董銀萍，李拖平*

（1.遼寧大學(xué)生命科學(xué)院，遼寧 沈陽 110036；2.遼寧大學(xué)食品科學(xué)系，遼寧 沈陽 110036）

山楂果膠的抗氧化活性

董銀萍1,2，李拖平2,*

（1.遼寧大學(xué)生命科學(xué)院，遼寧 沈陽 110036；2.遼寧大學(xué)食品科學(xué)系，遼寧 沈陽 110036）

目的：研究山楂果膠的體內(nèi)外抗氧化活性。方法：離體條件測定山楂果膠對O2-·、DPPH自由基和·OH的清除能力；利用高脂小鼠模型考察山楂果膠在生物體內(nèi)的總抗氧化能力。結(jié)果：山楂果膠離體條件對O2-·、DPPH自由基和·OH表現(xiàn)出顯著的清除作用。山楂果膠能顯著提高小鼠肝臟谷胱甘肽（glutathione，GSH）的含量和抗氧化酶類谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）的活性，并可顯著降低小鼠肝臟丙二醛（malondialdehyde，MDA）的含量。結(jié)論：山楂果膠具有顯著的體內(nèi)外抗氧化活性，在功能食品等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。

山楂果膠；抗氧化；脂質(zhì)過氧化

山楂（Crataegus）屬薔薇科山楂屬，全世界約有280多個種[1]。在我國山楂是藥果兼用樹種，按地理位置、氣候特點(diǎn)和栽培利用等情況，大致可分為吉遼、京津冀、魯蘇、中原、云貴高原5個山楂產(chǎn)區(qū)。山楂中果膠含量達(dá)6.4%，居所有水果之首[2]。果膠是一種多聚半乳糖醛酸，相對分子質(zhì)量約為50 000～300 000。果膠的獨(dú)特化學(xué)性質(zhì)與化學(xué)構(gòu)造[3]使其作為膠凝劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和乳化劑等，廣泛應(yīng)用于食品和化妝品行業(yè)。此外，果膠還具有較好的抗腹瀉[4]、抗癌[5]、減肥降脂[6]作用，在醫(yī)藥領(lǐng)域用于防止有毒陽離子中毒，防止血液凝固以及治療便秘[7]。

正常情況下，生物體內(nèi)處于氧化與抗氧化的動態(tài)平衡狀態(tài)，使組織免受損傷。機(jī)體受到損傷可使活性氧自由基增多，造成脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的發(fā)生[8]。GSH可通過供H+拮抗氧自由基毒性，終止自由基連鎖反應(yīng)，其本身則被GSH-Px氧化成GSSG，同時(shí)促進(jìn)H2O2的分解，保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受過氧化物的干擾及損害，從而起到抗氧化保護(hù)肝臟的作用[9-10]。CAT同樣可以催化H2O2分解成氧和水，存在于所有已知動物的組織細(xì)胞過氧化物體內(nèi)[11]，特別在肝臟中以高濃度存在。SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，能有效清除超氧陰離子自由基，抑制脂質(zhì)的過氧化物作用[12]。GSH-Px、SOD和CAT一起共同構(gòu)成生物體內(nèi)的活性氧防御系統(tǒng)。

有研究表明蘋果果膠具有較強(qiáng)的活性氧消除能力[13]。一種來源于大葉海草（Seagrass Zostera marina）的果膠可以降低小鼠肝臟的過氧化產(chǎn)物丙二醛的水平[14]。但有關(guān)山楂果膠抗氧化活性的研究還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)就山楂果膠的體內(nèi)外抗氧化活性進(jìn)行研究，以期為山楂果實(shí)深加工利用提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山楂果實(shí)，采自沈陽市近郊；動物飼料 北京華阜康生物科技股份有限公司。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl) hydrazyl，DPPH） 阿法埃莎（天津）化學(xué)有限公司；氯化硝基四氮唑藍(lán)（nitrotetrazolium blue chloride，NBT） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；GSH測定試劑盒、GSH-Px活性測定試劑盒、SOD活性測定試劑盒、CAT活性測定試劑盒、MDA含量測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；其他試劑均為分析純。

1.2 動物

雄性昆明種小鼠60只，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供；小鼠的飼養(yǎng)環(huán)境保持室溫（22±1）℃，相對濕度50%～60%，自然采光。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始進(jìn)食受試物。

1.3 儀器與設(shè)備

CP114電子天平 奧豪斯（中國）有限公司；722N可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；TGL-16M高速臺式冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；DW-FL270超低溫冰箱 中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司。

1.4 方法

1.4.1 山楂果膠的制備

參照王娜等[15]的方法，以熱水直接攪拌法提取可溶性果膠。即將干燥的山楂粉末用氯仿-甲醇溶液（1∶1，V/V，70℃加熱環(huán)流），再用乙醚進(jìn)行脫脂脫色處理數(shù)次，直到溶液的紅色全部消失為止，后進(jìn)行干燥。經(jīng)脫脂后的山楂果粉加入20倍體積的熱蒸餾水（95 ℃）充分?jǐn)嚢杼崛? h，提取液經(jīng)離心（4 000 r/min）后回收上清液。將提取液濃縮，邊攪拌邊加入2倍體積的95%乙醇，室溫下靜置4 h，離心，回收沉淀。所得沉淀再加入70%乙醇漂洗數(shù)次，回收沉淀經(jīng)無水乙醇進(jìn)一步脫水、離心丙酮洗脫、抽濾、濾渣干燥即得白色熱水可溶性果膠。用苯酚-硫酸法[16]測得其總糖含量為92.2%，用咔唑比色法[17]測得其半乳糖醛酸含量為70.4%。

1.4.2 動物喂養(yǎng)與取樣

實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為5組，每組12只，分別為空白組、高脂對照組和低（50 mg/kg）、中（150 mg/kg）、高（300 mg/kg）3個劑量山楂果膠組?？瞻捉M給予普通飼料，其余各組均給予高脂飼料，小鼠自由飲食飲水。低、中、高3個劑量山楂果膠組每天灌胃山楂果膠，空白組和高脂對照組灌胃等量蒸餾水。實(shí)驗(yàn)于10周后結(jié)束，小鼠提前24 h禁食不禁水，斷頸椎處死，迅速解剖取出所需臟器，用預(yù)冷生理鹽水洗去血漬、濾紙吸干，液氮速凍，置－80 ℃冰箱保存。

1.4.3 山楂果膠離體抗氧化能力的測定

1.4.3.1 山楂果膠對O2-·清除能力的測定

參照楊寧等[18]的方法，向干燥的試管內(nèi)依次加入0.5 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.8）、0.13 mol/L蛋氨酸、2.0×10-5mol/L核黃素、7.0×10-4mol/L NBT、不同質(zhì)量濃度（0.1、1、10 mg/mL）的待測樣品各0.4 mL和蒸餾水1.0 mL，混合均勻。以未加蛋氨酸和樣品溶液的體系為空白，以未加樣品液的體系為對照。將混合液在35 ℃、4 000 lx光照下還原20 min后以黑暗終止反應(yīng)，在560 nm波長處測定其吸光度。超氧自由基的清除率按式（1）進(jìn)行計(jì)算。

1.4.3.2 山楂果膠對DPPH自由基清除能力的測定

按照杜麗娟等[19]的方法，吸取不同濃度的待測樣品0.5 mL，加入2.0 mL 0.2 mmol/L的DPPH-乙醇(60%)溶液中，混合均勻，靜置30 min后在517 nm波長處測定其吸光度（A樣品）。以相同比例的待測樣品與60%乙醇的混合溶液為對照（A對照）、以DPPH溶液與60%乙醇的混合液為空白（A空白）。DPPH自由基的清除率按式（2）進(jìn)行計(jì)算。

1.4.3.3 山楂果膠對·OH清除能力的測定

參考顏軍等[20]的方法，分別取不同質(zhì)量濃度的待測樣品1 mL，1.8 mmol/L FeSO4溶液2 mL，1.8 mmol/L水楊酸-乙醇1.5 mL，最后加入H2O2（0.03%）0.1 mL啟動反應(yīng)，振蕩混合均勻后在37 ℃保溫30 min，以蒸餾水代替樣品管為對照（A對照），在510 nm波長處測定其吸光度（A樣品）。羥自由基的清除率計(jì)算公式同式（1）。

1.4.4 山楂果膠體內(nèi)抗氧化能力的測定

采用二硫代二硝基苯甲酸法測定GSH、還原型GSH消耗法測定GSH-Px活性、黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性、鉬酸銨法測定CAT活性、硫代巴比妥酸法測定MDA含量。操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 山楂果膠離體條件下的抗氧化能力

圖1 山楂果膠對自由基的清除作用Fig.1 Free radical scavenging activities of haw pectin

由圖1a可知，山楂果膠對O2-·清除作用隨著質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng)。1 mg/mL山楂果膠對O2-·的清除作用達(dá)到30%，與低質(zhì)量濃度（0.1 mg/mL）相比效果顯著（P＜0.01）；而當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到10 mg/mL時(shí)，清除率為91%。由圖1b可知，與山楂果膠清除O2-·的趨勢相同，山楂果膠分解物在高質(zhì)量濃度（10 mg/mL）條件下能表現(xiàn)出顯著的抗氧化活性（P＜0.01），而在低質(zhì)量濃度（0.1 mg/mL）條件下作用并不明顯。由圖1c可知，山楂果膠對·OH具有明顯的清除作用，隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，清除率明顯升高，中質(zhì)量濃度（1 mg/mL）、高質(zhì)量濃度（10 mg/mL）與低質(zhì)量濃度（0.1 mg/mL）相比效果極顯著（P＜0.01）。高質(zhì)量濃度山楂果膠（10 mg/mL）對·OH的清除率為72%。

2.2 山楂果膠體內(nèi)抗氧化能力

2.2.1 山楂果膠對小鼠肝臟GSH含量的影響

由圖2可知，高脂對照組小鼠肝臟GSH含量較空白組顯著下降。而與高脂對照組相比，山楂果膠3個劑量組的GSH含量均顯著增加，但各劑量之間差異并不明顯。山楂果膠能將小鼠肝臟內(nèi)GSH含量提高至210 μg/g，具有有效的抗氧化作用。

圖2 山楂果膠對小鼠肝臟GSH含量的影響Fig.2 Effect of haw pectin on GSH content in the liver of mice

2.2.2 山楂果膠對小鼠肝臟抗氧化酶類活性的影響

圖3 山楂果膠對小鼠肝臟抗氧化酶類活性的影響Fig.3 Effect of haw pectin on antioxidant enzyme activities in the liver of mice

由圖3a可知，高脂對照組較空白組小鼠肝臟GSH-Px活性顯著下降。與上述小鼠肝臟GSH含量趨勢相類似，中劑量和高劑量山楂果膠組GSH-Px活性顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）。GSH-Px能催化GSH對氫過氧化物的還原反應(yīng)，使機(jī)體免受過氧化物的損傷。由圖3b可知，高脂對照組小鼠肝臟CAT活性明顯下降；給予山楂果膠后，中劑量（150 mg/kg）山楂果膠組的CAT活性顯著提高（P＜0.01），但低劑量和高劑量山楂果膠組與高脂模型組相比差異并不顯著。由圖3c可知，小鼠肝臟SOD活性隨山楂果膠灌胃劑量的增加而增加。低、中劑量組SOD活性與高脂對照組相比無顯著性差異，而高劑量則顯著（P＜0.05）地提高了肝臟SOD活性。

2.2.3 山楂果膠對小鼠肝臟MDA含量的影響

圖4 山楂果膠對小鼠肝臟MDA含量的影響Fig.4 Effect of haw pectin on MDA content in the liver of mice

由圖4可知，高脂對照組小鼠肝臟MDA含量顯著高于空白組（P＜0.05）。山楂果膠3個劑量組均能顯著降低中小鼠肝臟MDA，特別是高劑量果膠組MDA含量低于對照組近50%。

3 討 論

自由基是游離存在的含有不配對電子的基團(tuán)，它們在體內(nèi)有很強(qiáng)的氧化反應(yīng)能力，易對蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等產(chǎn)生傷害，從而引起機(jī)體損傷[21]。有研究表明從蘋果渣中提取的蘋果果膠對DPPH自由基具有顯著的清除作用，其抑制作用在一定范圍內(nèi)呈質(zhì)量濃度依賴關(guān)系[22]。本實(shí)驗(yàn)中，高質(zhì)量濃度（10 mg/mL）的山楂果膠對O2-·、DPPH自由基和·OH這3種自由基均表現(xiàn)出顯著的清除效果，其清除率分別達(dá)到91%、84%和72%，表明山楂果膠具有較強(qiáng)的的抗氧化及清除自由基的活性功能。

脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物如丙二醛，會引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，造成組織細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的損傷，引起細(xì)胞功能失調(diào)甚至破裂、死亡，從而導(dǎo)致組織細(xì)胞功能的損傷[23]。當(dāng)體內(nèi)抗氧化能力增強(qiáng)，抗氧化酶活性增高時(shí)，可阻止脂質(zhì)過氧化或降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的含量。機(jī)體對活性氧O2-·的第一道防線是SOD，它將O2-·轉(zhuǎn)化為H2O2和其他氫過氧化物；第二道防線是CAT和GSH-Px，其中CAT可清除過氧體系中的H2O2，而GSH-Px分布在細(xì)胞的胞液和線粒體中，可同時(shí)清除H2O2和氫過氧化物，從而有效地保護(hù)機(jī)體[24]。本研究結(jié)果顯示，山楂果膠可以顯著的提高小鼠肝臟抗氧化酶系統(tǒng)GSH、GSH-Px、CAT和SOD的活性，說明山楂果膠抗氧化活性的機(jī)制之一是提高了抗氧化系統(tǒng)的酶活力；同時(shí)山楂果膠顯著增加了肝臟GSH含量。有研究表明，果膠可顯著降低大鼠血清丙二醛水平并且降低其體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化水平[25]。本研究就山楂果膠對小鼠肝臟中過氧化產(chǎn)物MDA含量的研究也發(fā)現(xiàn)了相似的趨勢，證明山楂果膠不僅能有效調(diào)節(jié)小鼠肝臟抗氧化活性，而且表現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)。

綜合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測山楂果膠可能是通過提高抗氧化酶活性，增加抗氧化活性物質(zhì)GSH含量達(dá)到體內(nèi)清除自由基的效果，進(jìn)而起到增強(qiáng)生物體內(nèi)抗氧化能力，抑制脂質(zhì)過氧化的效果。本研究結(jié)果為以山楂為原料的食療保健食品的開發(fā)提供了有效的理論基礎(chǔ)與科學(xué)根據(jù)。此外，我國有著豐富的山楂資源，選用山楂為原料，對山楂果膠進(jìn)行提取開發(fā)，無論是鑒于提高山楂的精深加工利用效率與經(jīng)濟(jì)轉(zhuǎn)換價(jià)值，還是天然抗氧化劑市場的需求，都具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。

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Antioxidant Activity of Haw Pectin in vitro and in vivo

DONG Yin-ping1,2, LI Tuo-ping2,*
(1. College of Life Science, Liaoning University, Shenyang 110036, China; 2. Department of Food Science, Liaoning University, Shenyang 110036, China)

Objective: To explore the antioxidant activity of haw pectin in vitro and in vivo. Methods: The free radical scavenging activities of haw pectin on superoxide anion, DPPH and hydroxyl radicals were detected. The in vivo antioxidant activity was investigated in high-fat-diet-fed mouse model. Results: Haw pectin showed significant free radical scavenging activities against all the three radical species. It also significantly increased the content of glutathione (GSH) and the antioxidant enzyme activities of glutathione peroxidase (GSH-Px), superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT). Moreover, it significantly decreased malondialdehyde (MDA) content in the liver of mice. Conclusion: Haw pectin has great potential for the development of functional foods due to its excellent antioxidant activity.

haw pectin; antioxidation; lipid peroxidization

Q539.8

A

1002-6630（2014）03-0029-04

10.7506/spkx1002-6630-201403006

2013-04-20

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（C200102/31071521）；遼寧省食品生物加工工程中心項(xiàng)目；沈陽市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（F11-235-1-00）

董銀萍（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称窢I養(yǎng)學(xué)。E-mail：dyp513829091@gmail.com

*通信作者：李拖平（1967—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與營養(yǎng)。E-mail：ltp0401@126.com