黃湘鷺，王靜文，曹 進(jìn)，張慶生

（中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050）

降血糖類保健食品中非法添加的8 種藥物檢測(cè)及實(shí)例分析

黃湘鷺，王靜文，曹 進(jìn)，張慶生

（中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050）

目的：建立檢測(cè)降血糖類保健食品中非法添加8 種藥物的方法并用于實(shí)際檢測(cè)。方法：采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，以ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）色譜柱，以0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相A，甲醇為流動(dòng)相B，梯度洗脫。通過(guò)分子離子峰、二級(jí)碎片、色譜保留時(shí)間等信息，對(duì)宣稱輔助降血糖類保健食品非法添加8種化學(xué)藥物進(jìn)行鑒別和定量測(cè)定。結(jié)果：8種藥物實(shí)現(xiàn)了同時(shí)分離與專屬鑒定，檢出限為5.5～76 ng/g，精密度為0.22%～1.19%，回收率為74.0%～111.9%；本法適用于硬膠囊樣品；利用本法，從15 批樣品中檢測(cè)出9 批含非法添加化學(xué)藥物。結(jié)論：本方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可作為宣稱輔助降血糖類保健食品中檢測(cè)非法添加化學(xué)藥物的方法參考。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；降糖藥物；格列本脲；西地那非

隨著人們生活水平的提高和對(duì)健康品質(zhì)的需求，保健食品由于可以補(bǔ)充人們所需營(yíng)養(yǎng)成分、修復(fù)人體部分亞健康狀態(tài)，而越來(lái)越多的被人們使用。由于保健食品是具備一種功效或者宣稱功能的食品[1]，因此，在日常使用中，常被人們誤認(rèn)為具備治療效果，而和某些病癥狀態(tài)的恢復(fù)相聯(lián)系，為了凸顯這些作用，換取更大的經(jīng)濟(jì)利益，許多不法分子在保健食品中添加有關(guān)藥物以增加保健食品的功效顯示[2-4]。在一個(gè)時(shí)期的實(shí)際檢驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，保健食品中非法添加化學(xué)藥物主要存在功能對(duì)應(yīng)的治療藥物的添加、藥物副作用與功能對(duì)應(yīng)的藥物添加等選擇方向，在添加形式上，存在一種或者多種藥物添加、藥物前體添加或者藥物衍生物添加等。由于保健食品中非法添加藥物存在劑量不明確、種類不清晰、物質(zhì)相互作用不確切等風(fēng)險(xiǎn)，因此保健食品中非法添加藥物這種現(xiàn)象具有很強(qiáng)的潛在危害性，是影響食品安全的重要危害來(lái)源，需要嚴(yán)厲打擊[5]。在前期保健食品相關(guān)檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，部分降血糖類保健食品在非法添加降糖類藥物的同時(shí)，還添加了部分可用于抗疲勞的藥物，這為保健食品中非法添加藥物的危害溯源和風(fēng)險(xiǎn)鑒別提供了新的線索。因此，這里選擇常見(jiàn)降血糖藥物和壯陽(yáng)類藥物共8種進(jìn)行研究，包括磺脲類降糖藥（格列喹酮、格列美脲、格列吡嗪、格列齊特、格列本脲）、非磺脲類降糖藥（瑞格列奈）和5型磷酸二酯酶（phosphodiesterase type 5，PDE5）抑制劑（西地那非、他達(dá)拉非）。本實(shí)驗(yàn)建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MSMS）法，可快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)宣稱輔助降血糖類保健食品中8種藥物，為拓展降血糖類保健食品中非法添加化學(xué)藥物的篩查范圍提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

格列吡嗪（純度9 9.5%）、格列齊特（純度99.9%）、瑞格列奈（純度99.7%）、格列本脲（純度100%）、格列美脲（純度99.1%）、格列喹酮（純度99.9%） 中國(guó)食品藥品檢定研究院；西地那非（純度100%） Toronto Research Chemicals；他達(dá)拉非（純度100%）振翔公司；甲醇（色譜純） 德國(guó)Merck公司；甲酸（色譜純） 美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

6460 Triple Quad LC-MS配有電噴霧離子源 美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Z O R B A X E c l i p s e P l u s C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；柱溫：35℃；以0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相A，甲醇為流動(dòng)相B，梯度洗脫：0→5 min，A 90%→90%；5→5.1 min，A 90%→10%；5.1→10 min，A 10%→10%；10→10.1 min，A 10%→90%；10.1→13 min，A 90%→90%；流速0.1 mL/min；進(jìn)樣量1 ?L。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源，毛細(xì)管電壓3 500 V，噴霧電壓500 V，霧化氣30 psi，氣流速度8 L/min，氣流溫度330 ℃，鞘氣流速11 L/min，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiplereactionmonitoring，MRM），正離子模式。各化學(xué)藥物監(jiān)測(cè)離子對(duì)及質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 降糖類化學(xué)藥物監(jiān)測(cè)離子對(duì)及質(zhì)譜參數(shù)Table1 MRM ions pair and MS parameters of anti-diabetics

1.3.3 對(duì)照品溶液的配制

精密稱取格列喹酮、格列美脲、格列吡嗪、格列齊特、瑞格列奈、格列本脲、西地那非、他達(dá)拉非適量，加甲醇溶解并制成每1 mL各含100 μg的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取各對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0 mL于100 mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品混合溶液。

1.3.4 供試品溶液的配制

稱取0.5 g的硬膠囊樣品至于50 mL離心管，加甲醇25 mL超聲提取15 min，放冷至室溫，加甲醇定容至刻度，混勻。離心后吸取上清液，過(guò)0.45 μm濾膜后待用。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相的選擇

圖1 8種化學(xué)藥物的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子流圖Fig.1 MRM chromatograms of 8 drugs: gliquidone (a), glibenclamide (b), glimepiride (c), sildenafil (d), repaglinide (e), glipizide (f), tadalafil (g) and gliclazide (h)

本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)甲醇-水、甲醇-20 mmol/L醋酸銨、甲醇-0.1%甲酸、甲醇-0.1%甲酸-20 mmol/L醋酸銨系統(tǒng)進(jìn)行了考察，結(jié)果以甲醇-0.1%甲酸、甲醇-0.1%甲酸-20 mmol/L醋酸銨系統(tǒng)作為流動(dòng)相時(shí)效果較好，色譜峰峰形尖銳，分離效果好，基線穩(wěn)定。為減少流動(dòng)相配比數(shù)量，選擇甲醇-甲酸作為流動(dòng)相。圖1為8種化學(xué)藥物的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子流圖。

2.2 特征碎片離子的選擇和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用MRM模式對(duì)宣稱輔助降血糖類保健食品非法添加化學(xué)藥物進(jìn)行分析。在電噴霧離子源正離子模式下，通過(guò)一級(jí)質(zhì)譜掃描確定8 種化合物的[M+1]+準(zhǔn)分子離子峰，通過(guò)子離子掃描對(duì)各化合物進(jìn)行掃描，確定MRM模式下各特征碎片離子。8 種化合物的特征碎片離子見(jiàn)表1，每個(gè)化合物選擇2～4 個(gè)離子對(duì)。

采用MassHunter Optimizer軟件對(duì)8 種化合物的碎裂電壓和碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化，碎裂電壓優(yōu)化范圍為50～150 V，碰撞能量為5～50 eV，優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 檢出限及線性范圍

取硬膠囊陰性樣品0.5 g，分別加入一定量的對(duì)照品，按供試品溶液的配制方法同法配制，以3倍信噪比計(jì)算檢出限，通過(guò)添加至相應(yīng)質(zhì)量濃度加標(biāo)樣品予以確證；精密吸取對(duì)照品混合溶液0.1、0.5、1、5、10 mL，分別置10 mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度為0.01、0.05、0.1、0.5、1.0 ng/mL對(duì)照品工作溶液，以各組分定量離子的峰面積對(duì)其質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，得到線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 8種化學(xué)成分的檢出限、線性范圍、回歸方程和相關(guān)系數(shù)Table2 Limit of detection (LOD), linear ranges, linear equations and correlation coefficients ( ) for 8 drugs

2.3.2 精密度實(shí)驗(yàn)

取100 ng/mL對(duì)照品工作溶液，重復(fù)進(jìn)樣6 次，按上述色譜質(zhì)譜條件測(cè)定，格列喹酮、格列美脲、格列吡嗪、格列齊特、瑞格列奈、格列本脲、西地那非、他達(dá)拉非的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）分別為1.04%、1.19%、0.41%、0.62%、0.55%、0.22%、0.34%、1.03%。

2.3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密稱取1 號(hào)樣品6份，每份0.5 g，按供試品溶液的配制方法同法配制并測(cè)定，計(jì)算格列美脲的平均含量為1 302.64 ?g/g（RSD=3.23%），格列本脲的平均含量為46.38 ?g/g（RSD=5.59%），西地那非的平均含量為1.48 ?g/g（RSD=5.10%），他達(dá)拉非的平均含量為177.25 ?g/g（RSD=1.63%）。

2.3.4 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

取硬膠囊陰性樣品0.5 g，分別加入一定量的對(duì)照品，按供試品溶液的配制方法同法配制并測(cè)定加標(biāo)回收率，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 加標(biāo)回收率Table3 Spiked recoveries

2.4 樣品測(cè)定

應(yīng)用本法對(duì)市售15批宣稱輔助降血糖保健食品中格列喹酮、格列美脲、格列吡嗪、格列齊特、瑞格列奈、格列本脲、西地那非、他達(dá)拉非進(jìn)行篩查，發(fā)現(xiàn)非法添加成分9批，其中單獨(dú)添加3批，復(fù)合添加6批，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 樣品含量測(cè)定Table4 Determination of 8 illegal drugs in real samples

3 討 論

根據(jù)結(jié)果對(duì)市售輔助降血糖類保健食品的非法添加化學(xué)藥品的情況進(jìn)行初步分析。通過(guò)對(duì)市售15 批降糖類保健食品進(jìn)行篩查，發(fā)現(xiàn)6 批樣品添加格列本脲，1 批添加格列美脲，5 批添加西地那非，2 批添加他達(dá)拉非。在這15 批樣品中，添加1 種降糖類化學(xué)藥品的為3 批，2 種的為1批。添加1 種壯陽(yáng)類化學(xué)藥品的為3 批，2 種的為1 批。降糖類化學(xué)藥品與壯陽(yáng)類化學(xué)藥品混合添加的有3 批。在定性鑒別的同時(shí)，利用MRM模式對(duì)檢出的化學(xué)藥品進(jìn)行了定量。

上述檢出的化學(xué)藥品多為處方藥，必須在醫(yī)生的指導(dǎo)下服用。格列本脲為第二代磺酰脲類降糖藥，作用強(qiáng)而持久，持續(xù)時(shí)間為12～24 h，用量過(guò)大會(huì)導(dǎo)致持久性低血糖反應(yīng)，對(duì)人體造成危害[6-9]。西地那非和他達(dá)拉非屬于PDE5的選擇性抑制劑，能抑制體內(nèi)環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷的降解，從而加強(qiáng)性興奮的陰莖勃起反應(yīng)[10-13]，在宣稱抗疲勞類保健食品中有非法添加情況。但測(cè)定結(jié)果中，多種品牌的降糖類保健食品中均含有西地那非、他達(dá)拉非，且劑量范圍不等。有甚者，在降血糖保健食品中只添加壯陽(yáng)藥，如樣品2、5、8號(hào)。除非藥物的原料來(lái)自同一廠家，否則意外污染的可能性不大。

另外，糖尿病慢性并發(fā)癥之一是陽(yáng)痿[14-17]，PDE5抑制劑（多為西地那非）與降糖藥（多為格列本脲）的聯(lián)合使用，可以從多方面減輕糖尿病的癥狀，不法商家通過(guò)這種聯(lián)合添加的方式來(lái)增加降糖類保健食品的療效。部分陽(yáng)痿患者（不管是否患有糖尿?。┯捎谄惹邢敫纳破浒Y狀，擅自服用宣稱具有壯陽(yáng)效果的保健食品，而這些保健食品中可能非法添加不同程度的降糖藥，患者服用后導(dǎo)致了一系列降糖藥引發(fā)的嚴(yán)重副作用（比如低血糖）[18-20]，這些情況提示了保健食品非法添加藥物的一種新的篩查思路，即通過(guò)對(duì)疾病可能出現(xiàn)的臨床癥狀進(jìn)行分析，擴(kuò)展具備具體功能的保健食品的篩查范圍，這為嚴(yán)格控制保健食品的產(chǎn)品質(zhì)量，打擊非法添加具有重要的意義。

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Determination of 8 Drugs in Antidiabetic Supplements: A Case Study

HUANG Xiang-lu, WANG Jing-wen, CAO Jin, ZHANG Qing-sheng
(National Institutes of Food and Drug Control, Beijing, 100050, China)

Objective: To develop and apply a method for the identification of 8 illegal drugs in antidiabetic supplements using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS-MS). Methods: The chromatography was performed using a ZORBAX Eclipse Plus C18column (2.1 mm × 50 mm, 1.8 μm), with a mobile phase consisting of 0.1% (V/V) formic acid (phase A) and methanol (phase B) by gradient elution. Eight illegal synthetic drugs (gliquidone, glibenclamide, glimepiride, sildenafil, repaglinide, glipizide, tadalafil and gliclazide) added in antidiabetic health foods were determined qualitatively and quantitatively based on the information of molecular ion mass, specific fragment ions and chromatographic retention. Results: Eight drugs could be separated and identified simultaneously. The limits of detection (LODs) of these substances were in the range of 5.5–76 ng/g, the precision expressed as relative standard deviation (RSD) for six replicate determinations was 0.22%–1.19%, and the recoveries from spiked samples were in the range of 74.0%–111.9%. The method was suitable for hard capsules. In the 15 batches of samples, the illegal synthetic drugs were found in 9 batches. Conclusion: The method has been proved to be simple, sensitive and accurate, and can be used as a reference in the detection of the illegal synthetic drugs in anti-diabetic supplements.

high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS-MS); antidiabetics; glibenclamide; sildenafil

R917

A

1002-6630（2014）10-0149-04

10.7506/spkx1002-6630-201410027

2013-09-12

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAK08B02）

黃湘鷺（1985—），女，助理研究員，碩士，研究方向?yàn)槭称?、保健食品及化妝品的檢測(cè)。E-mail：xianglu_huang@126.com