嚴忠雍，張小軍,*，梅光明，李佩佩，龍 舉，祝 銀，王 建

分散固相萃取凈化-液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定水產(chǎn)苗種中硝基呋喃類代謝物殘留量

嚴忠雍1,2，張小軍1,2,*，梅光明1,2，李佩佩1,2，龍 舉1,2，祝 銀1,2，王 建3

（1.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江 舟山 316021；2.浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術(shù)研究重點實驗室，浙江 舟山 316021；3.浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江 杭州 310035）

建立分散固相萃取凈化-液相色譜-質(zhì)譜法測定水產(chǎn)苗種中氨基脲、5-甲基嗎啉-3-氨基-2-噁唑烷基酮、3-氨基-2-噁唑烷基酮、1-氨基-2-內(nèi)酰脲，4 種硝基呋喃類代謝物殘留量的方法。樣品經(jīng)甲醇-水（8∶1，V/V）溶液洗滌后，鹽酸溶液水解，以2-硝基苯甲醛作為衍生化試劑，乙酸乙酯萃取，濃縮，分散固相萃取凈化，采用液相色譜-質(zhì)譜儀、多反應監(jiān)測掃描模式檢測和同位素內(nèi)標定量。4 種硝基呋喃類代謝物在0.5～20 μg/L范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)大于0.997，檢出限0.1 μg/kg，回收率90.5%～104.5%，相對標準偏差1.56%～8.08%。本方法靈敏、高效、簡單、重復性好，滿足硝基呋喃類代謝物的檢測要求。

分散固相萃取；液相色譜-質(zhì)譜；水產(chǎn)苗種；硝基呋喃類代謝物

硝基呋喃類藥物是一類合成的抗菌藥物，主要包括呋喃妥因、呋喃它酮、呋喃唑酮、呋喃西林，作用于微生物酶系統(tǒng)，抑制乙酰輔酶A，干擾微生物糖類的代謝，從而起抑菌作用，廣泛用于家禽、家畜、水產(chǎn)等動物傳染病的預防與治療[1]。由于硝基呋喃類藥物對人類健康具有潛在危害，是世界各國普遍禁止使用的藥物[2]。我國于2002年頒布了禁止使用硝基呋喃類抗生素的禁令[3]。硝基呋喃類抗菌劑原型藥在動物體內(nèi)代謝迅速，但是其代謝產(chǎn)物和蛋白質(zhì)結(jié)合后很穩(wěn)定[4]。目前，歐盟國家要求代謝產(chǎn)物為目標分析物，以達到檢測硝基呋喃殘留的目的[5]。硝基呋喃類代謝物有1-氨基-2-內(nèi)酰脲（1-aminohydantoin，AHD）、5-甲基嗎啉-3-氨基-2-噁唑烷基酮（5-morpholinomethyl-3-amino-2-oxazolidone，AMOZ）、3-氨基-2-噁唑烷基酮（3-amino-2-oxazolidone，AOZ）、氨基脲（semicarbazide，SEM）。

目前文獻報道的硝基呋喃類代謝物殘留的分析方法主要是：高效液相色譜法[6]和液相色譜-質(zhì)譜法[7-11]；硝基呋喃類代謝物檢測的前處理方法有固相萃取[12-14]及液液萃取[15]。原有的文獻方法能基本滿足水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物的檢測分析要求，但在檢測水產(chǎn)苗種時并不能達到較好的效果。水產(chǎn)苗種異于水產(chǎn)成品，尤其是蝦蟹類苗種，在其苗種期個體幼小通常帶殼制樣，水解過程中消耗大量鹽酸，導致水解不完全，衍生化效率降低；水產(chǎn)苗種樣品通常含水率較多，且樣品基質(zhì)成分復雜，如果未進行合適有效凈化手段，會造成分析物嚴重損失，因此有必要建立一種針對水產(chǎn)苗種中硝基呋喃類代謝物的分析方法。分散固相萃取法是一種快速、穩(wěn)定的前處理方法，但用于硝基呋喃類代謝物檢測尚未見報道。本研究在前處理階段根據(jù)鹽酸消耗量優(yōu)化鹽酸用量，利用分散固相萃取凈化結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜法測定，建立水產(chǎn)苗種中硝基呋喃類代謝物殘留量分析方法，本方法簡便、高效、快速、靈敏度高、重復性好，定量限、回收率與精密度均滿足殘留分析和殘留限量要求，同時對其他產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物的檢測具有參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹽酸、磷酸氫二鉀（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；乙酸乙酯、乙酸銨、甲酸、二甲亞砜、甲醇、2-硝基苯甲醛等（均為色譜純），硝基呋喃代謝物標準品及其內(nèi)標物：AOZ、SEM-HCl、AHD-HCl、AMOZ、AOZ-D4、SCA-HCl-13C-15N2、AHD-HCl-13C3、AMOZ-D5（純度均≥98%） 美國Sigma公司；N-丙基乙二胺（N-propylethylendiamine，PSA）、十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18）、弗羅里硅土（Florisil）、中性氧化鋁（Al2O3）、多壁碳納米管（MWCNT） 天津Agela有限公司。

標準儲備液：準確稱取5.00 mg AOZ、SEM、AHD、AMOZ標準品（SEM、AHD的質(zhì)量均為SEM-HCl，AHDHCl去除鹽酸后換算的質(zhì)量），用甲醇溶解定容于50 mL容量瓶，4 ℃避光保存，保存期限為6 個月；使用時逐級稀釋至100 ng/mL。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITy超高效液相色譜-質(zhì)譜儀（配電噴霧離子源，Quattro Premier XE） 美國Waters公司；T18勻漿機、MS2漩渦混合器 德國IKA公司；氮氣吹干儀 美國Organomatio公司；Centrifuge5810高速離心機 德國Eppendorf公司；SK25IOHP超聲波清洗器 上?？茖С晝x器有限公司；恒溫振蕩器 常州國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

準確稱取2.00 g均質(zhì)水產(chǎn)苗種樣品于50 mL離心管中，加1 mL水和8 mL甲醇，渦旋振蕩2 min，6 000 r/min離心5 min，棄去上清液。加100 ng/mL混合內(nèi)標工作液0.1 mL，再加0.2 mol/L鹽酸溶液5 mL（當樣品是蝦蟹類苗種時，改加0.9 mol/L鹽酸溶液5 mL）和0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛0.15 mL，渦旋振蕩2 min后，37 ℃恒溫避光振蕩16 h。取出離心管冷卻到室溫，加入適量1 mol/L磷酸氫二鉀溶液，調(diào)節(jié)pH值至7.0～7.5。加入5 mL乙酸乙酯，渦旋振蕩1 min，6 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液至15 mL聚四氟乙烯離心管中；下層溶液加入5 mL乙酸乙酯重復提取一次，合并后的上清液40 ℃ N2吹干。殘渣用1 mL流動相溶解，加100 mg PSA，渦旋1 min，6 000 r/min離心3 min，取上清液經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾，轉(zhuǎn)移至進樣瓶供液相色譜-質(zhì)譜分析。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：ACQUITy UPLC BEH C18柱（2.1 mm× 50 mm，1.7 μm）；柱溫40 ℃；樣品室溫度10 ℃；進樣量10 μL；流速0.2 mL/min；流動相A為含有體積分數(shù)0.1%甲酸的2 mmol/L醋酸銨溶液，B為甲醇，梯度洗脫（線性改變），梯度洗脫設(shè)置詳見表1。

表1 流動相梯度洗脫Table 1 Mobile phase composition for gradient elution

1.3.3 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子（electorspray ionization，ESI+）源，正離子掃描；檢測方式：多重反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）；毛細管電壓3.0 kV；離子源溫度120 ℃；脫溶劑氣溫度380 ℃；脫溶劑氣流量600 L/h；錐孔氣流量50 L/h；錐孔電壓和碰撞能量等質(zhì)譜多反應監(jiān)測實驗條件見表2。

表2 硝基呋喃代謝物和相應內(nèi)標的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 ESI-MS-MS conditions for the analysis of 4 nitrofuran metabolites and their corresponding internal standards

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品洗滌

水產(chǎn)苗種樣品含水率較多，且樣品基質(zhì)成分復雜，若當水產(chǎn)成品按農(nóng)業(yè)部783號公告-1—2006《水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定：液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[16]前處理，直接影響檢測結(jié)果。若對水產(chǎn)苗種先用甲醇-水混合溶液（8∶1，V/V）洗滌處理[17]，可以去除樣品均質(zhì)液中黏液、色素等雜質(zhì)，減少分析干擾，防止被測物和內(nèi)標物丟失。加標水平為2.5 μg/kg梭子蟹苗種未洗滌處理的色譜圖及洗滌處理后的色譜圖如圖1、2所示。對比可知，未進行洗滌處理的樣品AHD未出峰，AHD-13C3、AOZ-D4，AOZ峰面積小，響應值低；而SEM-13C-15N2未分開，峰形雜亂。而經(jīng)洗滌處理的樣品基線較平穩(wěn)，除AHD峰面積較小外，其他目標物響應值高，峰形完整。

圖1 未洗滌處理的2.5μg/kg梭子蟹苗種MRM圖譜Fig.1 MRM ion chromatograms of crab fingerlings (2.5 μg/kg) without washing

圖2 洗滌處理后的2.5μg/kg梭子蟹苗種MRM圖譜Fig.2 MRM ion chromatograms of crab fingerlings (2.5 μg/kg) with washing

2.2 鹽酸用量優(yōu)化

蝦蟹類苗種由于個體較小，不易去殼，通常帶殼制樣，而殼的碳酸鈣含量很高，能與鹽酸反應，使反應體系的酸度發(fā)生變化，導致酸水解不完全，衍生化效率降低。實驗分別取5 mL 0.2、0.4、0.6、0.8 mol/L和1.0 mol/L鹽酸溶液水解加標水平為2.5 μg/kg的梭子蟹苗種與梭子蟹肌肉樣品，測定酸水解16 h后的pH值，比較不同濃度鹽酸水解下的回收率，衡量碳酸鈣與鹽酸反應的消耗量，以得到蝦蟹類苗種水解所需鹽酸的最佳值。結(jié)果表明，隨著 鹽酸溶液濃度的增大對梭子蟹肌肉中的4 種硝基呋喃代謝物并不造成影響，5 mL 0.2 mol/L鹽酸溶液足以完全水解肌肉中的蛋白質(zhì)，且有較好的衍生化效果，無需過量提高鹽酸濃度。不同濃度的鹽酸溶液對梭子蟹苗種中AMOZ和AOZ影響不大，無明顯變化趨勢；隨著鹽酸濃度增大，梭子蟹苗種中AHD峰面積逐漸增大后趨于平緩，表明之前蛋白質(zhì)并未充分水解；而梭子蟹苗種中SEM濃度的變化略帶波動性，因SEM是甲殼類水產(chǎn)品中的內(nèi)源性物質(zhì)，自然存在于甲殼[18]。表3為酸水解16 h后測定的pH值，由于在梭子蟹肉中5 mL 0.2 mol/L鹽酸溶液足以完全水解肌肉中的蛋白質(zhì)，表明酸水解后pH 2.2是樣品充分酸水解的標示；而當樣品是梭子蟹苗種時，酸水解后pH 2.2對應的鹽酸濃度約為0.9 mol/L。最終確定5 mL 0.9 mol/L鹽酸作為蝦蟹類苗種酸水解所需的鹽酸量，其水解后測定色譜圖見圖3。

表3 樣品在不同濃度鹽酸水解16 h后測定的pH值Table 3 pH values of samples after 16 h of hydrolysis with different concentrations of hydrochloric acid

圖3 100 mg PSA凈化后2.5μg/kg的梭子蟹苗種MRM圖Fig.3 MRM ion chromatograms of 2.5 μg/kg crab fingerlings purified with 100 mg of PSA

2.3 吸附劑的選擇和優(yōu)化

水產(chǎn)苗種樣品脂類、色素等雜質(zhì)較多，濃縮溶解后，溶液呈混濁狀，需凈化處理后上樣。實驗分別稱取一 定量的PSA、C18、Florisil、Al2O3、MWCNT凈化加標水平為2.5 μg/kg的梭子蟹苗種樣品，考察不同吸附劑的凈化效果，比較各藥物的回收率，結(jié)果如圖4所示。MWCNT具有巨大的比表面積和結(jié)構(gòu)特異性，能有效去除色素類等干擾物[19]，但對AMOZ、SEM、AHD及AOZ的吸附作用也很強；Florisil作為強極性吸附劑，無法有效去除脂類雜質(zhì)，且對AMOZ具較強的吸附性。而PSA、C18、Al2O3對AMOZ、SEM、AHD和AOZ都有較高的回收率，為得到更好的凈化效果和回收率，對這3 種吸附劑用量進行優(yōu)化。分別稱取25、50、75、100 mg和125 mg的PSA、C18、Al2O3凈化加標水平為2.5 μg/kg的梭子蟹苗種樣品，觀察凈化液的顏色，透明度，并計算信噪比（以AMOZ為例），如圖5所示。Al2O3和C18雖有較好的回收率，能去除脂類雜質(zhì)[20]，但凈化效果不明顯，即使加大吸附劑用量，也未得到良好的改善，凈化液仍是混濁狀。PSA作為弱陰離子交換劑，能去除脂肪酸、甾醇類、有機碳水化合物、色素等雜質(zhì)[21]，凈化效果好，凈化液呈無色透明狀，且有較高的回收率。當PSA用量小于100 mg時，凈化效果隨用量增大而明顯增大；而超過100 mg后，趨于平緩。最終選擇100 mg的PSA作為吸附劑，降低樣品基質(zhì)中色素、碳水化合物、脂類等物質(zhì)，也獲得凈化效果和回收率之間較好的平衡。

圖4 吸附劑對2.5μg/kg梭子蟹苗種中4種硝基呋喃代謝物回收率的影響Fig.4 Influence of different sorbents on the recoveries of 4 nitrofuran metabolites in 2.5 μg/kg crab fingerlings

圖5 吸附劑用量對2.5μg/kg梭子蟹苗種中AMOZ響應值的影響Fig.5 Influence of different sorbent dosages on the SNR of AMOZ in 2.5 μg/kg crab fingerlings

2.4 線性范圍及檢出限

用硝基呋喃4 種代謝物標準使用液配制質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/L的標準溶液，內(nèi)標添加質(zhì)量濃度均為5.00 μg/kg，進樣后制作標準曲線，硝基呋喃4 種代謝物的線性方程及相關(guān)系數(shù)如表4所示。結(jié)果表明，硝基呋喃4 種代謝物在0.5～20.0 μg/L內(nèi)線性良好，方法的檢出限理論上為被測物質(zhì)豐度較弱子離子的信噪比（RSN）不小于3，將加標質(zhì)量濃度逐級稀釋添加于空白樣品中測定信噪比，最終確定該方法的4 種硝基呋喃類代謝物檢出限均為0.1 μg/kg，定量限均為0.3 μg/kg。

表4 4 種硝基呋喃代謝物的線性方程與相關(guān)系數(shù)Table 4 Linear equations and correlation coefficients of 4 nitrofuran metabolliitteess

2.5 回收率及精密度

準確稱取2.00 g陰性烏鱧苗種樣品，添加水平為0.5、1.0、5.0 μg/kg的標準溶液，每個添加水平平行測定6 次，計算其回收率和精密度，見表5。結(jié)果表明，方法在0.5～5.0 μg/kg添加水平之間的回收率為90.5%～104.5%，相對標準偏差為1.56%～8.08%。完全符合硝基呋喃類代謝物的檢測要求。2.6 實際樣品測定

表5 4 種硝基呋喃代謝物的平均回收率和相對標準偏差（n=6）Table 5 Average recoveries and relative standard deviations for 4 nitrofuran metabolitess (n=6)

在實際測定的34 個苗種樣品（采自不同養(yǎng)殖場）中包括12 個烏鱧苗種、12 個南美白對蝦苗種和10 個梭子蟹苗種，檢出8 個陽性樣品。其中陽性烏鱧苗種1 個，SEM含量1.12 μg/kg；陽性對蝦苗種1 個，AOZ含量2.05 μg/kg；陽性梭子蟹苗種6 個，SEM含量1.24、1.32、1.12、1.40、1.06μg/kg和1.17 μg/kg。由于SEM是甲殼類水產(chǎn)品中的內(nèi)源性物質(zhì)，呋喃西林并不是甲殼類水產(chǎn)品中SEM的唯一來源，故6 個陽性梭子蟹苗種不能直接作為是否進行投藥依據(jù)；而陽性烏鱧苗種和陽性對蝦苗種表明部分水產(chǎn)苗種在生長期就已開始投放硝基呋喃類藥物。因此，有必要在水產(chǎn)苗種階段控制硝基呋喃類藥物，為水產(chǎn)品質(zhì)量安全提供重要保障。

3 結(jié) 論

有關(guān)硝基呋喃類代謝物殘留量測定的文獻報道很多，但大多數(shù)研究對象為水產(chǎn)成品，針對水產(chǎn)苗種的研究較少，而原有的文獻方法用于水產(chǎn)苗種檢測并未有較好的效果。為滿足水產(chǎn)苗種中硝基呋喃類代謝物檢測的需要，根據(jù)水產(chǎn)苗種的差異性和特殊性，建立了分散固相萃取凈化-液相色譜-質(zhì)譜法測定水產(chǎn)苗種中硝基呋喃類代謝物的分析方法，前處理優(yōu)化鹽酸用量，采用PSA作為吸附劑凈化分析物，方法重復性好，靈敏度高，滿足硝基呋喃類代謝物的檢測要求。

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Determination of Nitrofuran Metabolite Residues in Aquatic Fingerlings by High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry with Dispersive Solid Phase Ex traction

YAN Zhong-yong1,2, ZHANG Xiao-jun1,2,*, MEI Guang-ming1,2, LI Pei-pei1,2, LONG Ju1,2, ZHU Yin1,2, WANG Jian3
(1. Marine Fisheries Research lnstitute of Zhejiang Province, Zhoushan 316021, China; 2. Key Laboratory of Sustainable Utilization of Technology Research for Fishery Resourceof Zhejiang Province, Zhoushan 316021, China; 3. College of Food Science and Biotechnology, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310035, China)

A method has been developed for the determination of four metabolites of nitrofuran, i.e. semicarbazide (SEM), 3-amino-5-morpholinomethyl-2-oxazolidineone (AMOZ), 3-amino-2-oxazolidinone (AOZ) and 1-aminohydantoin hydrochloride (AHD) in aquatic fi ngerlings, by high performance liquid chromatography-mass spectrometry with dispersive solid phase extraction. Samples were washed with a mixture of methanol-water (8:1, V/V), subjected to HCl acidolysis and derivatized using 2-nitrobenzaldehyde. The derivative was extracted with ethyl acetate, then concentrated and cleaned up by dispersive solid phase extraction. The analysis was carried out in the multi-reaction monitoring (MRM) mode and internal standard isotope dilution method was used for quantifi cation. Good linearity was obtained in the correlations between the peak areas and concentrations of the four metabolites of nitrofuran antibiotics over the concentration range from 0.5 to 20.0 μg/L, with correlation coeffi cients above 0.997. The limits of detection (LODs) for the four compounds were all 0.1 μg/kg. The range of average recoveries was between 90.5% and 104.5%, with relative standard deviations (RSDs) between 1.56% and 8.08%. The effi cient and simple method could be used to identify and quantify the metabolites of nitrofuran antibiotics in aquatic fi ngerlings with satisfactory sensitivity and repeatability.

dispersive solid phase extraction; high performance liquid chromatography-mass spectrometry; aquatic fi ngerlings; nitrofuran metabolites

TS201.6

A

1002-6630（2014）16-0153-07

10.7506/spkx1002-6630-201416030

2013-10-22

浙江省自然科學基金項目（LQ13C200004）；浙江省科技計劃項目（2013C37072）

嚴忠雍（1990—），男，助理工程師，學士，研究方向為漁業(yè)環(huán)境監(jiān)測和水產(chǎn)品質(zhì)量安全。

E-mail：yzy123123123@126.com

*通信作者：張小軍（1982—），男，工程師，博士，研究方向為水產(chǎn)品質(zhì)量安全和標準化。E-mail：xiaojun3627@163.com