史 娜，侯彩云*，路 勇，姜 杰，張學(xué)亮

QuEChERS-高效液相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)食品中14 種真菌毒素

史 娜1,2，侯彩云1,*，路 勇2，姜 杰2，張學(xué)亮3

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.北京市食品安全監(jiān)控中心，北京 100041；3.北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 100124）

建立QuEChERS-高效液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)食品中14 種真菌毒素的方法。均質(zhì)樣品用1%乙酸-乙腈提取，經(jīng)分散固相萃取凈化后，采用ACQUITU UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）分離。采用電噴霧電離、多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式，可同時(shí)對(duì)食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、青霉酸、黃曲霉毒素M1、黃曲霉毒素G2、桔青霉毒素、黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、雜色曲霉毒素、HT-2毒素、T-2毒素、鬼臼毒素14 種真菌毒素進(jìn)行定性和定量分析。最低檢出限為0.5～1 μg/kg。該方法簡(jiǎn)便快速、選擇性佳、靈敏度高，適用于食品安全事件分析中真菌毒素的分析。

真菌毒素；QuEChERS；高效液相色譜-質(zhì)譜；篩選；食品

真菌毒素是真菌在食品或飼料里生長(zhǎng)所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，是有毒的二級(jí)代謝產(chǎn)物，目前已知的真菌毒素有200多種，按其主要產(chǎn)毒菌種可分為曲霉菌毒素（如黃曲霉毒素、棕曲霉毒素等）、青霉菌毒素和鐮刀菌毒素（如T-2毒素、HT-2毒素、二乙酰藨鐮刀菌烯醇、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮等）等幾大類。人或動(dòng)物攝入被真菌毒素污染的食物可引發(fā)多種中毒癥狀，嚴(yán)重危害人類的身體健康。據(jù)調(diào)查，除飼料和糧食外，在花生、烘焙食品、水果和果汁、蔬菜等人們常食用的食物中都發(fā)現(xiàn)了有真菌污染的現(xiàn)象。因此，控制真菌毒素對(duì)于生產(chǎn)效益、動(dòng)物福利、產(chǎn)品質(zhì)量和食品安全都是至關(guān)重要的[1-4]。

對(duì)于食品中真菌毒素的檢測(cè)方法很多[1,5]，薄層層析法雖然簡(jiǎn)便，但精確度低、操作過(guò)程復(fù)雜、分析結(jié)果的可重復(fù)性和再現(xiàn)性差；免疫化學(xué)檢測(cè)法通常具有高的選擇性和很低的檢出限，廣泛用于各種抗原、半抗或抗體的測(cè)定，一般可分為熒光免疫法、發(fā)光免疫法、免疫法及電化學(xué)免疫法等非放射免疫法和放射免疫法[6-10]；色譜法主要包括薄層色譜、氣相色譜、液相色譜、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等。真菌毒素大部分是熱不穩(wěn)定的，因此氣相色譜法只應(yīng)用于個(gè)別真菌毒素的檢測(cè)[11-13]；高效液相色譜法靈敏度高、穩(wěn)定性好，但是對(duì)于同分異構(gòu)體和同系物就無(wú)法進(jìn)行多組分析；液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS-MS）法[14]的優(yōu)點(diǎn)非常顯著，LC與高選擇性、高靈敏度的MS-MS結(jié)合，可對(duì)復(fù)雜樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)分析，即使在LC難分離的情況下，只要通過(guò)MS1及MS2對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行中性碎片掃描，則可發(fā)現(xiàn)并突出混和物中的目標(biāo)化合物，顯著提高信噪比，LC-MS-MS技術(shù)在食品中毒物分析中顯示出越來(lái)越廣闊的應(yīng)用前景。目前國(guó)內(nèi)對(duì)多種真菌毒素同時(shí)檢測(cè)多采用免疫親和柱、凝膠色譜等進(jìn)行凈化處理[15-17]，對(duì)于采用QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged，safe）進(jìn)行凈化處理的文獻(xiàn)鮮有發(fā)表。

QuEChERS是由美國(guó)化學(xué)家Lehotay和德國(guó)的Anastassiadas于2003年提出的一種快速、簡(jiǎn)便、便宜、有效、可靠及安全的樣品處理技術(shù)[18]，最早在農(nóng)藥多殘留中使用[19-20]。本實(shí)驗(yàn)采用先進(jìn)的QuEChERS技術(shù)進(jìn)行樣品處理，通過(guò)優(yōu)化樣品前處理?xiàng)l件及色譜-質(zhì)譜條件，建立了多反應(yīng)離子模式分別測(cè)定14 種真菌毒素的新方法。本方法可為處理食品安全事件中真菌毒素的篩選提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫氧雪腐鐮刀烯醇、黃曲霉毒素M1、黃曲霉毒素G2、桔青霉毒素、黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、鬼臼毒素（均為規(guī)格1 mg、純度98%） 美國(guó)TRC公司；雜色曲霉毒素、HT-2毒素、T-2毒素、青霉酸（均為規(guī)格1 mg、純度99%） 美國(guó)Sigma公司，用甲醇溶液將標(biāo)準(zhǔn)樣品配制成100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。甲醇、乙酸銨、甲酸 United States Dikma Dikmapure公司；實(shí)驗(yàn)室用水符合GB/T 6682—2008《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》中二級(jí)水的規(guī)定。

1.2 儀器與設(shè)備

TQ-S超高效液相色譜-四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀、DisQuE基質(zhì)固相分散樣品制備試劑盒、DisQuE提取管（1 支50 mL體積的離心管，內(nèi)裝4 g硫酸鎂、1 g氯化鈉、1 g檸檬酸三鈉和二水結(jié)晶鹽以及0.5 g的檸檬酸氫二鈉合一個(gè)半水結(jié)晶鹽）、高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Waters公司；Milli-Q純水儀 美國(guó)Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

Waters ACQUITy UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：0.1%甲酸（B）和乙腈（A），洗脫條件見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫條件Table 1 HPLC Gradient elution conditions

1.3.2 質(zhì)譜條件

表2 MRM所用的母/子離子Table 2 Precursor/daughter ions used in multiple-reaction monitoring (MRM) mode

電噴霧離子（electrospray ionization，ESI）源，正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multi-reaction monitoring，MRM）；毛細(xì)管電壓2.5 kV；離子源溫度900 ℃；脫溶劑氣溫度600 ℃；錐孔氣流速150 L/h；脫溶劑氣流速1 000 L/h，14 種化合物的質(zhì)譜分析參數(shù)見表2，總離子流圖見圖1，MRM色譜圖見圖2。

圖1 14 種藥物的TIC色譜圖Fig.1 TIC chromatograms of 14 mycotoxins

圖2 14 種藥物的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of 14 mycotoxins

1.3.3 樣品前處理方法

粉碎樣品后精密稱取4.000 g于50 mL DisQuE提取管中，加入16 mL 1%的乙酸-乙腈。渦旋振蕩5 min至充分混勻，超聲5 min，10 000 r/min離心10 min。吸取8.0 mL上述乙腈提取液至15 mL DisQuE清除管中，渦旋振蕩30 s，10 000 r/min離心5 min。吸取4.0 mL上述提取液至旋蒸瓶中，旋蒸至近干，用乙腈-0.1%甲酸溶液（5∶95）定容至1 mL，渦旋使其充分溶解，過(guò)有機(jī)膜后待進(jìn)樣分析。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制備

將14 種標(biāo)準(zhǔn)樣品分別用甲醇配制成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，保存期限為半年。做實(shí)驗(yàn)時(shí)現(xiàn)配1 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)液（分別吸取14 種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液10 μL，用甲醇定容至10 mL），然后在逐級(jí)稀釋成需要的質(zhì)量濃度。采用高效液相色譜-質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定，以質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)、峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

由于不同樣品基質(zhì)性質(zhì)相差較遠(yuǎn)，如果要快速同時(shí)篩查出多種真菌毒素，就要將提取效率提高的同時(shí)還要把不同樣品中目標(biāo)化合物損失降到最小。因此，食品中有毒化合物的前處理方法的關(guān)鍵是選擇提取效率好的提取溶劑和凈化好的凈化方法，減少目標(biāo)化合物在不同樣品前處理過(guò)程中的損失。

2.1.1 提取溶劑的選擇

考察不同提取劑在豆制品、面制品、牛奶樣品中的真菌毒素的的提取效果，發(fā)現(xiàn)甲醇、無(wú)水乙醇、丙酮對(duì)部分化合物的回收率影響很大。用1%乙酸-乙腈提取所有目標(biāo)物的回收率基本可以滿足分析要求，回收率為65.3%～130.1%，且干擾較少，因此選擇乙腈作為提取劑。

2.1.2 凈化條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)直接用提取劑提取時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)比較強(qiáng)，導(dǎo)致色譜峰不好，而且同時(shí)對(duì)色譜柱和儀器的損壞較大?；|(zhì)固相分散是一種新的提取凈化技術(shù)，可以將樣品的分散、萃取及凈化一次完成，省時(shí)省力，操作方便，對(duì)色譜柱和儀器起到了很好的保護(hù)作用。因此選為本研究的樣品處理方法。

同時(shí)對(duì)DisQuE基質(zhì)分散樣品制備試劑盒里兩種不同的提取管A和B做了比較。其中，DisQuE基質(zhì)固相分散樣品制備試劑盒（DisQuE提取管A：1支50 mL離心管，內(nèi)裝1.5 g無(wú)水乙酸鈉和6 g無(wú)水硫酸鎂。DisQuE凈化管：15 mL管內(nèi)有 900 mg無(wú)水硫酸鎂和150 mg PSA的硅膠基伯胺仲胺鍵合相吸附劑；DisQuE提取管B：1支50 mL離心管，內(nèi)裝4 g硫酸鎂、1 g氯化鈉、1 g檸檬酸三鈉和二水結(jié)晶鹽、以及0.5 g的檸檬酸氫二鈉合一個(gè)半水結(jié)晶鹽）。比較結(jié)果見表3，發(fā)現(xiàn)使用DisQuE提取管B的多數(shù)回收率稍高，因此選用DisQuE提取管B提取目標(biāo)物。

表3 DisQuE提取管的毒素種類比較Table 3 Comparison of different extraction tubes

2.1.3 樣品濃縮方式的選擇

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中在對(duì)樣品的有機(jī)氮吹和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)兩種常見的濃縮方式進(jìn)行了探究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氮吹導(dǎo)致樣品損失比較大，耗時(shí)比較長(zhǎng)，耗費(fèi)氮?dú)獗容^多，且提取液直接到大氣中對(duì)身體和環(huán)境的負(fù)面影響較大，因此實(shí)驗(yàn)選擇了旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的方式進(jìn)行濃縮。

2.1.4 樣品過(guò)濾器的選擇

樣品經(jīng)溶劑提取濃縮后，可能存在一些殘?jiān)螂s質(zhì)，容易導(dǎo)致液相色譜柱堵塞，同時(shí)也會(huì)污染串聯(lián)四極桿質(zhì)譜，影響篩查結(jié)果也會(huì)損傷儀器，因此需要使用過(guò)濾器對(duì)樣品進(jìn)行凈化。實(shí)驗(yàn)室常用的過(guò)濾器主要有聚醚砜、尼龍和聚四氟乙烯。聚醚砜過(guò)濾器主要是用于過(guò)濾水系樣品，實(shí)驗(yàn)考察了尼龍和聚四氟乙烯過(guò)濾器對(duì)目標(biāo)化合物的吸附作用。實(shí)驗(yàn)考察發(fā)現(xiàn)，聚四氟乙烯過(guò)濾器對(duì)藥物的吸附作用不大，因此采用聚四氟乙烯過(guò)濾器對(duì)樣品進(jìn)行凈化。

2.2 色譜與質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.2.1 流動(dòng)相的選擇

實(shí)驗(yàn)對(duì)流動(dòng)相的選擇考察水-甲醇、乙酸胺-甲醇、水-乙腈、乙酸胺-乙腈、甲酸溶液-乙腈由于14 種毒素采用電噴霧正電離模式采集，結(jié)果表明0.1%的甲酸溶液-乙腈的整體分離效果比較好，因此，選擇0.1%甲酸溶液-乙腈作為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫，在7 min內(nèi)對(duì)14 種毒素進(jìn)行分離。

2.2.2 質(zhì)譜條件的選擇

對(duì)研究的14 種毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究和相關(guān)文獻(xiàn)資料表明電噴霧正離子模式掃描就可以滿足實(shí)驗(yàn)研究的需求。因此，選擇電噴霧正離子模式掃描。

2.3 方法的驗(yàn)證

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

根據(jù)14 種化合物的響應(yīng)強(qiáng)弱，配制不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線。以峰面積對(duì)樣品的濃度進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明在0.5～20 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線行關(guān)系（表4）。在定量下限附近添加一系列低質(zhì)量濃度的樣品，以信噪比大于等于3（RSN≥3）的最低質(zhì)量濃度為最低檢出限，實(shí)驗(yàn)得出檢出限為0.5～1 μg/kg。

表4 14 種化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液通過(guò)LC-MS-MS分析所得曲線Table 4 LC-MS-MS analytic curves of 14 standard solutions

2.3.2 方法回收率和精密度

表5 14 種化合物的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 5 Average recoveries and relative standard deviations of 14 compounds

分別取豆制品、面粉、牛奶制品空白食品樣品（均為實(shí)驗(yàn)室已有陰性樣本），添加低、中、高3個(gè)水平的14 種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行前處理，測(cè)定目標(biāo)化合物。每個(gè)水平進(jìn)行6 次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表5，14 種化合物的平均回收率為65.3%～130.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.56%～11.40%。

3 結(jié) 論

本研究通過(guò)對(duì)樣品前處理方法、提取劑和LC-MSMS條件優(yōu)化，建立了一套可以同時(shí)檢測(cè)豆制品（如豆腐干）、面粉（如玉米面）、牛奶制品（如奶粉）中真菌毒素的篩查方法。本方法利用基質(zhì)固相分散樣品制備試劑盒，采用乙腈提取，得到了較好的提取效果。同時(shí)利用定性定量離子對(duì)進(jìn)行確證，通過(guò)MRM進(jìn)行信號(hào)采集，空白樣品加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)得到了較高且穩(wěn)定的回收率。該方法快速、簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確，適用樣品基質(zhì)范圍廣，尤其適合食品安全突發(fā)事件的快速應(yīng)急處置工作。

對(duì)于本實(shí)驗(yàn)研究的方法，已經(jīng)多次成功應(yīng)用于北京市食品安全突發(fā)事件處理中，并且取了很好的效果，在食品安全監(jiān)管工作中的技術(shù)支撐作用，切實(shí)為首都食品安全保駕護(hù)航。

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Simultaneous Screening for 14 Mycotoxin Contaminants in Foods by QuEChERS-LC-MS-MS

SHI Na1,2, HOU Cai-yun1,*, LU Yong2, JIANG Jie2, ZHANG Xue-liang3
(1. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China; 2. Beijing Municipal Center for Food Safety Monitoring, Beijing 100041, China; 3. College of Life Science and Bioen gineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China)

This paper presents a QuEChERS-liquid chromatography-tandem mass chromatography (LC-MS-MS) method for the simultaneous screening for 14 mycotoxin contaminants (deoxynivalenol, penicillic acid, afl atoxin M1, afl atoxin G2, citrinin, aflatoxin B1, aflatoxin B2, aflatoxin G1, zearalenone, ochratoxin A, sterigmatocystin, HT-2 toxin, T-2 toxin and podoph yllotoxin) in foods. The homogenized samples were extracted with 1% acetic acid in acetonitrile. The separation was performed on an ACQUITU UPLC BEH C18column (2.1 mm × 50 mm, 1.7 μm) by gradient elution after purifi cation by dispersive-solid-phase extraction (d-SPE). The 14 mycotoxin contaminants in foods analyzed by LC-MS-MS-ESI in the positive ionization, multiple-reaction monitoring (MRM) mode. The minimum detection limit was 0.5-1 μg/kg. The developed method proved to be simple, rapid, highly selective and sensitive, and suitable for the analysis of mycotoxin contaminants in food safety incidents.

mycotoxin contaminants; QuEChERS; liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS-MS); screening; food

TS207.3

A

1002-6630（2014）16-0190-07

10.7506/spkx1002-6630-201416037

2013-06-20

史娜（1982—），女，工程師，學(xué)士，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測(cè)分析。E-mail：bjshina@hotmail.com

*通信作者：侯彩云（1963—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測(cè)技術(shù)。E-mail：13910065708@139.com