張 婕，周雅涵，閆師杰，曾凱芳,

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與 生物工程 學(xué)院，天津 300384）

檸檬形克勒克酵母復(fù)合CaCl2處理對采后黃花梨果實輪紋病的控制

張 婕1，周雅涵1，閆師杰2，曾凱芳1,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與 生物工程 學(xué)院，天津 300384）

研究檸檬形克勒克酵母復(fù)合CaCl2處理對采后黃花梨果實輪紋病的控制效果及相關(guān)機理。結(jié)果表明：采用1×108CFU/mL檸檬形克勒克酵母結(jié)合2% CaCl2處理黃花梨果實對其采后輪紋病有顯著的控制效果，且明顯優(yōu)于酵母或CaCl2單獨處理。在20 ℃條件下培養(yǎng)，檸檬形克勒克酵母能在果實傷口處迅速定殖生長，并持續(xù)保持較高水平，2% CaCl2對酵母生長狀態(tài)無顯著性影響。同時，檸檬形克勒克酵母與CaCl2結(jié)合使用能顯著誘導(dǎo)黃花梨果實過氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶、幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶 活性的增強。研究結(jié)果說明了檸檬形克勒克酵母結(jié)合2% CaCl2處理能夠用于控制黃花梨果實采后輪紋病，誘導(dǎo)果實抗病性是其作用機制之一。

檸檬形克勒克酵母；CaCl2；黃花梨；輪紋?。簧锓乐?/p>

黃花梨（Pyrus pyrifolia Nakai cv. Huanghua）屬砂梨系統(tǒng)，是我國南方地區(qū)特色水果之一。黃花梨果實成熟時期正值盛夏高溫、高濕季節(jié)（每年7—8月），加之其果皮較薄，汁液豐富，損傷后極易受病原微生物的侵染導(dǎo)致腐爛，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[1]。其中，輪紋病是黃花梨果實貯藏期間的主要侵染性病害，病果初期以皮孔為中心發(fā)生水漬狀、褐色、近圓形的斑點，有明顯的同心輪紋，逐漸擴(kuò)大終至全果腐爛[2]。目前，對于輪紋病的控制主要依賴于化學(xué)殺菌劑，如甲基托布津、多菌靈等[3]。然而，長期頻繁使用化學(xué)殺菌劑會導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性、環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品的污染，危害人類健康等一系列問題[4-5]。

生物防治劑作為替代化學(xué)殺菌劑的采后防治方法在控制果蔬采后腐爛的應(yīng)用上顯示出較大的應(yīng)用潛力[6]。已研究可作為水果采后病害生防拮抗菌的微生物有細(xì)菌、霉菌和酵母菌等[7-8]。檸檬形克勒克酵母具備拮抗效果好，不產(chǎn)生毒素，和其他化學(xué)物質(zhì)有良好生物共容性等優(yōu)點，有可能代替化學(xué)殺菌劑，克服化學(xué)藥劑毒性，保證人體安全[9-10]?？梢宰鳛檎T導(dǎo)果蔬抗病性的重要因子，誘導(dǎo)果實中幾丁質(zhì)酶（chitinase，CHI）、β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，GLU）等防御性物質(zhì)的產(chǎn)生與積累，從而提高果蔬對病原菌的抗性。CaCl2在延緩果實衰老和控制生理病害方面有較好的效果，并可作為信號傳導(dǎo)物質(zhì)，對酵母細(xì)胞增殖有明顯促進(jìn)作用[11-12]。

目前有關(guān)檸檬形克勒克酵母（Kloeckera apiculata）誘導(dǎo)抗病性的研究主要集中在單獨酵母懸浮液處理誘導(dǎo)植物果實的誘抗反應(yīng)上。研究[13-14]發(fā)現(xiàn)，檸檬形克勒克酵母對柑橘青霉病、草莓灰霉病有良好的防控效果。但是對于酵母復(fù)合其他物質(zhì)誘導(dǎo)采后梨果實抗病性的研究不多。本實驗以檸檬形克勒克酵母作為研究主體，重點研究檸檬形克勒克酵母單獨或復(fù)合CaCl2使用對黃花梨果實采后輪紋病的控制效果，并通過研究黃花梨貯藏中防御相關(guān)的酶如多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）、過氧化物酶（peroxidse，POD）、苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）、CHI、GLU等活性的變化，從誘導(dǎo)抗病性的角度，探討檸檬形克勒克酵母復(fù)合CaCl2控制黃花梨采后輪紋病的作用機制。以此，期望為新型生物保鮮劑的開發(fā)和應(yīng)用提供一定的指導(dǎo)，達(dá)到減少化學(xué)殺菌劑用量，挖掘以酵母菌為主體的生物保鮮劑的商業(yè)化應(yīng)用潛質(zhì)，提高果實貯藏安全性，進(jìn)一步提高黃花梨果實商品價值的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與菌種

1.1.1 果實

黃花梨于2012年8月12日采自重慶永川區(qū)吉安鎮(zhèn)銅涼村果園，挑選大小均勻、成熟度一致、無機械傷和無病蟲害的果實，于10 ℃條件下預(yù)冷48 h后，放入4 ℃冷庫中貯藏待用。

1.1.2 拮抗菌

檸檬形克勒克酵母（Kloeckera apiculata）購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，將該酵母菌株活化后接入含50 mL營養(yǎng)酵母葡萄糖液體培養(yǎng)基（NYDB：牛肉浸膏8 g，酵母浸膏5 g，葡萄糖10 g，定容至1 000 mL，121 ℃滅菌15 min）的三角瓶中[15]。在28 ℃條件下培養(yǎng)24 h后，在5 000 r/min、4 ℃離心10 min，并用無菌水洗滌2 次，除去培養(yǎng)介質(zhì)，用無菌水重新懸浮，血球計數(shù)板計數(shù)，臨用前再用無菌水稀釋至所需濃度。

1.1.3 病原菌

黃花梨輪紋病病原菌（Botryosphaeria berengeriana f. sp. piricola），為本實驗室自行分離和保存菌種，將病原菌接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA：200 g去皮馬鈴薯加水煮沸20 min后過濾，濾液中加入20 g葡萄糖、20 g瓊脂粉，定容至1 000 mL，121 ℃滅菌15 min）上，于27 ℃條件下培養(yǎng)7 d后，用無菌水將孢子洗下，4 層紗布過濾，血球計數(shù)板計數(shù)，并用無菌水調(diào)整濃度至1×104孢子/mL的孢子懸浮液，待用[16]。

1.2 方法

1.2.1 不同處理液對黃花梨果實采后輪紋病的控制效果

果實用2% NaClO溶液浸泡2 min后，用自來水沖洗干凈，自然晾干。用無菌鐵釘在果實赤道部位均勻刺2 個孔（直徑5 mm，深3 mm），在 每個傷口分別接種30 μL以下溶液：Ⅰ.無菌水；Ⅱ. 1×108CFU/mL的酵母細(xì)胞懸浮液；Ⅲ. 2% CaCl2溶液；Ⅳ. 酵母復(fù)合CaCl2保鮮液（1×108CFU/mL酵母細(xì)胞懸浮液復(fù)合2% CaCl2溶液）。2 h后，再在每個傷口接種15 μL，1×104孢子/mL病原菌孢子懸浮液。待菌液吸收后，單果包裝，貯藏在20 ℃，相對濕度85%～90%環(huán)境下，并用聚乙烯膜覆蓋保濕處理。每天統(tǒng)計發(fā)病率和病斑直徑。每個處理5 個果實，重復(fù)3 次。

1.2.2 CaCl2對酵母在果實傷口處生長動態(tài)的影響

果實經(jīng)表面消毒后，用無菌鐵釘在果實赤道部位均勻的刺2 個孔（直徑5 mm，深3 mm），在每個傷口分別接種30 μL以下溶液：Ⅰ. 1×108CFU/mL的酵母細(xì)胞懸浮液；Ⅱ. 酵母復(fù)合CaCl2保鮮液（1×108CFU/mL酵母細(xì)胞懸浮液復(fù)合2% CaCl2溶液）。待菌液吸收后，單果包裝，貯藏在20 ℃，相對濕度85%～90%環(huán)境下，以接種后1 h測定的酵母菌數(shù)為起始值，每2 d取一次樣。取樣時用消毒的打孔器取傷口處直徑為10 mm的果肉組織，放入含10 mL無菌水的消毒研缽內(nèi)研磨至勻漿。用稀釋平板法測定酵母數(shù)目，28 ℃條件下培養(yǎng)48 h后計數(shù)。每處理4 個果實，實驗重復(fù)3 次，結(jié)果以每傷口處酵母數(shù)量為單位（lg CFU/傷口）表示。

1.2.3 酵母復(fù)合CaCl2處理對黃花梨果實防御酶活性的影響

1.2.3.1 樣品處理及取樣

果實用2% NaClO溶液浸泡2 min后，用自來水沖洗干凈，自然晾干。用無菌鐵釘在果實赤道部位均勻刺2 個孔（直徑5 mm，深3 mm），在每個傷口分別接種30 μL以下溶液：Ⅰ.無菌水（對照）；Ⅱ. 1×108CFU/mL酵母細(xì)胞懸浮液復(fù)合2% CaCl2溶液，待處理液吸收干凈后，單果包裝，貯藏在20 ℃，相對濕度85%～90%環(huán)境下，于貯藏第0、3、6、9、12、15天取果實傷口處1 cm組織進(jìn)行各項相關(guān)指標(biāo)測定。每個處理重復(fù)3 次，每個重復(fù)5 個果實，整個實驗重復(fù)2 次。

1.2.3.2 POD和PPO活性測定

參考Zauberman等[17]的方法測定并改進(jìn)。POD以每30 s吸光度變化0.001為一個酶活力單位（U）。PPO以每30 s吸光度變化0.01為一個酶活力單位（U）。重復(fù)3 次。

1.2.3.3 PAL活性測定

參考Assis等[18]方法測定并改進(jìn)。以每分鐘吸光度變化為一個酶活力單位（U）。重復(fù)3 次。

1.2.3.4 CHI和GLU活性測定

CHI活性測定參考Boller等[19]的方法并修改。以每秒鐘每克蛋白分解膠狀幾丁質(zhì)產(chǎn)生1×10-9mol Glc-NAc為一個酶活性單位（U）。重復(fù)3 次。

GLU活性測定參考Abeles等[20]的方法測定并改進(jìn)：以每秒鐘每毫克蛋白分解昆布多糖產(chǎn)生1×10-9mol Glc-NAc葡萄糖為一個酶活性單位（U）。重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對黃花梨果實采后輪紋病發(fā)病率和病斑直徑的影響

圖1 不同處理對黃花梨果實發(fā)病率和病斑直徑的影響Fig.1 Effects of different tre atments on disease incidence and diameter of Huanghua pear

如圖1所示，對照組黃花梨果實在貯藏4 d時開始發(fā)病，在貯藏14 d內(nèi)發(fā)病率和病斑直徑呈現(xiàn)緩慢上升趨勢。與對照相比，檸檬形克勒克酵母單獨處理顯著降低了黃花梨果實的發(fā)病率和病斑直徑。然而，2% CaCl2處理卻在梨果實貯藏7 d后增強了果實的發(fā)病率和病斑直徑，促進(jìn)了果實輪紋病的發(fā)生。酵母復(fù)合CaCl2處理組果實發(fā)病率和病斑直徑顯著低于其他處理組，在貯藏15 d時，復(fù)合處理組果實的發(fā)病率分別比對照和酵母單獨處理組果實低42%和47%，說明2% CaCl2處理能夠增強酵母對黃花梨果實輪紋病的生防效果。

2.2 CaCl2對檸檬形克勒克酵母生長動態(tài)的影響

圖2 CaaCCll2對黃花梨果實傷口處檸檬形克 勒克酵母生長動態(tài)的影響Fig.2 Population ofKloeckera apiculatain the wounds of Huanghua pear treated with CaCl2

如圖2所示，接種后，檸檬形克勒克酵母在黃花梨果實傷口處迅速繁殖，后期，酵母菌數(shù)量呈平穩(wěn)趨勢，48 h后數(shù)量增加 了30 倍左右，說明檸檬形克勒克酵母能適應(yīng)黃花梨果實傷口處的生存環(huán)境。酵母復(fù)合CaCl2處理組的酵母菌數(shù)量在貯藏前期略高于酵母單獨處理組，4 d后略低于酵母單獨處理組，但兩者之間的區(qū)別并沒有達(dá)到顯著性差異。說明CaCl2對檸檬形克勒克酵母在果實傷口處的快速定殖生長沒有顯著影響。

2.3 酵母復(fù)合CaCl2處理對黃花梨果實采后防御酶活性的影響

2.3.1 對POD和PPO活性的影響

圖3 酵母復(fù)合CaaCCll2處理對黃花梨果實POD（A）和PPO（B）活性的影響Fig.3 Effects ofKloeckera apiculat acombined with CaCl2on theactivities of POD and PPO in Huanghua pear

如圖3所示，對照組和酵母復(fù)合2% CaCl2處理組黃花梨果實POD活性均呈先升高后下降的變化趨勢，對照組POD活性在貯藏6 d時達(dá)到峰值；酵母復(fù)合CaCl2處理組果實的POD活性在貯藏9 d時迅速增強，貯藏12 d時達(dá)到較對照組高2.5 倍左右的峰值。說明POD對貯藏后期酵母復(fù)合CaCl2處理誘導(dǎo)黃花梨果實的抗病性起了重要作用。

貯藏前期，對照和復(fù)合處理組果實的PPO活性均呈緩慢上升然后下降的趨勢，貯藏12 d后，兩組果實的PPO活性急劇上升。但是，貯藏期間酵母復(fù)合CaCl2處理的黃花梨果實PPO活性與對照組相比沒有顯著差異。

2.3.2 對PAL活性的影響

圖4 酵母復(fù)合CaaCCll2處理對黃花梨果實PAL活性的影響Fig.4 Effects ofKloeckera apiculatacombined with CaCl2on PAL activity in Huanghua pear

如圖4所示，貯藏期間對照和酵母復(fù)合CaCl2黃花梨果實的PAL活性均呈現(xiàn)兩次先升高后下降的變化趨勢。貯藏前期，與對照相比，酵母復(fù)合CaCl2處理組PAL活性一直處于較高水平，貯藏3 d比對照果實的高31.7%。貯藏后期，對照組果實PAL活性急劇升高后下降，整體活性明顯高于酵母復(fù)合CaCl2處理組，說明復(fù)合處理只能誘導(dǎo)黃花梨果實貯藏前期的PAL活性。

2.3.3 對CHI和GLU活性的影響

圖5 酵母復(fù)合CaaCCll2處理對黃花梨果實CHI（A）和GLU（B）活性的影響Fig.5 Effects ofKloeckera apiculatacombined with CaCl2on the activities of CHI and GLU in Huanghua pear

如圖5所示，對照和酵母復(fù)合CaCl2處理組黃花梨果實的CHI活性均呈先上升后下降，于貯藏后期迅速又上升的變化趨勢。貯藏3 d以后，酵母復(fù)合CaCl2處理組的黃花梨CHI活性一直明顯高于對照組，貯藏6 d時達(dá)到一個較對照組CHI活性高62%的峰值。說明在貯藏期間，酵 母與CaCl2復(fù)合處理能夠誘導(dǎo)黃花梨果實中CHI的活性。

貯藏期間，對照和酵母復(fù)合CaCl2處理組黃花梨果實的GLU活性均呈先下降后上升的趨勢。貯藏4 d后，酵母與復(fù)合CaCl2處理組果實的GLU活性一直明顯高于對照組。說明GLU也參與了酵母復(fù)合CaCl2處理誘導(dǎo)黃花梨果實的抗病反應(yīng)。

3 討 論

本研究結(jié)果表明，酵母單獨處理組果實在20 ℃貯藏條件下發(fā)病率與病斑直徑均低于對照組，說明酵母單獨處理能一定程度抑制黃花梨果實輪紋病，但是效果次于酵母復(fù)合CaCl2處理，說明2% CaCl2處理能夠增強酵母對黃花梨果實輪紋病的生防效果。鈣處理是果實采后常規(guī)處理方法之一，CaCl2可以有效提高酵母菌控制果實病害的生防效果[21]。其作用機理存在著多種不同意見：Wisniewski等[22]研究認(rèn)為CaCl2通過對病原菌產(chǎn)生毒害作用而加強拮抗菌的拮抗效果；Conway[23]、田世平[24]等認(rèn)為CaCl2是通過增強寄主抗性來提高拮抗效果；McLaughlinet等[25]則認(rèn)為CaCl2通過與拮抗菌的代謝產(chǎn)物的相互作用阻礙了病害的發(fā)展。本實驗中，2% CaCl2單獨作用不能達(dá)到控制黃花梨果實輪紋病的目的，甚至起了反效果，可能原因為外源Ca濃度高于一定范圍時，由于細(xì)胞膜Ca結(jié)合位點的限制，過量Ca會改變細(xì)胞質(zhì)Ca濃度，造成膜傷害，果實抗病能力下降，容易造成病原 菌侵染[26]。但是CaCl2處理可以增強檸檬形克勒克酵母對黃花梨果實采后輪紋病的防治效果，說明CaCl2并未對病原菌產(chǎn)生直接毒害作用或增強寄主的抗性[27]。因此推斷鈣可能是通過與拮抗菌的代謝產(chǎn)物相互作用阻礙了病害的發(fā)展。同時，CaCl2可維持酵母菌細(xì)胞內(nèi)外電荷處于穩(wěn)態(tài)狀態(tài)，并作為信號傳遞物質(zhì)，對貯藏期間酵母菌生長繁殖有促進(jìn)作用[22]。

通過觀察黃花梨果實傷口處檸檬形克勒克酵母生長動態(tài)可以發(fā)現(xiàn)，酵母復(fù)合CaCl2處理組及酵母單獨處理組黃花梨果實傷口處酵母菌數(shù)量迅速增長，并在中、后期保持穩(wěn)定狀態(tài)。說明2% CaCl2對酵母菌增長繁殖無抑制作用。

植物在抵御病原微生物的侵染過程中，抗性相關(guān)酶發(fā)揮了重要作用。POD可促進(jìn)木質(zhì)素和植保素的合成[28]，使黃花梨果實內(nèi)石細(xì)胞含量增加，提高果實硬度，增強貯藏能力[29]。本實驗結(jié)果表明，貯藏后期，酵母復(fù)合2% CaCl2處理組果實POD活性明顯高于對照組，說明POD對貯藏后期酵母復(fù)合CaCl2處理誘導(dǎo)黃花梨果實的抗病性起了重要作用。與對照相比，復(fù)合處理組果實的PPO活性并無明顯升高，說明它對酵母復(fù)合CaCl2處理誘導(dǎo)黃花梨果實產(chǎn)生抗病反應(yīng)無明顯效果。

PAL是苯丙烷類代謝途徑中的關(guān)鍵酶，該反應(yīng)最終生成的次生代謝產(chǎn)物如植保素、黃酮體、木質(zhì)素等對增強果實硬度、殺死病原微生物有重要作用[30-31]。本實驗中，貯藏前期酵母復(fù)合2% CaCl2處理組PAL活性顯著提高，說明酵母菌與CaCl2共同作用可增強PAL活性，可能原因：CaCl2通過影響酵母菌生理活性使其迅速繁殖后誘導(dǎo)PAL活性增強；或者是其直 接刺激黃花梨果實細(xì)胞，使PAL含量增加[28]。然而這一作用主要出現(xiàn)于貯藏前期，對后期黃花梨果實抗病性并無明顯效果。

CHI、GLU普遍存在于高等植物中，是植物抗病系統(tǒng)中重要的防御酶，可通過水解病原菌細(xì)胞壁直接殺死真菌，其作用具有“協(xié)同性”[32]。貯藏期間，酵母與CaCl2復(fù)合處理組果實CHI活性與對照相比一直處于較高水平，說明酵母菌及CaCl2可以顯著誘導(dǎo)CHI活性增強[11]。同時，復(fù)合處理組果實的GLU活性略高于對照果實，說明GLU也參與了酵母復(fù)合CaCl2處理誘導(dǎo)黃花梨果實的抗病反應(yīng)。其作用結(jié)果與Droby[10]、萬亞坤[33]等研究結(jié)果一致。

綜上所述，2% CaCl2復(fù)合檸檬形克勒克酵母處理可以有效提高黃花梨果實POD、PAL、CHI、GLU等防御酶的活性，降低黃花梨果實發(fā)病率和病斑直徑；酵母菌可在黃花梨果實傷口處迅速定殖、生長也是其有效防控黃花梨果實輪紋病的前提條件。

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Biocontrol of Huanghua Pear Ring Rot by Kloeckera apiculata Combined with CaCl2

ZHANG Jie1, ZHOU Ya-han1, YAN Shi-jie2, ZENG Kai-fang1,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. College of Food Science and Biological Engineering, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China)

Huanghua pear is highly susceptible to infection by infectious microorganisms during postharvest storage. Pear ring rot, caused by Botryosphaeria berengeriana. f.sp. piricola, is one of the major postharvest diseases. The ability of the yeast Kloeckera apiculata combined with CaCl2to control ring rot of Huanghua pear fruit during storage and its possible biocontrol mechanism were examined in this study. The results indicated that K. apiculata combined with CaCl2inhibited pear ring rot more effectively than Kloeckera apiculata or CaCl2used alone at 20 ℃. K. apiculata around the wounds could multiply quickly at the beginning of incubation and then remain at higher levels, while 2% CaCl2had no negative impact on its growth. Combined treatment with K. apiculata and 2% CaCl2caused the accumulation of defense-related enzymes such as polyphenol oxidase (PPO), peroxides (POD), phenylalanine ammonia-lyase (PAL), chitinase (CHI), and β-1, 3-glucanase (GLU) in Huanghua pear fruit. These results indicated that K. apiculata combined with 2% CaCl2could effectively redu ce the incidence of ring rot in Huanghua pear. The induction of resistance is one of the most important mechanisms by whichK. apiculata combined with CaCl2controls pear ring rot.

Kloeckera apiculata; CaCl2; Huanghua pear; pear ring rot; biocontrol

S609.3

A

1002-6630（2014）12-0228-05

10.7506/spkx1002-6630-201412047

2013-11-30

重慶市科技攻關(guān)（應(yīng)用技術(shù)研發(fā)類/重點）項目（cstc2012gg-yyjsB80003）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201303075）；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201210635027）

張婕（1990—），女，本科生，研究方向為食品貯藏工程。E-mail：zhangjie_Libra @163.com

*通信作者：曾凱芳（1972—），女，教授，博士，研究方向為食品貯藏工程。E-mail：zengkaifang@163.com