曹際娟，徐君怡，徐 楊，榮 策，陳 穎

（1.遼寧出入境檢驗檢疫局，遼寧 大連 116001；2.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué) 院，遼寧 大連 116034；3.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，北京 100123）

實時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)快速鑒定仿刺參

曹際娟1，徐君怡1，徐 楊1，榮 策2，陳 穎3

（1.遼寧出入境檢驗檢疫局，遼寧 大連 116001；2.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué) 院，遼寧 大連 116034；3.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，北京 100123）

基于仿刺參線粒體COX1基因、NAD4基因分別設(shè)計特異性檢測引物和探針，采用TaqMan探針實時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)進(jìn)行仿刺參的特異性鑒定檢測。對21種海參樣品進(jìn)行實時熒光PCR檢測的特異性檢驗，并對每個樣品做3個平行實驗，計算Ct平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差及變異系數(shù)，評估檢測方法的重復(fù)性。結(jié)果表明：所設(shè)計的引物和探針可以特異性的鑒別仿刺參，方法的變異系數(shù)均小于2%，表明本研究設(shè)計的引物和探針具有良好的重復(fù)性。本研究所建立的快速檢測仿刺參的方法快速、簡便，既克服了傳統(tǒng)海參鑒別方法的局限性，同時又結(jié)合了熒光PCR技術(shù)高效率、低污染的優(yōu)點，為仿刺參真?zhèn)舞b別研究提供了有價值的參考意見。

實時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；鑒別；仿刺參

海參隸屬于棘皮動物門海參綱，是海洋中一類無脊椎動物的總稱。根據(jù)Pawson et Fell分類系統(tǒng)的劃分原則，整個海參綱包含3 亞綱、6 目、24 科。迄今為止，在全世界范圍內(nèi)已發(fā)現(xiàn)900 余種海參，其中40 余種具有長期食用的記錄，可作為食用海參[1-3]。仿刺參（Apostichopus japonicus）俗稱遼參，從屬于楯手目、刺參科、仿刺參屬，是我國經(jīng)濟(jì)價值最高的海參品種，也是中國20多種食用海參中質(zhì)量最好的一種。其種群主要分布于遼、冀、魯、蘇等北方沿岸淺海區(qū)，在日本北海道、俄屬海參崴、朝鮮半島也有生長[2]。仿刺參作為一種珍貴的海味被列為“八珍”之一，除具有其他食用海參的營養(yǎng)價值外，還含有一種重要營養(yǎng)物質(zhì)——二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）。DHA對大腦細(xì)胞，特別是神經(jīng)傳導(dǎo)和突觸的生長發(fā)育有著極重要的作用。此外，仿刺參含有硫酸軟骨素，有助于人體生長發(fā)育，能夠延緩肌肉衰老/增強機體的免疫力。近幾年，隨著人們對仿刺參營養(yǎng)價值的認(rèn)識以及仿刺參價位的飆升，已出現(xiàn)以次充好、作假造假的現(xiàn)象。因此開展精準(zhǔn)的仿刺參鑒別方法研究具有重要意義。

仿刺參線粒體的遺傳方式為經(jīng)典的母系遺傳，不存在父本雜交[4]，因此線粒體DNA可作為仿刺參鑒定的最理想的物種標(biāo)識基因。仿刺參線粒體DNA序列全長16 096 bp，共編碼13個蛋白基因、22個tRNA基因、2個rRNA基因[5]。其中COX1（細(xì)胞色素C氧化酶亞單位Ⅰ）基因與16S rRNA基因是目前海參鑒定研究中應(yīng)用最廣泛的靶標(biāo)序列。本研究基于仿刺參線粒體COX1基因、NAD4（脫氫酶基因亞基Ⅳ）基因分別設(shè)計特異性檢測引物和探針，采用TaqMan探針實時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)進(jìn)行仿刺參的特異性物種鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉和肉制品DNA提取試劑盒（Takara Code：D830）、Premix Ex Taq?（Takara Code：RR390A）、引物、探針由寶生物工程（大連）有限公司合成。本研究將21種在中國境內(nèi)作為商品進(jìn)行銷售的海參作為實驗樣本（表1），其中仿刺參10種、其他種海參11種。所有實驗樣本均參考《中國動物志：棘皮動物門：海參綱》[2]及相關(guān)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫[6-11]進(jìn)行嚴(yán)格的形態(tài)學(xué)鑒定，確保實驗樣品的準(zhǔn)確性。

表1 海參樣品信息Table1 List of sea cucumber samples

1.2 儀器與設(shè)備

Light Cycler?480實時熒光PCR儀 瑞士Roche 公司；Biofuge Primo R高速離心機 德國Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 引物和探針設(shè)計

本研究采用DNAMAN V6進(jìn)行序列比對，使用Primer Express 3.0進(jìn)行引物及探針設(shè)計，根據(jù)仿刺參COX1基因序列設(shè)計引物COXF/COXR和探針COXP；根據(jù)仿刺參NAD4基因序列設(shè)計引物NADF/NADR和探針NADP，均用于特異性地鑒別仿刺參。所有引物和探針均通過BLAST進(jìn)行確認(rèn)，理論上不存在非特異性擴增的可能性。

表2 仿刺參COX1基因和NAD4基因鑒定的引物和探針序列Table2 The primer and probe sequences designed based on the COX1 and NAD4 genes of Apostichopus japonicas

1.3.2 核酸提取

取50 mg海參體壁（用滅菌剪刀盡量剪碎），放入裝有0.5 mL DNA提取試劑的離心管中。將離心管置于水浴鍋中70 ℃加熱10 min（每隔2～3 min用手輕彈混勻）。然后置于離心機中12 000 r/min離心10 min（4 ℃）。此時離心管中將會分成4 層，即油脂層、含DNA的水層、組織殘渣、吸附樹脂。用移液槍吸取250 μL含DNA的水層作為PCR的模板。

1.3.3 實時熒光PCR擴增及結(jié)果判定

反應(yīng)體系總體積為25 μL，其中：模板 DNA（10～100 μg/mL）2 μL、正向和反向引物（10 μmol/L）各0.5 μL、探針（5 μmol/L）1 μL、Premix Ex Taq?（2×）12.5 μL、水8.5 μL。

反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性30 s（1 個循環(huán)）；95 ℃變性5 s，60 ℃退火/延伸34 s（40 個循環(huán)）。熒光閾值為設(shè)備默認(rèn)值。

參照SN/T 2051—2008《食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測方法：實時PCR法》[12]，結(jié)果判定原則為：擴增曲線指數(shù)期明顯，且Ct≤35.0判定為陽性，表明檢測樣本為仿刺參。除此以外，均判定為陰性。

1.3.4 特異性和重復(fù)性實驗

以22種海參DNA為模板，分別采用表2中的COX1和NAD4引物探針進(jìn)行方法的特異性實驗。每個樣品做3個平行實驗，并計算Ct值的平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差及變異系數(shù)，從而評估檢測方法的重復(fù)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性

如圖1所示，表1中編號為A.jap 1～10的10種仿刺參樣品，分別采用COX1引物探針和NAD4引物探針進(jìn)行實時熒光PCR擴增，擴增曲線指數(shù)期明顯，且Ct≤35.0（表3），即檢測結(jié)果均為陽性。而表1中的其他11種海參的檢測結(jié)果均為陰性。結(jié)果表明，本研究針對COX1基因和NAD4基因設(shè)計的引物和探針均能特異性地鑒別檢測仿刺參。

圖1 采用COX1引物探針（A）和NAD4引物探針（B）進(jìn)行實時熒光PCR擴增的圖譜Fig.1 Real-time PCR amplification plots with COX1 probe (A) and NAD4 probe (B)

2.2 重復(fù)性

表3 方法的重復(fù)性實驗結(jié)果Table3 Repeatability of the proposed PCR method

以編號為A.jap 1～10的10種仿刺參為對象，針對COX1基因和NAD4基因，每個樣品做3份平行檢測，以驗證方法的重復(fù)性，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，本研究所建立的檢測方法的變異系數(shù)均小于2%，即方法的平行檢測Ct值基本無差別，檢測方法具有良好的重復(fù)性。

3 3 討 論

海參、魚類等水產(chǎn)加工品的真?zhèn)舞b定目前已經(jīng)成為水產(chǎn)加工業(yè)中面臨的重要問題。傳統(tǒng)鑒定方法的主要依據(jù)是海參的外部形態(tài)與骨片特征。廖玉麟等[2]根據(jù)傳統(tǒng)鑒定方法對我國134種海參進(jìn)行了詳盡的統(tǒng)計。然而，目前的商品海參通常經(jīng)過蒸煮、腌制、烘烤、曬干等加工過程，最終以干品形式進(jìn)行銷售。因此，商品海參與活體海參在外部形態(tài)上存有較大差異。骨片指的是海參真皮表層所包含的內(nèi)骨骼，其形狀、大小常隨種類而異，因此成為海參種類鑒定的主要手段[2]。但是，某些海參并非僅具有唯一一種骨片樣式，例如綠刺參（Stichopus chloronotus）、智利海參（Athyonidium chilensis）就存在3種類型的骨片，而紅腹海參（Holothuria edulis）則有4種骨片樣式[13]。因此，應(yīng)用傳統(tǒng)方法鑒定海參的工作僅限于具有豐富鑒別經(jīng)驗的專業(yè)人員，這使得對海參種類的鑒別難以普及。而加工后的海參更無法從形態(tài)上加以鑒別，需要采用分子生物學(xué)方法手段才能得以實現(xiàn)。

分子生物學(xué)技術(shù)是目前物種鑒定領(lǐng)域中應(yīng)用最為廣泛的一類方法，能夠有效地解決生物體表現(xiàn)型無法真實反映物種種類的問題。目前，已有許多研究采用了分子生物學(xué)技術(shù)對海參、魚類等水產(chǎn)加工品進(jìn)行物種鑒別。姚琳等[14]綜述了基于DNA檢測技術(shù)鑒定水產(chǎn)加工品原料的研究進(jìn)展，分析了不同鑒定方法的優(yōu)缺點，舉例說明了這些方法的實際應(yīng)用。李新光[15]和Zhang[16]等應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)進(jìn)行魚肉及其制品鑒別研究。梁君妮等[17]根據(jù)海參COX1基因與16S rRNA基因分別設(shè)計引物，采用普通PCR、克隆、測序等技術(shù)鑒別了包括仿刺參在內(nèi)的11種海參。文菁等[18]應(yīng)用3種核酸內(nèi)切酶對海參16S rRNA基因片段的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，建立了應(yīng)用限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)鑒定16種海參的方法。律迎春等[19]應(yīng)用普通PCR、硝酸纖維素膜斑點雜交技術(shù)對仿刺參進(jìn)行特異性的鑒定，并初步驗證了斑點雜交方法應(yīng)用于海參品種鑒定的可行性。陳麗梅等[20]利用COI基因分析了4種海參的進(jìn)化關(guān)系。然而，上述方法均存在著操作繁瑣、不易推廣的缺點。與前述方法相比，實時熒光PCR技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、簡便的優(yōu)勢，并在蝦[21]、魚[22]、鹿[23]等真?zhèn)舞b別中被廣泛應(yīng)用。

本研究在設(shè)計引物和探針的過程中發(fā)現(xiàn)，不同種群仿刺參的COX1、NAD4基因在某些位點上存在堿基的單點突變，而這一發(fā)現(xiàn)某些研究結(jié)論相一致[24-25]。然而突變堿基的位點并無規(guī)律可言，且基因內(nèi)的其他位點能否會出現(xiàn)類似的單點突變也很難斷定。針對這一問題，本研究一方面在設(shè)計引物及探針過程中盡量避開堿基突變的位點，另一方面又建立了針對線粒體COX1和NAD4基因同時特異性檢測的方法，增加了鑒定結(jié)果的可靠性。

本研究應(yīng)用實時熒光PCR技術(shù)，建立了一種快速鑒定仿刺參物種的方法。整個檢測過程可在2 h內(nèi)完成。此方法既克服了傳統(tǒng)海參鑒別的局限性，同時又結(jié)合了熒光PCR技術(shù)高效率、低污染的優(yōu)點，為仿刺參的真?zhèn)舞b別研究提供了有價值的參考意見。

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Rapid Identification of Apostichopus japonicas by Real-Time Fluorescence Polymerase Chain Reaction

CAO Ji-juan1, XU Jun-yi1, XU Yang1, RONG Ce2, CHEN Ying3
(1. Liaoning Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Dalian 116001, China; 2. School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China; 3. Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100123, Chin a)

Objective: This study aimed to establish a rapid method for specific identification of Apostichopus japonicas (A. japonicas) by TaqMan?probe real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR). Methods: Two sets of specific primers and probes were designed based on the COX1 and NAD4 genes of A. japonicas. Twenty-one sea cucumber samples were detected by RT-qPCR in three parallel repetitions for each sample. The average Ct value, standard deviation and coefficient of variation were calculated to evaluate the repeatability of the proposed detection method. Results: All the coefficients of variations obtained were under 2%, indicating the good repeatability and stability of this method. This is an efficient and handy method for rapid identification of A. japonicas, which overcomes the limitation of the conventional approach, and combines the merits of high efficiency and low pollution of real-time PCR. Conclusion: This study would provide a valuable reference for the identification and detection of A. japonicas.

real time fluorescence polymerase chain reaction; identification; Apostichopus japonicus

S917.4

A

1002-6630（2014）08-0145-04

10.7506/spkx1002-6630-201410026

2013-09-10

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2011AA00807）

曹際娟（1968—），女，研究員，博士，研究方向為食品安全。E-mail：caojijuanlnciq@163.com