趙曉燕，陳 軍，王憲昌，陳相艷，鄧 鵬，林 洋

（山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所，山東 濟(jì)南 250 100）

微波法輔助反膠束技術(shù)前萃取大豆蛋白工藝

趙曉燕，陳 軍，王憲昌，陳相艷*，鄧 鵬，林 洋

（山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所，山東 濟(jì)南 250 100）

以全脂大豆為研究對象，為提高反膠束前萃取大豆蛋白的效率，利用變頻微波萃取儀，輔助反膠束技術(shù)前萃取大豆蛋白。研究單因素即提取溫度、pH值、液料比與時(shí)間對大豆蛋白提取率的影響，通過主要因素的響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化提取參數(shù)，且檢測了參數(shù)之間相互作用關(guān)系。利用統(tǒng)計(jì)分析和優(yōu)化，結(jié)果顯示，微波對前萃取大豆蛋白影響的相對大小依次為提取時(shí)間＞溫度＞pH值。結(jié)果表明：在提取溫度43.3 ℃、pH 8、萃取時(shí)間23 min時(shí)，蛋白質(zhì)前萃率達(dá)到最高水平，提取率80.61%。

大豆蛋白；反膠束；微波；前萃；響應(yīng)面法

大豆是一種古老的食品，大豆蛋白屬于植物性蛋白含有8種人體必需氨基酸，且比例較合理、含量較高，品質(zhì)優(yōu)于糧食蛋白質(zhì)，與肉類的蛋白質(zhì)接近，為植物性的完全蛋白質(zhì)，且在眾多的植物性蛋白質(zhì)中營養(yǎng)價(jià)值最高，在日常生活中被人們廣泛利用。另外大豆蛋白不僅具有營養(yǎng)價(jià)值還具有保健作用，能降低膽固醇水平而維護(hù)心血管健康等[1]。

大豆蛋白的提取方法有堿提酸沉法、膜分離方法與雙水相萃取技術(shù)等[2-4]。目前工業(yè)化生產(chǎn)的基本方法為堿提酸沉法，但該方法耗酸、耗堿量大，造成環(huán)境的污染與蛋白的變性；而其他方法的研究仍處于實(shí)驗(yàn)室階段，沒有工業(yè)化應(yīng)用。反膠束技術(shù)作為一種新的分離技術(shù)，由表面活性劑的極性頭（親水基）朝內(nèi)，非極性尾（疏水基）朝外排列組成，形成一個(gè)球狀的極性核，核內(nèi)是一定數(shù)量的水，稱為微水池或者微水相，該水池可以增溶蛋白質(zhì)、酶等可溶性極性物質(zhì)[5-8]。

近年來反膠束溶液作為新的溶劑系統(tǒng)萃取生物分離技術(shù)已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的溶液萃取中，該方法成本低，溶劑可回收利用，萃取效率高，選擇性高，使用范圍廣，操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，為蛋白質(zhì)和油脂的提取分離提取開辟了一條具有工業(yè)發(fā)展的途徑[9-10]。因此，反膠束技術(shù)制備蛋白質(zhì)是前景看好的生產(chǎn)工藝路線，已成為近年來國際上蛋白生產(chǎn)的研究熱點(diǎn)。

當(dāng)反膠束溶液與蛋白質(zhì)水溶液或含蛋白質(zhì)的固相接觸后，蛋白質(zhì)可加溶于反膠束溶液的過程，稱為前萃；將含有蛋白質(zhì)的反膠束溶液轉(zhuǎn)移至第2水相的過程，通過調(diào)節(jié)pH值與離子強(qiáng)度等，使蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)入水相、離心分離，從而分離出蛋白質(zhì)，稱為后萃[9-11]。國內(nèi)20世紀(jì)80年代引進(jìn)了反膠束的概念，開始了對反膠束的研究，之后國內(nèi)陸續(xù)有反膠束萃取氨基酸、蛋白質(zhì)、酶的報(bào)道[12-13]，隨后開展了反膠束技術(shù)同時(shí)分離蛋白與油脂的研究，并取得了較好的效果[14-15]。在反膠束前萃取植物蛋白時(shí)，與其他技術(shù)相結(jié)合的研究也相繼出現(xiàn)，如與超聲波技術(shù)相結(jié)合前萃取植物蛋白[16]。但是，微波輔助反膠束技術(shù)前萃植物蛋白研究還鮮有報(bào)道。反膠束體系核內(nèi)是一定數(shù)量的水，而水是吸收微波的最好介質(zhì)。因此，反膠束與微波技術(shù)相結(jié)合萃取蛋白，在蛋白制備工業(yè)化應(yīng)用中是非常有意義的集成技術(shù)。

變頻微波萃取儀利用非接觸紅外測溫，通過微波功率自動(dòng)變化，來保持溫度的恒定，而普通的微波儀隨著時(shí)間的延長，溫度快速上升。本實(shí)驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，采用該設(shè)備，輔助二（2-乙基已基）丁二酸酯磺酸鈉（bis(2-ethylhexyl)sodium sulfosuccinate，AOT）正己烷反膠束體系前萃取大豆蛋白，改進(jìn)工藝條件，研究了微波溫度、緩沖溶液pH值、液料比與時(shí)間影響大豆蛋白的提取率，采用響應(yīng)面試驗(yàn)，建立萃取數(shù)學(xué)模型，進(jìn)行條件優(yōu)化，得出大豆蛋白提取率較高的較優(yōu)提取條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆來自山東濟(jì)南（中豆25號），將大豆晾干，磨成豆粉，過100目篩，封口備用；AOT 上海聯(lián)民化工廠；正己烷、卡爾費(fèi)休試劑與氯化鉀等化學(xué)試劑為分析純 上海國藥集團(tuán)。

1.2 儀器與設(shè)備

MAS-??型常壓微波萃取反應(yīng)儀 上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；AFK-1B水分自動(dòng)測定儀 上海禾工科學(xué)儀器有限公司；K9860凱式定氮儀、SH220消化爐美國海能公司；SH-3磁力攪拌器 北京金紫光科技發(fā)展有限公司；移液槍 Eppendorf公司；CR22DⅢ高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 AOT反膠束溶液的配制

分別稱取一定量的AOT表面活性劑置于錐形瓶中，加入一定體積的有機(jī)溶劑正己烷（反膠束相的質(zhì)量濃度為0.08 g/mL，即1 mL正己烷中加入0.08 g的AOT），超聲使表面活性劑完全溶解。加入0.05 mol/L的電解質(zhì)的緩沖溶液（濃度為0.07 mol/L KH2PO4＋Na2HPO4緩沖液），振蕩后靜置，溶液透明則為反膠束體系，反之則不是。

1.3.2 大豆蛋白前萃率的計(jì)算

分別取30 mL配制好的反膠束溶液，根據(jù)1.3.1節(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別加入0.05 mol/L的電解質(zhì)的緩沖溶液，使各種反膠束溶液含水量值達(dá)到最大。然后加入一定量的全脂大豆粉（精確到0.000 1 g），在一定溫度的微波萃取儀中提取一段時(shí)間，然后進(jìn)行離心分離去除殘?jiān)?。?shí)現(xiàn)上清液中蛋白和油脂的同時(shí)分離，再用另一1 mol/L鹽溶液水相后萃，蛋白被后萃出來，經(jīng)精制、冷凍干燥得到大豆蛋白。由于表面活性劑遇冷即沉淀，油-異辛烷可先冷卻到0～4 ℃，分離出表面活性劑，然后將油-有機(jī)溶劑相減壓蒸餾，實(shí)現(xiàn)油脂和異辛烷兩相分離（后萃數(shù)據(jù)未展示）。利用凱氏定氮法測定前萃液中的蛋白質(zhì)含量，計(jì)算蛋白前萃率。

1.3.3 微波輔助反膠束前萃取大豆蛋白的單因素試驗(yàn)

取20 mL 0.08 g/mL AOT的反膠束溶液，加入1.8 mL含0.05 mol/L KCl緩沖液（pH 7.0），全脂大豆粉加入量為0.02 g/mL，在不同溫度（30、35、40、45、50、55 ℃）與pH值（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0）條件下，分別將0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 g的豆粉與反膠束溶液混合，在200 r/min下振蕩5、10、15、20、30、40、50 min，然后在4 000 r/min的條件下離心10 min，離心分離得上清液，每個(gè)樣重復(fù)測定3次，采用凱氏定氮法計(jì)算蛋白含量。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

通過以上各因素試驗(yàn)，分別將微波提取溫度、液料比與時(shí)間對萃取大豆蛋白的綜合影響，采用DPS13.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)設(shè)計(jì)三因素三水平Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)，如表1所示，試驗(yàn)結(jié)果分析均在DPS數(shù)據(jù)處理軟件下運(yùn)行。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)因子水平及編碼Table1 Variables and coded levels for Box-Behnken Design

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

微波溫度是影響反膠束萃取的一個(gè)重要因素，其關(guān)系如圖1A所示。溫度低于45 ℃之前，隨著溫度的升高，蛋白萃取率呈現(xiàn)上升趨勢；溫度超過45 ℃以后，隨著溫度的升高，蛋白萃取率呈現(xiàn)下降趨勢。提取溫度在45 ℃左右時(shí)為最適，說明優(yōu)化實(shí)驗(yàn)溫度條件應(yīng)在45 ℃附近尋找。

微波萃取時(shí)，溶液的pH值對微波的萃取效率產(chǎn)生一定影響，針對不同的萃取樣品，溶液有一個(gè)最佳的用于萃取的酸堿度。在圖1B中，pH值達(dá)到7時(shí)，蛋白前萃率達(dá)到最大值，隨著pH值的增大而減小，這與G?klen等[17]的研究結(jié)果是一致的。

圖1 溫度（A）、pH值（B）、樣品加入量（C）和時(shí)間（D）對蛋白質(zhì)前萃率的影響Fig.1 Effect of extraction time, pH, sample loading amount and extraction time on the forward extraction efficiency of soybean protein

樣品加入量對蛋白前萃率的影響如圖1C所示。在豆粉加入量小于0.6 g時(shí)，蛋白質(zhì)前萃率隨豆粉加入量增加而升高，在加入量為0.6 g左右時(shí)達(dá)到最大值，此后雖然豆粉加入量增加而前萃率卻逐漸降低。綜合考慮蛋白萃取率及生產(chǎn)成本的情況，為了在保證前萃率較高的前提下，又有較大的產(chǎn)量，樣品添加量可選取在0.6 g左右。

微波萃取時(shí)間對蛋白萃取率的影響如圖1D所示。蛋白質(zhì)前萃率隨提取時(shí)間的走勢，呈先升高后降低的趨勢，在提取時(shí)間少于20 min時(shí)前萃率隨提取時(shí)間的延長而升高，在20 min左右時(shí)達(dá)到最大值，本實(shí)驗(yàn)選取20 min左右為提取最適時(shí)間。

2.2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.1 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇微波溫度、時(shí)間與pH值3個(gè)因素，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果見表2。

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析由表3可知，擬合的二次多元方程的F值為46.473 3，說明用上述回歸方程描述的因變量與全自變量之間的回歸效果顯著。從回歸方程各項(xiàng)方差的進(jìn)一步檢驗(yàn)可以看出，失擬檢驗(yàn)不顯著F1=0.856 2＜F0.05（17,7）=3.49，試驗(yàn)誤差小。此外，決定系數(shù)R2用來檢查模型是否合適，其值為0.986 7，對大豆蛋白提取率來說，意味著98.67%樣品變化歸因于單變量，總變量中僅有1.33%不能通過模型來說明。數(shù)據(jù)證明該模型擬合程度良好，實(shí)驗(yàn)誤差小，顯著水平P＜0.05則可認(rèn)為所選用的二次回歸模型是恰當(dāng)?shù)摹?/p>

表3 響應(yīng)面模型的方差分析Table3 Analysis of variance for the developed regression model

通過多項(xiàng)式回歸分析，各變量的回歸系數(shù)、t值和P值如表4所示。由表4可知，溫度（X1）對蛋白前率（Y）影響最顯著，對蛋白前萃率影響強(qiáng)弱分別為溫度＞時(shí)間＞pH值；且溫度（X1）與pH值（X3）交互作用顯著，溫度（X1）與pH值（X3）的平方對蛋白前萃率（Y）影響顯著。剔除不顯著項(xiàng)后，得方程：Y=73.073 333-7.5675X1＋5.581 25X2＋8.583 75X3-27.556 666 67X12-21.244 166 67X32-5.392 5X1X3。

表4 回歸系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)Table4 Regression coefficients and statistical significance in the developed regression model

2.2.2 響應(yīng)面圖分析

從圖2可以直觀的分析兩因子間的互作效應(yīng)。當(dāng)液料比與pH值一定時(shí)，蛋白前萃率隨著萃取時(shí)間的延長和萃取溫度的增加都是先增加后減小；圖2的響應(yīng)面圖呈鐘罩型，說明萃取溫度和萃取時(shí)間的交互作用比較顯著，這和表4的結(jié)果一致（交互項(xiàng)中X1X3的P值最?。?/p>

圖2 萃取溫度（X1）與萃取時(shí)間（X3）互作效應(yīng)圖對蛋白前萃率的影響Fig.2 Response surface and contour plots for the effects of temperatures (X1) and times (X3) on protein forward extraction efficiency

2.2.3 因素水平優(yōu)化組合及驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)以上的優(yōu)化試驗(yàn)，對回歸方解求解，得到最佳優(yōu)化條件組合為溫度43.3 ℃、pH 8、提取時(shí)間23 min，在這些條件下，蛋白質(zhì)的前萃率為80.61%，與理論值預(yù)測值81.01%的相對誤差很小，而在無微波條件下，反膠束萃取大豆蛋白的前萃率約在65%左右，說明應(yīng)用微波輔助反膠束技術(shù)提取大豆蛋白能有效的縮短提取時(shí)間、提高提取率。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用變頻微波輔助AOT-正己烷反膠束體系萃取全脂大豆粉中的大豆蛋白，在單因素試驗(yàn)中，溫度過高會(huì)影響反膠束體系的穩(wěn)定性，不利于蛋白質(zhì)增溶。溫度對蛋白質(zhì)萃取影響主要在于3 個(gè)方面：一是溫度升高可能導(dǎo)致滲透現(xiàn)象發(fā)生使反膠束結(jié)構(gòu)破壞，造成蛋白質(zhì)在水油兩相中分配系數(shù)下降；二是溫度升高時(shí)分子熱運(yùn)動(dòng)加快使傳質(zhì)過程速率加快，進(jìn)而萃取速率加快；三是溫度對于蛋白質(zhì)活性的影響，一般說來較低溫度下有利于生物保持其活性溫度過高會(huì)使其活性破壞[18]。萃取的最適溫度由這3 個(gè)方面相互制約決定。值得注意一點(diǎn)是AOT為陰離子型表面活性劑，大豆蛋白的等電點(diǎn)大約為4.5，當(dāng)緩沖液pH 7時(shí)，蛋白大量進(jìn)入極性核內(nèi)，蛋白前萃率較高，這說明大豆蛋白與陰離子型表面活性劑AOT分子之間的靜電吸引力并不是影響反膠束萃取蛋白質(zhì)的主要推動(dòng)力[19]。當(dāng)緩沖液pH 7時(shí)，大豆蛋白分子帶負(fù)電，AOT陰離子表面活性劑反膠束體系的核內(nèi)壁也是帶負(fù)電，此時(shí)大豆蛋白分子卻大量進(jìn)入了極性核內(nèi)，那么此種過程中蛋白進(jìn)入反膠團(tuán)內(nèi)部的主要驅(qū)動(dòng)力可能是離子交換機(jī)理，具體原理有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。此外，樣品的加入量過多，反而會(huì)影響前萃率，原因是反膠束溶液的聚集數(shù)增溶蛋白質(zhì)的能力是有限的，導(dǎo)致樣品量加入過多時(shí)，反膠束溶液增溶蛋白質(zhì)的能力反而降低，蛋白質(zhì)進(jìn)入反膠束內(nèi)核水池產(chǎn)生了競爭機(jī)制導(dǎo)致蛋白質(zhì)含量會(huì)減少，當(dāng)然也不排除會(huì)有別的原因[20]。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，建立影響影響蛋白質(zhì)前萃率的溫度（X1）、pH值（X2）、提取時(shí)間（X3）的條件優(yōu)化模型：

Y=73.073 333-7.567 5X1＋5.581 25X2＋8.583 75X3-27.556 666 67-0.809 166 667-21.244 166 67-5.392 5X1X3＋3.375X2X3

因素對蛋白質(zhì)前萃作用的大小順序依次為：提取時(shí)間＞溫度＞pH值，得出較優(yōu)前萃條件為提取時(shí)間23 min、溫度43.3 ℃、pH 8，在此條件下蛋白質(zhì)前萃率最高優(yōu)化指標(biāo)為80.61%，與優(yōu)化方案的理論值81.01%比較接近，證明優(yōu)化后的條件是可靠的。與無微波的反膠束萃取的大豆蛋白相比，微波輔助萃取，時(shí)間縮短了約7 min，提取率了提高了約15%，暗示著微波輔助反膠束體系更有利于大豆蛋白前萃。因此，本研究可為大豆蛋白的研究開發(fā)及工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。與相關(guān)的研究相比，研究雖然提高了前萃取率，但也存在一些不足之處，如表面活性劑與油相的分離等，本研究將進(jìn)一步研究反膠束溶液對蛋白質(zhì)的萃取，以提高大豆蛋白質(zhì)前萃與后萃率，以提高蛋白得率，以及對蛋白液和油脂中表面活性劑的去除進(jìn)行研究，并利用這一技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)大應(yīng)用實(shí)驗(yàn)。

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Microwave-Assisted Forward Extraction of Soy Protein in AOT/Hexane Reverse Micelles

ZHAO Xiao-yan, CHEN Jun, WANG Xian-chang, CHEN Xiang-yan*, DENG Peng, LIN Yang
(Institute Agro-Food Science and Technology, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, China)

A variable-frequency microwave-assisted method was applied in order to improve the forward extraction efficiency of soy protein in sodiumbis (2-ethylhexyl) sulfosuccinate (AOT) reverse micelles. The effects of experimental conditions such as temperature, pH value, the ratio of solution to material and extraction time on the extraction efficiency were examined. Response surface methodology (RSM) was used for modeling and optimizing the process to gain a better understanding of the process performance. By using RSM, the effects of temperature, pH value and extraction time on the extraction efficiency were calculated and their interactions were determined. After statistical analysis, the results showed that the effect of the extraction conditions followed the decreasing order: time ＞ temperature ＞ pH, and the optimum conditions were determined as follows: temperature 43.3 ℃, pH 8.0 and time 23 min, resulting in a yield of soy protein of 80.61%. This study showed that the variable-frequency microwave-assisted extraction can quickly enhance the extraction efficiency of soy protein in AOT reverse micelles.

soy protein; reverse micelles; microwave; forward extraction; response surface methodology

TS201.4

A

1002-6630（2014）10-0088-05

10.7506/spkx1002-6630-201410016

2013-09-17

山東省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2011GGC02044）；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31101389）

趙曉燕（1975—），女，副研究員，博士，研究方向?yàn)槭称防碚撆c加工應(yīng)用及生物粉體技術(shù)。

E-mail：zhaoxy_2201@163.com

*通信作者：陳相艷（1973—），女，研究員，碩士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品精深加工。E-mail：chenxy@saas.ac.cn