鐘城城，曲有樂，陳 蔭

（1.佳木 斯大學(xué)食品與藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2.浙江海洋學(xué)院食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江 舟山 316000）

厚殼貽貝多糖的提取工藝優(yōu)化及體外生物活性研究

鐘城城1，曲有樂2,*，陳 蔭2

（1.佳木 斯大學(xué)食品與藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2.浙江海洋學(xué)院食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江 舟山 316000）

以抗氧化和抗腫瘤活性為指導(dǎo)優(yōu)化提取工藝，分別采用熱水提取，兩步聯(lián)合酶解法（木瓜蛋白酶和胰蛋白酶）從厚殼貽貝中提取和分離純化具有生物活性的貽貝多糖，對其進(jìn)行基本理化性質(zhì)分析和DEAE-Cellulose 52柱層析分離純化并進(jìn)行體外抗氧化、抗腫瘤生物活性研究。通過對熱水提取法，單一酶提法和聯(lián)合酶提取法得到的貽貝多糖粗品進(jìn)行理化性質(zhì)分析和活性篩選，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合酶解提取得到的貽貝粗多糖在得率、純度和生物活性上均優(yōu)于其他方法提取得到的粗多糖，其提取粗多糖的得率為23.69%。聯(lián)合酶提粗多糖體外抗氧化研究表明其對DPPH自由基、超氧陰離子自由基和脂質(zhì)過氧化物清除的半最大效應(yīng)濃度（concentration for 50% of maximal effect，EC50）分別為3.75、5.01 mg/mL和2.41 mg/mL；對體外前列腺癌DU-145細(xì)胞48 h，IC50為2.93 mg/mL。通過分離純化后對各組分的得率和組成分析表明：聯(lián)合酶提可提高貽貝多糖類糖胺聚糖（MT3）的含量，并達(dá)到13.5%，單糖組成主要為Man、GlcN、GlcUA、Gal和Fuc，分子質(zhì)量約為18 kD。和其他組分相比，MT3 組分表現(xiàn)出良好的體外抗腫瘤活性，對體外前列腺癌DU-145細(xì)胞48 h，IC50為2.71 mg/mL。通過活性追蹤和工藝優(yōu)化結(jié)果表明，熱水提取后酶解工藝不僅可以降解蛋白提高多糖的純度，而且還可以顯著提高貽貝多糖中類糖胺聚糖的含量，而貽貝類糖胺聚糖是貽貝多糖的主要活性組分，具有良好的抗腫瘤活性。

貽貝；多糖；提取工藝；抗氧化；抗腫瘤

厚殼貽貝（Mytilus coruscus）為海洋軟體動物門雙殼綱貝類，又名海紅、淡菜，其營養(yǎng)豐富，富含活性物質(zhì)，是食藥兩用經(jīng)濟(jì)貝類，在浙江舟山海域分布尤為廣泛。我國古代對貽貝的藥用價值就有研究，《本草匯言》載：淡菜，補虛養(yǎng)腎之藥也[1]?，F(xiàn)代研究也證實，貽貝提取物具有多種藥理活性，包括抗動脈粥樣硬化、降血脂、抑制血小板的凝固、抗氧化及抗腫瘤作用[2]。近年來有研究表明厚殼貽貝含有抗腫瘤多糖類物質(zhì)，是貽貝的重要活性成分之一，受到了廣泛的關(guān)注，成為海洋動物多糖研究中重要的組成內(nèi)容[3]。因此，為推動海洋多糖藥物的研究，特別是從海洋軟體動物資源寶庫中開發(fā)抗衰老，抗腫瘤的多糖藥物[4]，以來自浙江舟山的新鮮厚殼貽貝中提取多糖，優(yōu)化貽貝多糖提取工藝，對活性多糖組分進(jìn)行追蹤和分離純化，旨在以活性為指導(dǎo)從工藝優(yōu)化的角度為促進(jìn)舟山海域厚殼貽貝多糖的研究和進(jìn)一步高值化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

厚殼貽貝購自浙江省舟山市南珍市場，經(jīng)浙江海洋學(xué)院趙盛龍教授鑒定為厚殼貽貝；前列腺癌細(xì)胞DU-145細(xì)胞株 中國科學(xué)院上海細(xì)胞所；胰蛋白酶 廣西南寧龐博生物工程有限公司；木瓜蛋白酶 亞太恒信生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazalone，PMP）、牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）、透析袋MD34 （3 500） 上海歐韋達(dá)儀器科技有限公司；DEAE-Cellulose 52離子膠 上海富眾生物科學(xué)有限公司；F12 粉培養(yǎng)基 美國Sigma公司；小牛血清 浙江天杭生物科技有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

Shodex OH pak SB-804 HQ凝膠色譜柱 北京京京時代科技發(fā)展有限公司；RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（配有液晶顯示界面、數(shù)顯轉(zhuǎn)速） 上海亞榮生化儀器廠；UV-1800PC紫外-可見分光度計（配有 128×64 位液晶顯示器） 上海美譜達(dá)儀器有限公司；1100高效液相色譜儀（配有二極管陣列（diode array detector，DAD）檢測器和B.04.0X色譜工作站） 安捷倫科技有限公司；CF16RXII 高速冷凍離心機(jī) 日本Hitachi公司；ZHJHC1209C型超凈工作臺 上海智誠分析儀器制造有限公司；Forma 3111型CO2恒溫培養(yǎng)箱 美國Thermo公司；CKX41-A32RC型倒置顯微鏡（配有UIS2光學(xué)系統(tǒng)、三目電光源） 日本Olympus公司；680型全自動酶標(biāo)儀 美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 熱水提取厚殼貽貝粗多糖（RT粗多糖）

取新鮮的厚殼貽貝，洗凈蒸熟后勻漿，5 000 r /min離心15 min，取沉淀，經(jīng)丙酮脫脂，于50 ℃干燥箱中烘干成丙酮粉。通過對料液比（g/mL）、溫度、提取時間、次數(shù)以及乙醇沉淀等因素，確定最佳條件[5]。

1.2.2 酶法提取厚殼貽貝粗多糖（MT粗多糖）

選擇不同浸提時間、酶用量、料液比、溫度、pH值，5 個因素進(jìn)行單因素試驗，探索厚殼貽貝多糖提取的較佳工藝參數(shù)，確定各因素最佳水平后，取熱水提取物，采用四因素三水平進(jìn)行正交試驗方法，四因素分別為加酶量、pH值、溫度、料液比。聯(lián)合酶法提取分析，加酶量（0.5、1、2%）、木瓜蛋白酶選取pH值（5、6、7）、胰蛋白酶選取pH值（8、9、10）、酶解溫度（40、50、60 ℃）、料液比（1：10、1：20、1：30）。以貽貝粗多糖的得率為考察指標(biāo)，按L9（34）正交表進(jìn)行試驗組合確定各酶的最佳酶解條件后，滅酶15 min后冷卻，調(diào)節(jié)pH值至中性，離心，取上清液旋蒸濃縮，用3 倍體積95%乙醇沉降過夜，收集沉淀，用乙醇和丙酮洗滌，透析，冷凍干燥后即得兩步聯(lián)合酶解法提取粗多糖[6]。

1.2.3 貽貝多糖的分離純化

離子交換柱層析法[7]。采用 DEAE-Cellulose 52陰離子交換柱（Φ3.5 cm×18 cm）分別對熱水提取粗多糖和酶法提取粗多糖分離純化。上樣量1.6 mL（200 mg/mL），流速2.0 mL/min，每管收集10 mL，采用硫酸苯酚法檢測[8]，按峰收集各含糖組分，以截留相對分子質(zhì)量為3.5 kD的透析袋進(jìn)行透析。取袋內(nèi)透析液，旋轉(zhuǎn)濃縮，冷凍干燥即得。

1.2.4 貽貝多糖的理化性質(zhì)分析

總糖含量測定：將貽貝粗多糖配制成5 mg/mL溶液，測試前稀釋50 倍。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用改良的硫酸-苯酚法測定總糖含量。

蛋白含量測定：采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法（Bradford法）[9]測定待測樣品中蛋白質(zhì)含量。貽貝粗多糖配制成5 mg/mL的溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以牛血清白蛋白為對照品。

糖醛酸含量測定：采用硫酸咔唑法，以葡萄糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)測定糖醛酸的含量[10]，標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖醛酸溶液配制0.5 mg/mL；貽貝粗多糖配制成5 mg/mL的溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

硫酸根含量測定：采用明膠-比濁法測定各多糖的硫酸根含量[11]。取貽貝粗多糖樣品5 mg依次加入1.0 mL稀鹽酸和0.5 mL氯化鋇-明膠，以無水硫酸鉀為標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 柱前衍生高效液相色譜法測定單糖組成

分別取2 mg的RT多糖、MT多糖和MT3多糖，用三氟乙酸全水解后，取100 μL與PMP衍生后進(jìn)行高效液相色譜分析。色譜條件：色譜柱：Agilent XDB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流動相：磷酸鹽緩沖液（pH 6.7）-CH3CN（83：17，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測器：DAD（245 nm）[12]。

1.2.6 高效凝膠滲透色譜法測定相對分子質(zhì)量

取適量樣品，流動相溶解后，用0.22 μm的微孔濾膜過濾，進(jìn)樣20 μL，用HPLC分析，記錄色譜圖，將保留時間與標(biāo)準(zhǔn)曲線對照，確定樣品相對分子質(zhì)量。 色譜條件：分析柱：Shodex OH pak SB-804 HQ凝膠色譜柱（7.8 mm×300 mm）；柱溫：35 ℃；流動相：0.2 mol/L Na2SO4溶液；流速：0.5 mL/min；示差檢測器[13]。

1.2.7 紅外光譜分析

分別取干燥的不同方法提取的貽貝多糖2 mg與適量干燥KBr粉末充分研磨后壓片，使用Nicolet Nexus 6700紅外光譜儀在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)掃描[14]。

1.2.8 貽貝多糖抗氧化的測定

分別取質(zhì)量濃度0、2、4、6、8、10 mg/mL的貽貝多糖樣品，按Shimada等[15]研究抗氧化的方法，DPPH自由基的清除能力測定貽貝粗多糖。按Kimuya等[16]研究的抗脂質(zhì)過氧化能力測定貽貝粗多糖。采用Marklund等[17]研究的鄰苯三酚自氧法，超氧陰離子自由基清除能力測定貽貝粗多糖樣品。按Yuan Yanfeng等[18]研究還原力的方法，還原力測定貽貝粗多糖。

1.2.9 細(xì)胞增殖抑制率的測定

采用MTT法[19]。將MT3配制成質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/mL 5個質(zhì)量濃度組，分別測定作用24、48 h和72 h后，對前列腺癌細(xì)胞株DU-145細(xì)胞增殖的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 貽貝多糖的制備

在熱水提取的過程中，影響多糖粗品得率的因素主要有溫度、浸提時間、料液比、提取次數(shù)、乙醇醇析5 個因素，其中溫度、浸提時間、料液比對厚殼貽貝多糖得率影響較大。通過含量檢測得到其最適合提取溫度90 ℃、時間4 h、料液比1：20，提取后8 000 r/min 離心15 min，取其上清液，按Sevag法除蛋白，經(jīng)濃縮后，用3 倍體積95%乙醇醇沉過夜，收集沉淀，分別用無水乙醇和丙酮洗滌2 次。透析，冷凍干燥后即得白色粗品，RT多糖，產(chǎn)率為19.74 %。

很多動物多糖，特別是糖胺聚糖都與蛋白質(zhì)相連，首要問題是在多糖不被顯著降解的條件下去除結(jié)合的蛋白質(zhì)，提高多糖的溶解度和得率[20]。蛋白酶水解法是提取動物多糖的理想方法，使蛋白質(zhì)充分水解。在不改變糖鏈結(jié)構(gòu)的前提下先用熱水提取，依次采用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶水解。對于動物多糖的釋放十分有效。故選用熱水提取完繼續(xù)進(jìn)行酶解的兩步聯(lián)合酶解法。

波愛修所定義的永恒是同時、當(dāng)下的包羅或擁有整個的生命和時間。他批駁了有人因為聽說柏拉圖主張這個世界在時間上既沒有起點也沒有終點，就以為受造世界與其造物主同享永恒的觀點。這是對第一種永恒的否定。處在永恒之下的神意，就超越了時間，永遠(yuǎn)處在當(dāng)下的純粹之中，并且又擁有未來和過去無限范圍內(nèi)的一切。預(yù)知對于神來說，不是關(guān)于未來的知識，而是有關(guān)永在當(dāng)下的知識。

聯(lián)合酶水解工藝參數(shù)的選擇：分別對木瓜蛋白酶和胰蛋白酶水解進(jìn)行不同溫度（40、50、60、70、80 ℃）；不同時間（1、2、3、4、5 h）；不同料液比（1：10、1：20、1：30、1：40、1：50）；不同加酶量[E]/[S]（0.2%、0.5%、1%、2%、2.5%）；不同pH值（6、7、8、9、10），5 個因素的選擇。

單因素試驗結(jié)果見表1，木瓜蛋白酶水解，60 ℃為提取溫度較優(yōu)值。得到最佳溫度后，固定以上其他條件不變的情況下，依此確定最適反應(yīng)時間3 h、料液比1：20、加酶量1%、pH 7。胰蛋白酶水解方法同上，研究最適宜溫度、時間、料液比、加酶量以及pH值分別為最適溫度60 ℃、最適反應(yīng)時間3 h、最適料液比1：20、加酶量0.5%、最適pH 10。

表1 酶法提取貽貝多糖的單因素試驗結(jié)果Table1 Results of single-factor experiments on enzymatic hydrolysis of Mytilus coruscus muscle

表2 酶法提取貽貝多糖的正交試驗結(jié)果Table2 Results of orthogonal array experiments on enzymatic hydrolysis of Mytilus coruscus muscle

由表2可看出，各因素對木瓜蛋白酶提取厚殼貽貝多糖收率的影響順序為ACBD，加酶量和溫度是主要影響因素，隨著加酶量和溫度的增大，得率均上升。通過正交試驗確定的最優(yōu)水平為A3B3C3D2，即提取溫度60 ℃、pH 7、料液比1：30、加酶量1%。各因素對胰蛋白酶提取厚殼貽貝多糖收率的影響順序為CBDA，溫度和pH值是主要影響因素。通過正交試驗確定的最優(yōu)水平為A3B3C2D1，即提取溫度60 ℃、pH 10、料液比1：20、加酶量0.5%。

通過兩種方法比較，兩步聯(lián)合酶解法的效果更佳，聯(lián)合酶解方法要高于單獨采用木瓜蛋白酶或胰蛋白酶解多糖。兩種蛋白酶能有效酶解多糖結(jié)合的蛋白質(zhì)，從而將多糖釋放出來而提高多糖的得率，同時降低了多糖中蛋白質(zhì)的含量，大大的提高了多糖的純度。在正交試驗最優(yōu)條件下，即木瓜蛋白酶為提取溫度60 ℃、pH 7、料液比1：30、加酶量1%；胰蛋白酶為提取溫度60 ℃、pH 10、料液比1：20、加酶量0.5%，取貽貝粉末1 g進(jìn)行放大提取，重復(fù)3 次。結(jié)果貽貝粗多糖3 次得率分別為 24.08%、23.25%、23.78%。由此可知，聯(lián)合酶提取粗多糖的產(chǎn)率約為23.69%。

2.2 粗多糖的理化性質(zhì)分析

熱水提取和兩步聯(lián)合酶解粗多糖的總糖、蛋白、糖醛酸、硫酸根的含量測定結(jié)果如表2所示。從表2可以看出，RT粗多糖的總糖含量為72.38%，MT粗多糖的總糖含量為86.08%，相差不大。RT粗多糖的糖醛酸和蛋白含量明顯低于MT粗多糖，而硫酸根含量幾乎相同?？芍獌刹铰?lián)合酶解法能更好的除去殘留蛋白質(zhì)和各種小分子，提高多糖的得率。

表3 RT粗多糖和MT粗多糖的理化性質(zhì)測定Table3 Physiochemical of RT crude polysaccharides and MT crude polysaccharides

2.3 貽貝粗多糖的分離和純化

采用弱離子交換層析法對貽貝多糖進(jìn)行分離純化。樣品經(jīng)水洗（2 倍體積水）和0～2 mol/mL的NaCl初步線性洗脫后，依此選用純水、0.05、l mol/L的NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫。結(jié)果如圖1可知，熱水提和酶提粗多糖均得到3 種組分，分別經(jīng)透析脫鹽、冷凍干燥后得RT1、 RT2、RT3和MT1、MT2、MT3。其中RT1，RT2為白色粉末，RT3為淡黃色粉末。對于前兩種組分，不同的提取方法對其含量影響不大，但是對于l mol/L NaCl溶液洗脫組分RT3和MT3，酶提MT3組分比熱水提多糖RT3顯著提高，二者純化后得率分別為13.5% 和5.13%。由分離純化結(jié)果可知，熱水提取后酶解不僅可以提高多糖的得率和純度，還可明顯提高l mol/L NaCl溶液洗脫組分的含量。

2.4 柱前衍生HPLC法測定貽貝單糖組成

采用PMP柱前衍生HPLC法對純化后多糖組分進(jìn)行單糖組成分析，通過與10 種單糖標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖（圖2）的出峰時間相比較，確定各組分的單糖組成。

圖2 PMP標(biāo)準(zhǔn)品的柱前衍生液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of pre-column derivatives of monosaccharide standards

結(jié)合樣品中各單糖的峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線，由圖2～5可知，RT粗多糖的單糖以葡萄糖（Glc）為主，還含有少量的甘露糖（Man）、氨基葡萄糖（GlcN）、葡萄糖醛酸（GlcUA）、半乳糖（Gal）和巖藻糖（Fuc）。MT單糖組成的種類與RT多糖相同，并且同樣以Glc為主，但是Glc的含量大大降低，其他單糖組成比例明顯上升。結(jié)合分離純化的結(jié)果，可以推測RT和MT單糖組成的差異可能由組分3的含量差異造成的。所以對組分3進(jìn)行單糖組成分析表明，該組分以雜多糖為主，Man、GlcN、GlcUA、Gal和Fuc均升高，幾乎不含有葡萄糖。由此可見熱水提取后聯(lián)合酶提方法可促進(jìn)了貽貝類糖胺聚糖的釋放，提高其得率，由于類糖胺聚糖離子強度高，所以在高濃度的l mol/L NaCl溶液洗脫下來。得到各單糖的物質(zhì)的量比如表4所示。

圖3 RT多糖的柱前衍生液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of pre-column derivatives of RT

圖4 MT多糖的柱前衍生液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of pre-column derivatives of MT

圖5 MT3的柱前衍生液相色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of pre-column derivatives of MT3

表4 組分各單糖物質(zhì)的量比Table4 Monosaccharide composition of RT and MT crude polysaccharides and MT3

2.5 粗貽貝多糖分子質(zhì)量分布范圍測定

動物多糖分子質(zhì)量的測定是研究多糖性質(zhì)的一項重要的工作，多糖的性質(zhì)往往與分子質(zhì)量大小有關(guān)。采用Shodex OH pak SB-804 HQ凝膠色譜柱測定相對分子質(zhì)量。由圖6可以看出，RT多糖出現(xiàn)兩個組分，出峰的時間分別為11.241 min和16.183 min，主要以11.241 min 時峰最高。而MT多糖在11.23 min 時出峰的組分明顯減少，在16.18 min時峰明顯升高。MT3時間在15.110 min和17.053 min，主要組分大大增加，主要以第2個組分為主。由分子質(zhì)量測定結(jié)果同樣可以說明酶提可提高類聚糖胺聚糖的含量。并且可知貽貝多糖主要含有兩種組分，一種組分以高分子質(zhì) 量的葡聚糖為主，分子質(zhì)量約為669 kD，另一種以類糖胺聚糖為主，分子質(zhì)量要小得多，約為18 kD。

圖6 RT、MT和MT3的高效液相滲透色譜圖Fig.6 High performance liquid permeation chromatogram of RT, MT and MT3

2.6 紅外光譜分析結(jié)果

圖7 MT、RT和MT3的紅外光譜圖Fig.7 IR spectra of MT, RT and MT3

MT、RT、MT3的紅外光譜如圖7所示，酶法提取所得多糖紅外光譜、直接熱水提取法所得多糖紅外光譜和MT3的紅外光譜基本一致，兩種方法所得多糖應(yīng)有相似的生物活性。是典型的多糖結(jié)構(gòu)圖譜，體現(xiàn)了多糖的特征吸收。在3 403 cm-1處強吸收峰為羥基（—OH）的伸縮振動，微量水分子締合羥基；2 931 cm-1處為C—H的伸縮振動。1 647 cm-1吸收峰處為是羧基（C=O）伸縮振動，微量水分子締合羥基造成[21]。1 417、1 385 cm-1吸收峰為C—H的變角振動。1 153、1 080、1 022 cm-1處吸收峰為吡喃糖苷特征吸收峰。852 cm-1為吡喃糖環(huán)α型C—H鍵變角振動的特征峰；933 cm-1為α-D-吡喃葡萄糖的吸收峰。

2.7 厚殼貽貝多糖抗氧化活性結(jié)果

為確定不同提取方法對活性的影響，對熱水提和酶提粗多糖進(jìn)行抗氧化活性研究。在體外抗氧化評價指標(biāo)中，熱水提和酶提粗多糖均表現(xiàn)出一定的抗氧化活性，隨著多糖質(zhì)量濃度的升高，抗氧化活性也隨著增強，抗氧化能力與多糖質(zhì)量濃度呈現(xiàn)正相關(guān)（圖8）。總體來說，酶提多糖的抗氧化活性均要優(yōu)于熱水提多糖。

在多糖質(zhì)量濃度為10 mg/mL時，DPPH自由基的清除率分別為MT多糖為84.18%，RT多糖為80.01%。MT多糖和 RT多糖對DPPH自由基清除的半最大效應(yīng)濃度（concentration for 50% of maximal effect，EC50）分別為 3.75 mg/mL和4.97 mg/mL 。兩者清除超氧陰離子自由基效果相當(dāng)，MT多糖對超氧陰離子自由基的清除效果稍微好些，二者對超氧陰離子自由基清除的EC50分別為5.01 mg/mL和6.48 mg/mL 。

在抗脂質(zhì)過氧化的指標(biāo)中，MT多糖抗脂質(zhì)過氧化的活性比RT多糖要強。在10 mg/mL時，二者對脂質(zhì)過氧化物的清除率分別為 82.33% 和76.01%。MT多糖和RT多糖對脂質(zhì)過氧化物清除的 EC50分別為2.41 mg/mL和3.46 mg/mL。

在多糖還原力測定中，與VC對比，雖然還原力呈增強趨勢，但活性低很多。總體說MT多糖比RT多糖的還原力要高一些。

圖8 熱水提和酶提粗多糖的抗氧化活性研究Fig.8 Antioxidant activity of RT and MT

體外抗氧化實驗表明，提取方法對多糖的生物活性也會產(chǎn)生影響，熱水提取后酶提的抗氧化活性要優(yōu)于熱水提多糖。而酶提粗多糖中類糖胺聚糖含量高，推測貽貝多糖中類糖胺聚糖表現(xiàn)出更優(yōu)良的抗氧化活性[22]。由于純化多糖含量有限，未對類糖胺聚糖進(jìn)行單獨的抗氧化實驗，其體內(nèi)外抗氧化活性將繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)的研究。

2.8 抗腫瘤活性貽貝粗多糖的初步測定

圖9 不同酶解粗多糖對DU-145細(xì)胞的增值抑制率Fig.9 Inhibitory activity of MT1, 2 and 3 against DU-145 cells

和抗氧化活性一樣，對不同提取方法得到的多糖進(jìn)行體外抗腫瘤活性研究。MT、RT在質(zhì)量濃度為20 mg/mL，作用48 h后，對DU-145細(xì)胞增值抑制率分別為78.50%和59.80%。由于MT的抗腫瘤活性最強，為追蹤并確定其抗腫瘤成分，故對MT經(jīng)過離子交換柱分離得到的3 個組分，即MT1、MT2、MT3進(jìn)行抗腫瘤活性研究，結(jié)果見圖9。各組分在質(zhì)量濃度為5 mg/mL，對DU-145細(xì)胞作用48 h后，增值抑制率分別26.38%、25.11%和86.43%，其中MT3抗腫瘤活性最強，要遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于其他兩個組分，說明類糖胺聚糖為貽貝多糖中主要的抗腫瘤成分[23]。

為測定MT3對DU-145細(xì)胞的增值抑制作用，將MT3配制成5 個不同質(zhì)量濃度組，分別測定作用 24、48h 和72 h后，對前列腺癌細(xì)胞株DU-145增殖的影響。如表5所示，當(dāng)質(zhì)量濃度為8 mg/mL ，作用72 h后，MT3對DU-145細(xì)胞增值抑制率為86.25%。DU-145細(xì)胞的IC50，24 h為2.96 mg/mL；48 h為2.71 mg/mL；7 h為2.75 mg/mL。實驗表明，MT3對細(xì)胞的增值抑制作用隨質(zhì)量濃度增大而增強，呈現(xiàn)時效和量效關(guān)系。

表5 MT3 對 DU-145 細(xì)胞的增值抑制率（±s，n=3）Table5 Inhibitory effect of MT3 on proliferation of DU-145 cellsx =3)

表5 MT3 對 DU-145 細(xì)胞的增值抑制率（±s，n=3）Table5 Inhibitory effect of MT3 on proliferation of DU-145 cellsx =3)

注：*.與同種細(xì)胞最小抑制率比較，差異顯著（P＜0.05）；**.與同種細(xì)胞最小抑制率比較，差異極顯著（P＜0.01）。

組別抑制率/% 24 h48 h72 h對照組 ——0.5 mg/mL 30.38±2.036.33±2.429.20±1.5* 1.0 mg/mL34.78±1.940.87±2.3**43.25±2.0 2.0 mg/mL45.13±2.0*49.87±1.8* 48.75±1.8 4.0 mg/mL64.25±2.867.18±1.968.44±1.6** 8.0 mg/mL83.75±1.2*86.15±2.7** 86.25±1.7*

3 討 論

經(jīng)過熱水提取和熱水提取后兩步酶解法比較后，采用兩步聯(lián)合酶解法提取厚殼貽貝多糖，研究了酶法的提取時間、液料比、pH值、溫度對貽貝多糖得率的影響規(guī)律。厚殼貽貝多糖的得率得以提高主要是聯(lián)合酶將貽貝中的多糖物質(zhì)充分溶解釋放出來，在提高貽貝多糖的得率的同時降低了蛋白質(zhì)的含量，同時增大了多糖的純度，簡化了多糖的純化工作，保持了多糖物質(zhì)的生物活性。因此兩步聯(lián)合酶解法具有能力強且操作簡單、耗時短及蛋白水解效率高的優(yōu)點，并且可以在食品生產(chǎn)過程中與酶解多肽產(chǎn)品聯(lián)合生產(chǎn)，簡化生產(chǎn)工藝，促進(jìn)貽貝產(chǎn)品的開發(fā)。與趙巧靈等[24]研究貽貝多糖提取分離結(jié)果比較，其貽貝貝肉經(jīng)熱水提取后粗多糖得率為19.03%。說明經(jīng)過熱水提取后兩步酶解法得到的貽貝粗多糖（得率 23.69%）大大的提高其產(chǎn)率和產(chǎn)量。

通過DEAE-Cellulose 52離子交換柱層析進(jìn)行初步分離純化、單糖組成分析和分子質(zhì)量的測定樣品結(jié)果表明，不同的提取方法對多糖的成分產(chǎn)生影響。兩步聯(lián)合酶解法得到的粗多糖類糖胺聚糖的含量要明顯高于熱水提組分，單糖組成以Man、GlcN、GlcUA、Gal和Fuc為主，分子質(zhì)量約18 kD。

通過體外抗氧化活性實驗可知兩種提取方法獲得的多糖對羥基自由基、超氧陰離子自由基有一定的清除能力，并且有一定的總體還原能力和抗脂質(zhì)過氧化能力。兩步聯(lián)合酶提獲得的貽貝多糖的體外抗氧化能力優(yōu)于熱水提多糖，推測可能類糖胺聚糖是貽貝多糖抗氧化的主要成分。通過與殷秀紅[25]等研究貽貝多糖體外抗氧化活性研究比較，發(fā)現(xiàn)經(jīng)水提和酶提的貽貝多糖在相同質(zhì)量濃度（10 mg/mL）對DPPH自由基清除率分別為11.73%和39.14%均低于兩步聯(lián)合酶提獲得的貽貝多糖。

在抗腫瘤活性研究中，選擇經(jīng)典的MTT法實驗也確定類糖胺聚糖是貽貝多糖抗腫瘤的主要成分。酶解的MT3組分的體外抗腫瘤活性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于水洗的組分。結(jié)果表明貽貝多糖能直接抑制腫瘤細(xì)胞活性，其抗腫瘤機(jī)制及是否可以通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)而達(dá)到抗腫瘤作用尚需要進(jìn)一步研究。在貽貝多糖的抗腫瘤活性研究中首次研究對前列腺癌細(xì)胞DU-145的抑制活性，比較發(fā)現(xiàn)其在相同濃度下對前列腺癌細(xì)胞抑制活性明顯優(yōu)于人卵巢癌細(xì)胞HO-8910（抑制率30.55%）、人紅白血病細(xì)胞K562（抑制率15.62%）、人肝癌細(xì)胞SMMC-7721（抑制率8.42%）。說明貽貝多糖對前列腺癌細(xì)胞的抑制效果更好，提示可對貽貝多糖進(jìn)行深入的體內(nèi)抗前列腺癌研究，以期用于前列腺癌的輔助治療。

厚殼貽貝來源豐富，但還未被充分開發(fā)利用，具有廣闊的開發(fā)前景。通過系統(tǒng)的提取工藝優(yōu)化和以抗氧化和抗腫瘤為主的活性追蹤確定類糖胺聚糖是厚殼貽貝主要的活性多糖成分，確定了類糖胺聚糖的優(yōu)化提取方法和工藝，為開發(fā)利用貽貝資源，深入研究海洋動物多糖的藥用價值奠定基礎(chǔ)。

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Optimized Extraction and Bioactivity in vitro of Polysaccharides from Mytilus coruscus

ZHONG Cheng-cheng1, QU You-le2,*, CHEN Yin2
(1. College of Food and Pharmacy, Jiamusi University, Jiamusi 154007, China; 2. College of Food and Pharmacy, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316000, China)

Antioxidant, antitumor polysaccharides were prepared from Mytilus coruscus muscle by hot water extraction alone or followed by sequential hydrolysis with papain and trypsin, and analyzed for physiochemical properties. After chromatographic purification on a DEAE-Cellulose 52 column, the antioxidant and antitumor activities in vitro were investigated. Combined enzymatic hydrolysis, giving rise to a yield of crude polysaccharides of 23.69%, was advantageous over single enzymatic hydrolysis and hot water extraction as far as the yield, purity and bioactivity of crude polysaccharides were concerned. The in vitro antioxidant activity of crude polysaccharides obtained from combined enzymatic hydrolysis showed a concentration for 50% of maximal effect (EC50) of 3.75, 5.01 and 2.41 mg/mL in scavenging DPPH, superoxide anion and lipid peroxide radicals, respectively, and an IC50of 2.93 mg/mL against the growth of prostate cancer cells DU-145 cultured for 48 h. Analysis of the yield and chemical composition of purifi ed polysaccharide fractions indicated that higher contents of glycosaminoglycan-like polysaccharide (MT3) with a molecular weight of roughly 18 kD in crude polysaccharides were obtained by combined enzymatic hydrolysis and the monosaccharide composition consisted of Man, GlcN, GlcUA, Gal and Fuc. Meanwhile, MT3 was more effective against tumor cells DU-145 in vitro with an IC50of 2.71 mg/mL after 48 h of culture in its presence. The results of activity-guided separation demonstrated that combined enzymatic hydrolysis after hot water extraction could not only increase the purity of polysaccharides through protein degradation, but could signifi cantly enhance the content of glycosaminoglycans as well, and glycosaminoglycans were the main active polysaccharides in Mytilus coruscus muscle that possessed good antitumor activity.

Mytilus coruscus; polysaccharide; extraction process; antioxidant; antitumor

R961

A

1002-6630（2014）10-0107-08

10.7506/spkx1002-6630-201410020

2013-09-12

浙江海洋學(xué)院校級專項科研項目（X122X01）

鐘城城（1985—），女，碩士研究生，研究方向為藥物化學(xué)。E-mail：zhong102456@sina.com

*通信作者：曲有樂（1960—），男，教授，學(xué)士，研究方向為天然產(chǎn)物活性研究、結(jié)構(gòu)改造與設(shè)計。E-mail：youle1960@163.com