馬曉斐，宋 煒，梁天佐，賈振國，張 巖,*

微波輔助萃取-超高效液相色譜-質(zhì)譜法測定食品用紙容器中雙酚A

馬曉斐1，宋 煒2，梁天佐1，賈振國1，張 巖1,*

（1.河北省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，河北 石家莊 050091；2.河北省食品藥品檢驗院，河北 石家莊 050011）

建立食品用紙容器中雙酚A的超高效液相色譜-質(zhì)譜檢測方法。采用微波輔助萃取儀對 樣品進(jìn)行萃取，Sep-Pak C18固相萃取柱凈化，甲醇-水（含有體積分?jǐn)?shù)0.05%氨水）作為流動相，梯度洗脫，經(jīng)Kinetex C18（2.1 mm×100 mm，2.6 μm）色譜柱分離，采用電噴霧電離，多反應(yīng)監(jiān)測模式下進(jìn)行測定。結(jié)果表明：該方法在1.0～100.0 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，其相關(guān)系數(shù)（r ）為0.999 7。在5、10 μg/kg和50 μg/kg 3個添加水平下，雙酚A的平均回收率穩(wěn)定在90.5%～98.6%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5.6%，方法檢出限2.5 μg/kg。該方法操作簡便，靈敏度高，適用于食品用紙容器中雙酚A殘留分析。

超高效液相色譜-質(zhì)譜；雙酚A；微波輔助萃??；食品用紙容器

雙酚A是一種重要的化工原料，被廣泛應(yīng)用于食品包裝材料及容器內(nèi)壁涂料[1-3]。研究表明，雙酚A可滲透、轉(zhuǎn)移進(jìn)入到食品及飲料中，可引起人類和動物的內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)異常，不僅具有致癌、致突變、致畸的危害，還會嚴(yán)重干擾人類和動物的生殖遺傳功能，目前已引起世界各國的關(guān)注[4-6]。2008年，加拿大衛(wèi)生部宣布雙酚A為危害物質(zhì)，禁止進(jìn)口和銷售含有雙酚A的聚碳酸酯嬰兒奶瓶。挪威污染控制署頒布的“關(guān)于限制特定有害物質(zhì)在消費品中的使用”（prohibition on certain hazardous substances in consumer products，PoHS）指令也限制雙酚A在消費品中的使用。隨著人們對環(huán)保要求的日益嚴(yán)格，紙質(zhì)包裝材料以其良好的物理性能、機(jī)械操作性能以及環(huán)保方面的優(yōu)勢，已經(jīng)成為食品包裝行業(yè)的重要原料之一。但是紙質(zhì)包裝材料在生產(chǎn)及后續(xù)加工過程中會添加一些化學(xué)物質(zhì)或者存有潛在的污染物，如雙酚A通過這些包裝材料遷移進(jìn)入食品中，嚴(yán)重威脅到人們的身體健康。因此建立食品包裝，特別是食品用紙容器中雙酚A的測定方法是十分必要的。

目前，雙酚A的檢測方法主要有高效液相色譜法[7-11]、氣相色譜-質(zhì)譜法[12-15]和液相色譜-質(zhì)譜法[16-20]，但是使用氣、液相色譜法無法滿足被測物準(zhǔn)確定性的要求，而氣相色譜-質(zhì)譜法則需要應(yīng)用衍生試劑進(jìn)行衍生化，實驗過程不僅費時費力，檢測方法靈敏度也不能滿足測定要求。液相色譜-質(zhì)譜法前處理過程不需要衍生反應(yīng)，具有操作簡便、選擇性和靈敏度高等優(yōu)點，近年來報道逐步增多。 雙酚A的前處理方法主要有液液萃取、超聲提取和微波萃取等方法，而微波萃取技術(shù)在提取效率和提取回收率等方面具有顯著的優(yōu)勢，越來越備受人們的青睞。目前，尚未見食品用紙容器中雙酚A的檢測方法，本研究應(yīng)用微波輔助萃取-超高效液相色譜-質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS-MS）法，建立了食品用紙容器中雙酚A的檢測方法，該方法靈敏度高、選擇性和特異性好，為食品包裝用紙的高通量快速檢測提供了可靠的分析平臺。由于本方法檢出限低，所以更適合作為可疑樣品的定性確證方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紙餐盒（一次性紙質(zhì)餐盒）、紙杯（一次性紙質(zhì)水杯）、復(fù)合紙罐（膨化食品包裝紙罐） 市購；雙酚A標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%） 美國Sigma公司；甲醇、正己烷、二氯甲烷均為色譜純 美國Fisher Scientic公司；去離子水由Millipore公司超純水器制得。

1.2 儀器與設(shè)備

8030超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司；Explorer sp 48全自動微波萃取儀 美國培安公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Büchi公司；Sep-Pak C18固相萃取柱（500 mg，6 mL）、氮吹儀 美國Organomation Associates.Jnc公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制

用甲醇配制雙酚A質(zhì)量濃度1 000 mg/L的儲備液，使用時再用甲醇稀釋成所需的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，所有標(biāo)準(zhǔn)溶液在4 ℃冰箱中保存。

1.3.2 樣品的測定

將樣品剪成約1 cm×1 cm的小塊。稱取2 g試樣于35 mL微波輔助萃取管中，加入15 mL二氯甲烷萃取溶液，萃取功率300 W，50 ℃條件下萃取10 min，冷卻至室溫，將萃取液轉(zhuǎn)移至25 mL比色管中，于40 ℃條件下減壓濃縮至近干，用正己烷定容至3 mL，待凈化。

凈化前首先將Sep-Pak C18柱依次用3.0 mL二氯甲烷和3.0 mL甲醇活化，將試樣全部轉(zhuǎn)移至已活化好的固相萃取柱上，流速控制在1 mL/min，待樣品溶液流盡后，先用10 mL正己烷淋洗，再用5 mL甲醇洗脫，收集洗脫液于40 ℃條件下氮吹至干，加入甲醇-水（1∶1，V/V）溶液1 mL，旋渦混勻2 min，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，待測。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Kinetex C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.6 μm）；柱溫：35 ℃；流動相：0.05%氨水（A）＋甲醇（B），流速0.3 mL/min；梯度洗脫：0 min，60%B；0～3.0 min，60%～90%B；3.0～5.0 min，90%～60%B；進(jìn)樣量：2.0 μL。

1.3.4 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）源；離子化方式：負(fù)模式；監(jiān)測模式：多反應(yīng)監(jiān)測；脫溶劑氣流量：15 L/min；脫溶劑氣溫度：250 ℃；離子源電壓：3.5 kV；離子源溫度：350 ℃；監(jiān)測離子對：母離子m/z 227.0、定量離子m/z 212.0、定性離子m/z 133.0；監(jiān)測離子及碰撞能量：m/z 227.0＞212.0（20 eV），m/z 227.0＞133.0（20 eV）。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取方式的選擇

實驗采用空白樣品（紙餐盒、紙杯和復(fù)合紙罐）加標(biāo)法，比較了索氏萃取、超聲萃取、恒溫振蕩萃取和微波輔助萃取4 種萃取方式的提取回收率，結(jié)果見表1。研究表明，恒溫振蕩萃取提取率較低，索氏萃取和超聲萃取的提取率相當(dāng)，但索氏萃取存在耗時長和操作繁瑣等缺點，微波輔助萃取提取率最高，而且提取速度快，操作簡便，因此，選用微波輔助萃取作為實驗萃取方式。

表1 萃取方式的選擇Table 1 Selection of optimal extraction procedure

2.2 萃取條件的選擇

實驗采用空白樣品（紙餐盒、紙杯和復(fù)合紙罐）加標(biāo)法，考察了甲醇、正己烷、二氯甲烷分別作為萃取溶劑時雙酚A的提取回收率（圖1）。研究表明，二氯甲烷的萃取效率最高。同時對萃取溫度和萃取時間進(jìn)行了優(yōu)化（圖2和圖3），確定最終萃取條件為二氯甲烷為萃取溶劑，萃取溫度50 ℃、萃取時間10 min。

圖1 萃取溶劑的萃取效率比較Fig.1 Comparison of extraction efficiency using different solvents

圖2 萃取時間的萃取效率比較Fig.2 Comparison of extraction efficiency after different extraction periods

圖3 萃取溫度的萃取效率比較Fig.3 Comparison of extraction efficiency at different temperatures

2.3 凈化條件的選擇

圖4 Sep-Pakk C18固相萃取柱洗脫實驗圖Fig.4 Elution curve on Sep-Pak C18column

實驗考察了Sep-Pak C18柱、Oasis HLB柱和Supelclean Envi-Carb柱對凈化效果和回收率的影響。結(jié)果表明，Sep-Pak C18固相萃取柱的凈化效果最佳。實驗選用100 ng/mL的雙酚A標(biāo)準(zhǔn)物溶液作回收率實驗研究，選用500 mg/6 mL Sep-Pak C18固相萃取柱，結(jié)果表明，10 mL正己烷淋洗時不會使被測物流失，使用5 mL甲醇洗脫回收率即可達(dá)到90%以上（圖4），所以實驗選擇500 mg/6 mL Sep-Pak C18固相萃取柱進(jìn)行富集凈化。

2.4 儀器條件的選擇及優(yōu)化

實驗比較了Agilent poroshell 120 SB-C18和Kinetex C182種反相色譜柱的分離效果。結(jié)果表明，使用Kinetex C18（2.1 mm×100 mm，2.6 μm）色譜柱，分析速度快，峰形及色譜分離效果顯著優(yōu)于Agilent poroshell 120 SB-C18色譜柱（圖5）。同時考察了甲醇-水和乙腈-水兩種流動相體系對目標(biāo)物離子化程度的影響。結(jié)果表明，使用甲醇-水時，響應(yīng)值為乙腈-水流動相的2.5 倍，但峰形寬。實驗進(jìn)一步優(yōu)化了流動相，比較了甲醇-水、甲醇-醋酸銨溶液、甲醇-甲酸銨溶液和甲醇-氨水溶液作為流動相時目標(biāo)物的離子化效率和峰形。研究表明，在流動相中加入一定量的氨水時，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)物的響應(yīng)值有了明顯的提高，且峰寬明顯變窄。除了考察流動相組成外，還比較了流動相體系中氨水溶液的體積分?jǐn)?shù)分別為0.01%、0.025%、0.05%、0.1%和0.25%時目標(biāo)物響應(yīng)值，結(jié)果表明，甲醇-水（體積分?jǐn)?shù)0.05%氨水）作為流動相獲得了最優(yōu)峰形和最高質(zhì)譜響應(yīng)。這是由于雙酚A具有弱酸性，當(dāng)流動相中加入一定的堿性物質(zhì)（氨水）時，信號響應(yīng)值得到了顯著提高。

圖5 Agilent poroshell 120 SB-C18（a）and Kineteexx C18（b）色譜柱的總離子流圖Fig.5 Total ion current chromatograms using Agilent poroshell 120 SB-C18(a) and Kinetex C18(b)

本實驗選用ESI作為離子化模式，在負(fù)離子檢測方式下對雙酚A進(jìn)行一級質(zhì)譜掃描，雙酚A脫去氫離子后得到m/z 227的母離子[M—H]-，對其母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，實驗通過對碰撞能等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行比較和優(yōu)化，雙酚A分子斷裂后形成m/z 212、m/z 133和m/z 93的特征碎片離子，這些離子分別是m/z 227母離子失去碎片CH3，C6H6O和C9H11O而產(chǎn)生的，最終確定m/z 212為定量離子、m/z 133為定性離子（圖6）。

圖6 雙酚標(biāo)準(zhǔn)溶液多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖（5.0 ng/mL）Fig.6 Multi-reaction monitoring chromatogram of bisphenol A standard solution (5.0 ng/mL)

2.5 線性方程和檢出限

為消除樣品基質(zhì)效應(yīng)，實驗采用空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶 液法制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。取空白樣品按照1.3.1節(jié)操作，制備空白基質(zhì)溶液，將標(biāo)準(zhǔn)工作液用空白基質(zhì)溶液逐級稀釋得到質(zhì)量濃度1、2、5、10、20、50、100 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按質(zhì)量濃度從低到高依次經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜測定，以雙酚A（m/z 227.0＞212.0）的峰面積（Y）對其質(zhì)量濃度（X，μg/L）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，雙酚A的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢出限見表2。

本實驗采用空白樣品加標(biāo)法以信噪比RSN≥3確定檢出限，雙酚A的檢出限為2.5 μg/kg。雙酚A空白樣品及空白樣品加標(biāo)圖譜見圖7。

圖7 空白樣品色譜圖（a）及空白樣品加標(biāo)色譜圖（b）（2.5 μg/kg）Fig.7 Chromatogram of blank samples (a) and chromatogram of spiked blank samples (b) (2.5 μg/kg)

表2 雙酚A的線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 2 Linear equations, correlation coefficients and LOD of bisphenooll AA

2.6 回收率和精密度

采用3 種空白樣品（紙餐盒、紙杯和復(fù)合紙罐）加標(biāo)的方式進(jìn)行回收率實驗，分別添加低、中、高3 個質(zhì)量濃度水平后，進(jìn)行微波輔助萃取，經(jīng)富集凈化后濃縮，每個質(zhì)量濃度平行測定6 次，同時采用空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液法制備3 種空白樣品標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，在不同的添加質(zhì)量濃度條件下，雙酚A的平均回收率穩(wěn)定在90.5%～98.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于5.6%。

表3 空白樣品中雙酚A的加標(biāo)回收率和精密度（n=6）Table 3 Spiked recoveries of bisphenol A in blank samples (n = 6)

2.7 實際樣品的檢測

用建立的方法對目前市場在售的食品用紙容器共計15 批次進(jìn)行檢測，均未檢出雙酚A。

3 結(jié) 論

該方法采用微波輔助萃取，Sep-Pak C18固相萃取柱凈化，液相色譜-質(zhì)譜法對食品用紙容器中雙酚A的測定進(jìn)行了研究。本方法的回收率、檢出限和精密度等各項技術(shù)指標(biāo)均符合要求，該方法具有操作簡便、檢出限低、準(zhǔn)確度高、污染小的特點，在食品用紙容器中雙酚A的檢測及確證方面有著較高的實用價值和應(yīng)用前景。

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Determination of Bisphenol A in Paper Food Containers by Ultra Performance Liquid Chromatography and Tandem Mass Spectrometry

MA Xiao-fei1, SONG Wei2, LIANG Tian-zuo1, JIA Zhen-guo1, ZHANG Yan1,*
(1. Hebei Institute of Food Quality Supervision Inspection and Research, Shijiazhuang 050091, China; 2. Hebei Provincial Institute for Food and Drug Control, Shijiazhuang 050011, China)

A method for the determination of bisphenol A in paper food containers by ultra performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry (UPLC-MS-MS) after microwave-assisted extraction was developed. Sample extracts were purification on a Sep-Pak C18column. The target compound was separated on a Kinetex C18(2.1 mm × 100 mm, 2.6 μm) column using methanol-water (containing 0.05% ammonia water) as the mobile phase with gradient elution, and detected by MS with electrospray ionization (ESI) under a multiple reaction-monitoring mode. In the range of 1.0 to 100.0 μg/L, the calibration curve developed showed good linearity with correlation coefficients (r2) of 0.999 7. The recoveries for spiked samples were 90.5%-98.6% at three levels of 5, 10 and 50 μg/kg, and the relative standard deviations were less than 5.6%. The limit of detection was 2.5 μg/kg. The method proved to be easy to use, timesaving, sensitive and suitable for the determination of bisphenol A residues in food paper containers.

ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry; bisphenol A; microwave-assisted extraction; paper food containers

R917

A

1002-6630（2014）16-0165-05

10.7506/spkx1002-6630-201416032

2013-10-12

河北省質(zhì)監(jiān)局科技計劃項目（2012ZD09）

馬曉斐（1984—），男，工程師，碩士，主要從事食品中禁用物質(zhì)及藥物殘留分析。E-mail：xiaofeima1984@163.com

*通信作者：張巖（1979—），男，高級工程師，博士，主要從事化學(xué)危險品安全性評價技術(shù)研究。E-mail：snowwinglv@126.com