譚志偉，余愛農(nóng)，劉應煊

（湖北民族學院化學與環(huán)境工程學院，湖北 恩施 445000）

水分含量對L-抗壞血酸-L-半胱氨酸Maillard反應體系中揮發(fā)性產(chǎn)物的影響

譚志偉，余愛農(nóng)，劉應煊

（湖北民族學院化學與環(huán)境工程學院，湖北 恩施 445000）

采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯(lián)用技術對L-抗壞血酸-L-半胱氨酸反應體系在不同水分含量下的產(chǎn)物進行鑒定，共鑒定出包括噻吩、硫雜環(huán)、噻唑、硫醇、呋喃和硫醚等在內(nèi)的62 種化合物，其中23 種噻吩化合 物和13 種硫雜環(huán)化合物為2 種主要揮發(fā)性產(chǎn)物。結果表明，水分含量對硫雜環(huán)類化合物和噻吩類化合物影響明顯，而對其他幾類揮發(fā)性產(chǎn)物的影響不大。隨水分含量的增加，硫雜環(huán)類產(chǎn)物中3,5-二甲基-1,2,4-三硫環(huán)戊烷2種異構體和4,6-二甲基-1,2,3,5-四噻烷3種產(chǎn)物在水分含量為55%時有極大值；2,4,6-三甲基-1,3,5-三噻烷的2種異構體隨水分含量的增加而緩慢下降，3-甲基-1,2,4-三噻烷在水分含量為45%有極小值。噻吩類產(chǎn)物中，噻吩、2-甲基噻吩、[3,2-b]并二噻吩、2-甲基[2,3-b]并二噻吩和2-甲基-3-巰基噻吩分別在水分含量為75%、55%、85%、65%和15%時達到最大值。

Maillard反應；抗壞血酸-半胱氨酸；水分含量；噻吩；硫雜環(huán)化合物

Maillard反應是發(fā)生在羰基化合物（如還原糖）和氨基化合物（如氨基酸和蛋白質）之間的一類非酶褐變反應?？箟难釓V泛存在水果、蔬菜及動物肝臟等許多食品中，且常作為食品添加劑（如抗氧化劑）添加到食品中，因此繼還原糖之后，基于抗壞血酸-氨基酸Maillard反應體系的研究越來越多[1-12]。影響Maillard反應結果的因素非常多，主要有反應物（氨基化合物和羰基化合物）的性質、濃度和 配比，水分活度和含量，加熱溫度和時間，反應體系的pH值、緩沖體系種類及濃度，以及氧、光和金屬離子等[13]。本課題組研究了pH值[8-10]、反應溫度和時間[11-12]對L-抗壞血酸-氨基酸體系揮發(fā)性產(chǎn)物的影響。在食品的加工和貯存工藝中，水分含量和水分活度是重要的工藝參數(shù)，直接影響食品的色、香及其質量等級。水分含量和水分活度對Maillard反應體系中褐變速率影響[14-17]以及對揮發(fā)性產(chǎn)物的影響[18-19]很早就引起研究人員的關注，Casey等[18]認為多糖-氨基酸反應體系在有水和無水條件下，產(chǎn)物中香氣成分產(chǎn)生的模式和速率在定性和定量方面都存在差別；Hartman等[3]報道了水分活度對模擬肉味反應體系中主要香氣成分定性和定量的影響。

含硫氨基酸（如半胱氨酸）是通過Maillard反應產(chǎn)生肉味香氣必不可少的成分[19]，已有研究報道了pH值對L-抗壞血酸-L-半胱氨酸Maillard反應體系中香味化合物特別是肉香味化合物產(chǎn)生的影響[8-10]，但目前為止沒有關于水分含量對L-抗壞血酸-L-半胱氨酸反應體系中香氣成分的影響的報道。鑒于此，本研究將L-抗壞血酸-L-半胱氨酸反應體系在不同組成的水和丙三醇中加熱反應，以頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯(lián)用（heads pace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）技術分析反應產(chǎn)物中的揮發(fā)性成分，研究水分含量對模型反應形成香味化合物的影響，為L-抗壞血酸-L-半胱氨酸Maillard反應體系的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-抗壞血酸、甘油、Na2H PO4、Na H2PO4、NaOH（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；L-半胱氨酸（分析純） 上海源聚生物科技有限公司；C5～C22正構烷烴標準品 美國Pure Chemical Analysis公司；實驗用水均為二次蒸餾水。

1.2 儀器與設備

6890N氣相色譜-質譜聯(lián)用儀、DB-5MS毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國Agilent公司；固相微萃取手動進樣器、DVB/CAR/PDMS（50/30 μm）固相微萃取頭 美國Supelco公司；ALC-210.3型精密電子天平 德國Sartorius公司；PHSJ-4A型pH計 上海金鵬分析儀器有限公司；MSC-400型磁力加熱攪拌器 德國Wiggen Hauser公司；P160004厚壁耐壓反應瓶 北京欣維爾玻璃儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

準確稱取0.704 5 g L-抗壞血酸和0.484 7g L-半胱氨酸，加入到由不同體積（40、38、34、30、26、22、18、14、10、6、2、0 mL）的甘油和不同體積（對應為0、2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、40 mL）的0.20 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液（pH 8）組成的油-水體系中，攪拌，使其完全溶解，用100 mL厚壁耐壓反應瓶密封，在（140±2）℃油浴中攪拌加熱，反應120 min后用冷水快速冷卻至室溫，在冰箱中保存，以考察不同水分含量（磷酸鹽緩沖溶液占整個油水體系的體積百分比，分別為0、5%、15%、25%、35%、45%、55%、65%、75%、85%、95%和100%）對反應產(chǎn)物中香氣成分生成的影響。

1.3.2 HS-SPME-GC-MS分析

1.3.2.1 HS-SPME

取7 mL反應液置于15 mL專用萃取瓶中，在40℃平衡15 min后，插入DVB/CAR/PDMS（50/30 μm）固相微萃取頭，在40℃頂空萃取40 min，隨即采用GC-MS進行分析。固相微萃取頭插入進樣口在250℃解吸4 min。

1.3.2.2 色譜條件

色譜柱：DB-5MS毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：40 ℃保溫5min，再以5 ℃/min升溫至260 ℃，然后以15 ℃/min升溫至280 ℃，保溫1 min；接口溫度280 ℃；分流比1：30。

1.3.2.3 質譜條件

電子電離源；電子能量70 eV；電子倍增電壓1 753 V；質量掃描范圍m/z 30～400；掃描速率1 scan/s。C5～C22正構烷烴在相同條件下分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)C5～C22正構烷烴的停留時間計算待測化合物的線性保留指數(shù)（linear retention index，LRI）。經(jīng)計算機檢索與標準譜圖庫NIST 08譜庫和Wiley275譜庫相匹配，對正反匹配度均大于800（最大值為1000）的化合物計算LRI并與文獻（http: // webbook. nist.gov/chemistry/nameser.html）報道的LRI進行比較，以輔助定性。被分離鑒定化合物的峰面積采用Agilent GC-MS工作站在設定積分閾值為16.5時積分獲得。

2 結果與分析

2.1 水分含量對各類揮發(fā)性產(chǎn)物的影響

由圖1、表1可知，在該反應體系中，共分離鑒定出62 種化合物，其中包括23 種噻吩類、13 種硫雜環(huán)類、11 種噻唑類、5 種硫醇、2 種呋喃、2 種硫醚類及6 種其他類型化合物，沒有檢出吡嗪類化合物。噻吩類和硫雜環(huán)類化合物為該反應體系中主要揮發(fā)性產(chǎn)物。如圖2所示，水分含量對硫雜環(huán)類化合物和噻吩類化合物影響明顯，硫雜環(huán)類化合物的含量在水分含量為55%時有最大值；噻吩類化合物的總含量在水分含量為0%～35%時，存在緩慢下降的趨勢，隨后緩慢增加，在水分含量為65%時達到最大值。其他幾類化合物的量隨水分含量增加無明顯變化。

表1 不同水分含量條件下的揮發(fā)性化合物含量（pH 8、反應時間120 min）Table1 Volatile compounds from the Maillard reaction of -ascorbic acid and -cysteine at pH 8 for 120 min at different water contents

續(xù)表1

圖1 1L-抗壞血酸--L-半胱氨酸反應體系的總離子流圖（水分含量為55%）55%Fig.1 Total ion chromatogram of volatile compounds generated from the model system containing L-ascorbic acid and L-cysteine at the water content of 55%

圖2 水分含量對L-抗壞血酸--L-半胱氨酸反應體系中各類揮發(fā)性產(chǎn)物的影響Fig.2 Effect of water content on volatile compounds generated from the model system co ntaining L-ascorbic acid and L-cysteine

2.2 噻吩類化合物

該反應體系中共檢出23種噻吩類化合物，其中噻吩、2-甲基噻吩、2,3-二氫-5-甲基噻吩、3-乙基噻吩、2,5-二甲基噻吩、2,3-二甲基噻吩、2-乙基-5-甲基噻吩、2-巰基噻吩、3-乙酰基噻吩、2-巰甲基噻吩、2-戊基噻吩、二氫并二噻吩、2-甲基[2,3-b]并二噻吩和甲基二氫并二噻吩共14種化合物通過質譜數(shù)據(jù)匹配對比和LRI定性，其余9種噻吩化合物，包括2,5-二氫噻吩、2-甲氧基-5-甲基噻吩、2-甲基-3-巰基噻吩、（反式或順式）2-甲基-5-丙基噻吩、（反式或順式）2-甲基-5-丙基噻吩、[2,3-b]并二噻吩、[3,2-b]并二噻吩、4-羥基苯并噻吩和2,5-二乙基噻吩，由質譜數(shù)據(jù)匹配對比鑒定。

2-甲基噻吩、2,5-二甲基噻吩具有在高壓下煮牛肉和燒牛肉氣味，在模擬牛肉香精中[19]、肌酐-5’-單磷酸鹽與半胱氨酸的反應體系中[20]被檢出；2-甲基-3-巰基噻吩為3-巰基取代噻吩，是唯一具有肉味香氣的噻吩類化合物[21]；3-乙 ?；绶栽诔纯Х萚22]、核糖與半胱氨酸熱反應體系中[23]檢出，具有辛辣香氣；[2,3-b]并二噻吩、[3,2-b]并二噻吩和2-甲基[2,3-b]并二噻吩在核糖與半胱氨酸的Maillard反應體系中[24]被檢出。

圖3 水分含量對L-抗壞血酸--L-半胱氨酸反應體系中主要噻吩類化合物的影響Fig.3 Effect of water content on thiophenes generated from the model system containing L-ascorbic acid and L-cysteine

如圖3所示，水分含量對2-巰基噻吩生成影響不大，噻吩、2-甲基噻吩、[3,2-b]并二噻吩、2-甲基[2,3-b]并二噻吩在水分含量為35%以下含量變化不大，隨后含量隨水分含量的增加而增加，分別在水分含量為75%、55%、85%和65%時達到最大值，隨后下降。2-甲基-3-巰基噻吩在丙三醇為溶劑時的含量就比較大，水分含量達到15%時達到最大值，隨后保持下降趨勢；二氫 并二噻吩的含量隨水分含量的變化趨勢比較特別，在丙三醇溶劑中其含量為最大值，隨水分含量的增加迅速下降，在水分含量為35%時達到最低值，隨后又緩慢上升，直到水分含量為65%時再次達到一個極值，隨后又下降。噻吩類化合物在Maillard反應中主要由呋喃甲醛與硫化氫反應生成或由巰基甲醛與α,β-不飽和醛類縮合而成[23]，呋喃甲醛、硫化氫、巰基甲醛和α,β-不飽和醛類等中間產(chǎn)物由L-抗壞血酸和L-半胱氨酸的熱降解產(chǎn)生，而噻吩、[2,3-b]并二噻吩、[3,2-b]并二噻吩為L-半胱氨酸在pH 8的磷酸緩沖體系中的降解產(chǎn)物[25]，因此水分含量對幾種主要的噻吩類化合物形成的影響與丙三醇的加入對L-抗壞血酸和L-半胱氨酸熱降解產(chǎn)物的影響有關，其影響機理和甘油本身是否參與反應還需要進一步研究。

2.3 硫雜環(huán)化合物

硫雜環(huán)化合物是該反應體系產(chǎn)生的揮發(fā)性產(chǎn) 物中含量最高的物質，共檢出并鑒定出13種化合物，其中1,3,5-三噻烷、（順或反）-3,5-二甲基-1,2,4-三硫環(huán)戊烷（32和33）、3-甲基-1,2,4-三噻烷和（順或反）-4,6-二甲基-1,2,3,5-四噻烷（56和58）共6個化合物通過質譜數(shù)據(jù)匹配對比和LRI定性，其余物質，包括1,2,5-三硫環(huán)庚烷、（順或反）-4,6-二甲基-[1,2,3]三噻烷（44和54）、（順或反）-2,4,6-三甲基-1,3,5-三噻烷（51和53)、[1,2,3,4]四噻烷、1,2,5,6-四噻烷共7個化合物由質譜數(shù)據(jù)匹配定性。

如圖4所示，其中（順或反）-4,6-二甲基-1,2,3,5-四噻烷、1,2,5,6-四噻烷的含量隨水分含量的增加基本保持不變，3-甲基-1,2,4-三噻烷的含量隨水分含量的增加先緩慢下降，在45%時達到極小值隨后緩慢上升，（順或反）-3,5-二甲基-1,2,4-三硫環(huán)戊烷（32和33）和（順或反）-4,6-二甲基-1,2,3,5-四噻烷隨水分含量的增加而增加，在水分含量為55%時達到極大值。在檢出的硫雜環(huán)化合物中，（順或反）-3,5-二甲基-1,2,4-三硫環(huán)戊烷（32和33）是重要的肉類香氣成分，在低濃度時具有肉味、水煮牛肉味香氣特征，在高濃度時具有洋蔥味、硫磺樣香氣特征[26]，是一些煮熟的食物中[27]和葡萄糖與半胱氨酸反應體系的主要揮發(fā)性產(chǎn)物[28]。這些硫雜環(huán)化合物一般由醛類化合物、硫化氫和巰基乙醛縮合而成[24]，而這些中間產(chǎn)物是L-抗壞血酸和L-半胱氨酸熱降解產(chǎn)物[29-30]。（順或反）-4,6-二甲基-1,2,3,5-四噻烷的形成機理已有報道[25]，是由L-抗壞血酸的熱解產(chǎn)物丙酮醇與L-抗壞血酸和L-半胱氨酸的熱解產(chǎn)物乙醛經(jīng)過羥醛縮合反應，與硫化氫發(fā)生羰基還原反應，其中間產(chǎn)物再經(jīng)過氧化閉環(huán)、脫水和還原等一系列反應而最終形成該化合物。水分含量對該反應體系中這類化合物的影響主要是由水分含量和丙三醇對L-半胱氨酸和L-抗壞血酸的熱降解及中間產(chǎn)物之間的縮合反應產(chǎn)生影響而引起的。

圖4 水分含量對L-抗壞血酸--L-半胱氨酸反應體系中主要硫雜環(huán)化合物的影響Fig.4 Effect of water content on sulfur-containing heterocyclic compounds generated from the model system containing L-ascorbic acid and L-cysteine

2.4 其他化合物

該反應體系中還檢出呋喃和2-甲基呋喃，前者在低水分含量時（0%和5%）沒有檢出，在水分含量為15%以上時都有檢出，但其含量隨水分含量的變化無明顯規(guī)律。2-甲基呋喃的量先隨水分含量的增加而增加，水分含量為55%時達到極大值，隨后下降。該體系中，呋喃和2-甲基呋喃為L-抗壞血酸的降解產(chǎn)物[31]，雖然它們不具有肉味香氣特征，但可以促進燒、烤肉味的香氣[32]。

該反應體系的揮發(fā)性產(chǎn)物中檢出的11種噻唑類化合物，在低水分含量時均沒有檢出，在高水分含量 時，含量也不高。該類化合物存在于各類食物體系中，具有各種食物的香氣特征，在該反應體系中檢出的5-甲基噻唑和3-丙基噻唑等烷基單取代噻唑類化合物具有綠色植物的香氣，2,4-二甲基噻唑、2,4,5-三甲基噻唑、5-乙基-2-甲基噻唑、4-乙基-2,5-二甲基噻唑、5-乙基-2,4-二甲基噻唑、2,5-二乙基-4-甲基噻唑和4-乙基-3-丙基噻唑等多取代噻唑化合物一般擁有堅果、烤香和肉味香氣特征[33]。2,4,5-三甲基噻唑、2-乙?；邕蚝?-乙基-2,4-二甲基噻唑存在于烤肉中香氣成分中[34]。噻唑類化合物形成機理中的關鍵步驟為：L-半胱氨酸的熱解產(chǎn)物氨氣與L-抗壞血酸的熱解產(chǎn)物乙醛反應生成1-氨基乙醇，1-氨基乙醇與α-二羰基化合物（L-抗壞血酸的熱解產(chǎn)物）反應生成的中間產(chǎn)物再與硫化氫（L-半胱氨酸熱降解產(chǎn)物）反應后經(jīng)環(huán)化、脫水反應最終生成噻唑類化合物[35]。因此，該反應體系中，在低水分含量時沒有噻唑類化合物產(chǎn)生的可能原因是低水分含量時L-半胱氨酸熱解時不利于生成氨氣，而在高水分含量時，因體系處于弱堿性緩沖溶液中，更有利于氨氣的生成。

另外，在該反應體系中還檢出了5種硫醇類化合物，其中2-甲基-3-呋喃硫醇、2-呋喃甲硫醇和4-甲基-1,2,-苯二硫酚隨水分含量的增加先上升后下降，分別在水分含量為45%、65%和65%時達到最大值。2-甲基-3-呋喃硫醇被認為在肉味香氣中起重要作用[36]，此外，該物質還與2-呋喃甲硫醇一起在雞肉和牛肉湯中和肌酐-5’-單磷酸鹽與半胱氨酸的反應體系中作為高價值的香味物質被檢出[20]。二巰乙基硫醚在高水分含量時沒有檢出，4-甲基-1,2-苯二硫酚隨水分含量的增加先上升，在65%時達到極大值，隨后下降。二乙基二硫醚、二硫化碳、3,4-二乙基-2-甲基吡咯和二苯亞砜幾種化合物只在高水分含量時被檢出，間甲苯基乙硫醚和2-甲基-3-硫環(huán)戊酮在該反應體系中的揮發(fā)性產(chǎn)物中少量存在，2,4-二叔丁基苯酚和硫分別為L-抗壞血酸和半胱氨酸的熱解產(chǎn)物，隨水分含量的增加而下降。

3 結 論

本研究采用HS-SPME-GC-MS對L-抗壞血酸-L-半胱氨酸反應體系在pH 8、140℃條件下反應120 min時的揮發(fā)性產(chǎn)物進行了分離和鑒定，并考察了不同水分含量對揮發(fā)性產(chǎn)物的影響。研究表明，噻吩類和硫雜環(huán)類化合物為該反應體系的主要揮發(fā)性產(chǎn)物；水分含量對硫雜環(huán)類化合物和噻吩類化合物影響明顯，而對其他幾類揮發(fā)性產(chǎn)物的影響不大。隨水分含量的增加，3,5-二甲基-1,2,4-三硫環(huán)戊烷2種異構體和4,6-二甲基-1,2,3,5-四噻烷3種產(chǎn)物均增加，在水分含量為55%時達到極大值，隨后下降；2,4,6-三甲基-1,3,5-三噻烷的2種異構體隨水分含量的增加呈緩慢下降趨勢，3-甲基-1,2,4-三噻烷隨水分含量增加先下降，水分含量達到45%達到最低值，隨后又緩慢增加。在噻吩類揮發(fā)性產(chǎn)物中，噻吩、2-甲基噻吩、[3,2-b]并二噻吩、2-甲基[2,3-b]并二噻吩在水分含量為35%以下時含量變化不大，隨后含量隨水分含量的增加而增加，分別在水分含量為75%、55%、85%和65%時達到最大值，隨后下降。2-甲基-3-巰基噻吩在丙三醇為溶劑時的含量就比較高，水分含量達到15%時達到最大值，隨后保持下降趨勢；二氫并二噻吩的含量隨水分含量的變化比較特別，在丙三醇中含量最大，隨水分含量的增加迅速下降，在水分含量為35%時達到最低值，隨后又緩慢上升，直到水分含量為65%時再次達到一個極值，隨后又下降。本研究結果可對抗壞血酸與氨基酸的Maillard反應體系中揮發(fā)性產(chǎn)物的形成機理研究提供參考。

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Effect of Water Content on Generation of Volatile Compounds from Maillard Reaction of L-Ascorbic Acid and L-Cysteine

TAN Zhi-wei, YU Ai-nong, LIU Ying-xuan
(School of Chemistry and Environmental Engineering, Hubei University for Nationalities, Enshi 445000, China)

The identification of volatile compounds generated from the Maillard reaction of L-ascorbic acid and L-cystei ne under different water content conditions was performed using headspace solid-phase microextraction-gas chromatographymass spectrometry (HS-SPME-GC-MS). Sixty-two volatile compounds were identified, including thiophenes, sulfurcontaining heterocyclic compounds, thiazoles, thiols, furans and thioethers. Meanwhile, 23 thiophenes and 13 sulfurcontaining heterocyclic compounds were the major volatile compounds in the Maillard reaction products. The effect of water content on the generation of volatile compounds was investigated. The results showed that water content had significant effect on the formation of sulfur-containing heterocyclic compounds and thiophene compounds, but had little effect on other volatile products. Among these sulfur-containing heterocyclic products, two isomers of 3,5-dimethyl-1,2,4-trithiolane and 4,6-dimethyl-1,2,3,5-tetrathiane had the maximum concentration when the water content was 55%. The concentration of two isomers of 2,4,6-trimethyl-1,3,5-trithiolane decreased with increasing water content, and 3-methyl-1,2,4-trithiane had a minimum level at the water content of 45%. However, thiophene products, such as thiophene, 2-methylthiophene, thieno[3,2-b]thiophene, 2-methylthieno[2,3-b]thiophene and 2-methyl-3-thiophenethiol reached a maximum level at the water contents of 75%, 55%, 85%, 65% and 15%, respectively.

Maillard reaction; ascorbic acid-cysteine; water content; thiophene; sulfur-containing heterocyclic compounds

TS201.7

A

1002-6630（2014）10-0132-07

10.7506/spkx1002-6630-201410024

2013-07-13

國家自然科學基金地區(qū)科學基金項目（31360408）；湖北省教育廳自然科學研究項目（B2011901）

譚志偉（1977—），男，副教授，碩士，研究方向為食品化學及食用香料合成。E-mail：tanzw1112@sohu.com