經(jīng)鹽提后的大米蛋白加入體積分數(shù)為75%的乙醇中，固液比為1∶5，時間為1 h；6）離心：離心機轉(zhuǎn)速為4 500 r/min，離心時間為15 min。

1.4 指標分析

1.4.1 常規(guī)成分的測定

蛋白質(zhì)的測定：GB/T 5511—2008《谷物和豆類 氮含量測定和粗蛋白質(zhì)含量計算 凱氏法》，氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)為5.95；水分的測定：GB 5009.3—2010 《食品中水分的測定》；灰分的測定：GB/T 5505—2008 《糧油檢驗 灰分測定法》；脂肪的測定：GB/T 5512—2008《糧油檢驗 糧食中粗脂肪含量測定》。

1.4.2 SDS-PAGE分析

用垂直板SDS-PAGE蛋白電泳法，分離膠12%，濃縮膠5%。以相對分子質(zhì)量1.4×105～6.4×105的標準蛋白為標準，樣品用0.05 mol/L NaOH預(yù)處理。電泳同時用R250考馬斯亮藍染色5 h左右，脫色至電泳帶清晰即可。

1.4.3 SEC-HPLC分析

用磷酸鹽緩沖液（2% SDS，pH7.0）來溶解蛋白樣品，配制成5 mg/mL的蛋白溶液，離心后取上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾，使用島津LC-20A高效液相系統(tǒng)與Shodex KW-804蛋白柱。流動相為200 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液（2% SDS，pH 7.0），洗脫速率1 mL/min，在220 nm波長處檢測洗脫液，柱溫為25℃。用于Shodex KW-804蛋白柱曲線校正的10種標準物質(zhì)分別是：甲狀腺球蛋白（669 000 u）、醛縮酶（158 000 u）、牛血清白蛋白（67 000 u）、卵白蛋白（43 000 u）、過氧化物酶（40 200 u）、腺苷酸激酶（32 000 u）、激血球素（17 000 u）、核糖核酸酶A（13 700 u）、aprotinin（6 500 u）和VB12（1 350 u）。根據(jù)10種標準樣品繪制Shodex KW-804蛋白柱的標準曲線見圖1。

圖1 Shodex KW-804蛋白柱的標準曲線Fig.1 Standard curve prepared using Shodex KW-804 protein column

1.4.4 SEM分析

取適量干燥后樣品，分散在SEM樣品臺上，通過離子濺射在樣品上噴金后，用掃描電子顯微鏡觀察形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.4.5 DSC熱性質(zhì)分析

使用DSC對蛋白質(zhì)進行熱性質(zhì)分析。取2.5 mg大米蛋白樣品放入鋁盤，溫度掃描范圍30～120℃，升溫速率5℃/min。采用空密封鋁盤作為參照。實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 米谷蛋白的成分分析

表1 4種不同工藝獲得的米谷蛋白的成分分析Table 1 Proximate composition of rice glutelin extracted by four different methods %

由表1可知，僅僅通過堿提酸沉法提取獲得的大米蛋白的混合物中蛋白質(zhì)含量僅為（82.10±0.27）%（樣品1），其中還含有一部分沒有分離完全的淀粉；堿提法結(jié)合分步提取可使得所獲樣品中蛋白含量增加到90%以上，但重復(fù)分步提取步驟（樣品2和4）使得產(chǎn)品中灰分含量增加。

2.2 電泳測定結(jié)果

用4種不同制備方法獲得的蛋白樣品的SDS- PAGE結(jié)果見圖2。標準蛋白與米谷蛋白電泳后, 根據(jù)遷移率和標樣分子質(zhì)量對數(shù)的工作曲線，估算被測樣品亞基的分子質(zhì)量。結(jié)果顯示，盡管4種提取工藝在堿提后的處理方法不相同，但對于相同來源的大米原料，主要應(yīng)用稀堿提取米谷蛋白的情況下，所得到的電泳圖譜基本相同，均主要呈現(xiàn)出3條條帶：19、33、50 ku，但4種不同提取工藝所得到的電泳條帶清晰度有差別。處理米谷蛋白的工藝越精細，清晰度越高，即通過提純的步驟使得蛋白樣品的純度有所增加。

圖2 4種不同工藝獲得的米谷蛋白的電泳圖Fig.2 SDS-PAGE of rice glutelin extracted by four different methods

通 過對比樣品3和樣品4的結(jié)果還顯示，隨著堿液應(yīng)用的次數(shù)增加，50 ku的部分含量有所增加，說明提取過程中采用乙醇、堿和酸法二次提取米谷蛋白不僅會加大損失，更會促使其分子間的聚集，從而影響亞基分布。

2.3 SEC-HPLC測定結(jié)果

應(yīng)用4種不同制備方法獲得的米谷蛋白樣品的分子質(zhì)量分布見圖3。與標準曲線對照發(fā)現(xiàn)，所有樣品中均包含了分子質(zhì)量＞106u以及570、194、77 ku的不同聚合程度的米谷蛋白亞基（保留時間分別為6.0、8.5、9.4、10.1 min）。結(jié)果表明，繁雜的蛋白質(zhì)提取工藝會相應(yīng)地增加其提取物質(zhì)的純度，表現(xiàn)在樣品2、3和4保留時間在11 min后的部分含量很少，但樣品2和樣品4由于二次提取中加入堿液及酸量過多，以及鹽溶液與乙醇溶液的二次提取導致部分分子變性 聚集，表現(xiàn)在6.0 min（＞106u）左右處的部分含量增加明顯。

圖3 4種不同工藝獲得的米谷蛋白的體積排阻高效液相色譜圖Fig.3 SEC-HPLC of rice glutelin extracted by four different methods

2.4 SEM測定結(jié)果

冷凍干燥后的樣品通過SEM進行表面微觀結(jié)構(gòu)分析結(jié)果見圖4。樣品蛋白均呈大顆粒結(jié)構(gòu)，其中，在同樣的掃描條件下，樣品1僅通過堿提酸沉所提取，蛋白質(zhì)表面較為平滑。原因為所得蛋白質(zhì)還含有約10%的大米淀粉等糖類物質(zhì)，在大米中蛋白質(zhì)和糖類物質(zhì)呈膠合狀態(tài)，蛋白質(zhì)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中充滿糖類化合物[20]。其他3種蛋白樣品的顆粒表面有孔徑，原因是糖類物質(zhì)與蛋白質(zhì)分離且含量減少，但由于所采用的提取方法并未使得蛋白質(zhì)水解，其完整結(jié)構(gòu)未受影響。樣品3的表面孔徑多，呈現(xiàn)出較疏松的結(jié)構(gòu)，可能與其純度高，從而完全呈現(xiàn)出蛋白質(zhì)的骨架結(jié)構(gòu)有關(guān)。樣品2和樣品4的表面孔徑可能與采用二次提取、多次的酸堿處理使蛋白質(zhì)部分分子變性聚集有關(guān)。

圖4 4種不同工藝獲得的米谷蛋白的掃描電鏡圖（×5 000）Fig.4 Scanning electron microscopic pictures of rice glutelin extracted by four different methods (× 5 000)

2.5 DSC測定結(jié)果

表2 4種不同工藝獲得的米谷蛋白的熱力學性質(zhì)Table 2 Thermodynamic properties of rice glutelin extracted by four different methods

采用DSC測定了4種不同制備方法獲得的米谷蛋白樣品的熱穩(wěn)定性。DSC檢測蛋白質(zhì)體系在程序控溫過程中的熱量變化，可提供與蛋白質(zhì)熱變性有關(guān)的信息，如蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的變化、熱穩(wěn)定性、熱變性的原因、熱變性動力學、熱穩(wěn)定性與生理活性的關(guān)系等來表征蛋白分子的熱穩(wěn)定性[21]。從DSC圖譜中未發(fā)現(xiàn)明顯的多峰出現(xiàn)，說明4種方法提取的蛋白質(zhì)主要成分是米谷蛋白。由表2可知，4種方法所得的蛋白其熱處理過程中變性的峰值溫度相差不大，但變性熱焓的差別比較明顯。焓值代表鍵斷裂及放熱等累積在一起呈現(xiàn)出來的綜合吸熱量[22]，也反映了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的有序程度[23]。樣品1焓值最低，可能與其成分中包含了較多的非蛋白組分有關(guān)；而樣品2和4比樣品3焓值略低，可能與其分子部分變性有關(guān)。

3 結(jié) 論

在SDS-PAGE電泳中，不同提取方法獲得的米谷蛋白其電泳圖譜基本相同，分子質(zhì)量分布大體一致，但電泳條帶清晰度隨著加工工藝的精 細不同而有所差別。結(jié)合SEC-HPLC測定結(jié)果中不同樣品的峰面積和峰數(shù)可得出：提純步驟增加會提高所獲蛋白的純度，但過多的酸堿處理會促使蛋白分子部分變性聚集，其中堿提法結(jié)分步提取以及水洗工藝能夠獲得較高純度的米谷蛋白。通過SEM觀察所提取的米谷蛋白可知，樣品3的蛋白微觀結(jié)構(gòu)具有孔徑多、結(jié)構(gòu)疏松、呈現(xiàn)出蛋白質(zhì)骨架結(jié)構(gòu)的特點。DSC檢測結(jié)果顯示，對于不同方法提取同一種大米中所含的米谷蛋白，所得到的吸熱趨勢相似，其中樣品3的焓值高、熱穩(wěn)定性最好。本研究所獲得的純度較高、結(jié)構(gòu)改變小的米谷蛋白樣品有利于后續(xù)酶法脫酰胺改性的順利進行。

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Effects of Extraction Methods on Physico-chemical Properties of Rice Glutelin

LI Na, LI Xiang-hong, LIU Yong-le*, YU Jian, WANG Fa-xiang, WANG Jian-hui
(Department of Food and Biology Engineering, Changsha University of Science and Technology, Changsha 410004, China)

The effects of different extraction methods on physico-chemical properties of rice glutelin were studied. Sodium dodecyl sulfonate-polyacrylamide gelelectrophoresis (SDS-PAGE), size exclusion high performance liquid chromatography (SEC-HPLC), scanning electron microscope (SEM) and differential scanning calorimetry (DSC) were used to characterize the properties of extracted proteins. The results showed that the protein content of rice glutelin prepared by alkali extraction combined with sequential extraction and washing process was (93.42±0.32)%. SDS-PAGE analysis revealed three clear bands (19, 33 ku and 50 ku). The molecular weight distribution of the sample showed that there were fewer fractions with small molecules and large molecules larger than 106u. Our microstructural observation demonstrated that the protein backbone structure was exposed after all four different alkali extractions. Meanwhile, the highest enthalpy of the sample showed its good thermal stability.

rice glutelin; extraction; molecular structure

TS213.3

A

1002-6630（2014）03-0043-04

10.7506/spkx1002-6630-201403009

2013-04-17

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD31B08）；國家自然科學基金青年科學基金項目（31101214；31201427）；湖南省科技重大專項（2010FJ1007）；湖南省自然科學基金項目（13JJ4054；12JJ6028）

李娜（1989—），女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：na182007@163.com

*通信作者：劉永樂（1962—），男，教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)與農(nóng)產(chǎn)品深加工。E-mail：lyle19@163.com