寧方勇，白秀娟

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030）

綿羊卵巢不同獲卵方法及體外成熟效果比較

寧方勇，白秀娟*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030）

采用抽吸、切割和抽吸結(jié)合切割3種方法，從綿羊卵巢獲取卵母細(xì)胞，分別比較3種方法獲得A、B、C級(jí)卵母細(xì)胞的數(shù)量及耗時(shí)。結(jié)果表明，抽吸結(jié)合切割和切割法耗時(shí)分別為136.07和131.60 s，均顯著高于抽吸法61.33 s（P＜0.05）；而獲得可用卵（包括A、B級(jí)）以切割法最好為8個(gè)。對(duì)比不同激素劑量組合的3種培養(yǎng)液，均能獲得81%以上成熟率，但成熟率差異不顯著。成熟液：TCM199-HCO3+10%FBS+l μg·mL-1雌二醇+2.2 g·mL-1NaHCO3+50 μg·mL-1慶大霉素+5 μg·mL-1FSH+0.38 mmol·L-1丙酮酸鈉+1 IU·mL-1LH+10 mmol·L-1Hepes可獲得最高83.4%卵母細(xì)胞成熟率；綿羊卵巢保存在10～15℃、15～20℃和20～30℃條件下，所獲卵母細(xì)胞成熟率都在82%以上，差異不顯著；IA23187聯(lián)合6-DMAP孤雌激活體外成熟綿羊卵母細(xì)胞，可獲最高91.5%孤雌胚率。

綿羊卵巢；獲卵方法；體外成熟；比較

胚胎干細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因、核移植及傳統(tǒng)的體外受精技術(shù)[1-5]需要大量卵母細(xì)胞和胚胎。隨著現(xiàn)代胚胎工程技術(shù)迅速發(fā)展，對(duì)綿羊卵母細(xì)胞需求量迅速增加。不斷改進(jìn)現(xiàn)有卵母細(xì)胞采集方法，最大限度從屠宰綿羊卵巢獲取最大數(shù)量的優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞，提高綿羊卵巢的利用效率是胚胎工程技術(shù)研究的熱點(diǎn)。

影響綿羊卵母細(xì)胞體外成熟因素較多，目前，綿羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液大部分采用穩(wěn)定性較好的TCM199作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，不同研究者通過添加各種離子、激素和細(xì)胞因子等獲得較高成熟率。激素在綿羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)體系中具有重要作用。激素在體外成熟培養(yǎng)液中添加，能顯著提高綿羊卵母細(xì)胞體外成熟成熟率，提高卵母細(xì)胞核成熟和胞質(zhì)成熟同步化，所獲成熟卵母細(xì)胞在后續(xù)胚胎發(fā)育過程中表現(xiàn)出較好發(fā)育能力。FSH、LH和雌二醇是當(dāng)前各種成熟培養(yǎng)體系中應(yīng)用較多，效果較為明顯的3種激素。

本試驗(yàn)旨在篩選一種適合綿羊卵巢的采卵方法，確定綿羊卵巢理想保存溫度，探索保證卵母細(xì)胞成熟率的適宜激素濃度劑量組合，并確立體外成熟綿羊卵母細(xì)胞的孤雌激活方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試卵巢

綿羊卵巢采集于黑龍江省蘭西縣榆林鎮(zhèn)興達(dá)畜禽屠宰公司。

1.1.2 供試藥劑

卵巢保存液：0.9%滅菌生理鹽水、100 μg·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素；PBI操作液：NaCl 8 g·L-1、KCl 0.2 g·L-1、Na2HPO4·12H2O（或Na2HPO4）2.9 g·L-1（或1.15 g·L-1）、KH2PO40.2 g·L-1、MgCl2·6H2O 0.1 g·L-1、CaCl2·6H2O 0.13 g·L-1、葡萄糖（Glucose）1 g·L-1、丙酮酸鈉（Na-Pyrurate）0.36 g·L-1、K-penicilin 0.075 g·L-1、BSA 3 g·L-1或1 g·L-1。

SOFaa培養(yǎng)液：KCl 0.534 g·L-1、NaCl 6.294 g·L-1、KH2PO40.162 g·L-1、NaHCO32.106 g·L-1、丙酮酸鈉0.033 g·L-1、L-谷氨酰胺（L-Glutamine）0.146 g·L-1、CaCl2·2H2O 0.251 g·L-1、MgCl2·6H2O 0.100 g·L-1、乳酸鈉（Sodium lactate）0.370 g·L-1（或282.4 μl·L-1）、青霉素（Penicillin）0.075 g·L-1、鏈霉素0.050 g·L-1、2%（V/V）必需氨基酸、1%（V/V）非必需氨基酸。

1.2 方法

1.2.1 綿羊卵巢的獲取

75%酒精消毒剪刀采集綿羊卵巢，10～35℃卵巢保存液存放，2～6 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

1.2.2 綿羊卵母細(xì)胞的采集

1.2.2.1 綿羊卵巢的處理

用滅菌生理鹽水將采集的綿羊卵巢洗滌4～6次，如卵巢上有多余的結(jié)締組織和脂肪，用經(jīng)75%酒精消毒的手術(shù)刀剪將其剪除。卵巢處理完畢后置于卵巢保存液中采集卵母細(xì)胞，整個(gè)操作過程，需在添加雙抗的PBI液中進(jìn)行。

1.2.2.2 綿羊卵母細(xì)胞的采集

采用下列3種方法進(jìn)行綿羊卵母細(xì)胞的采集：

I（抽吸法）：5 mL注射器抽吸綿羊卵巢表面可見卵泡，將抽吸所得卵泡液于體式顯微鏡下挑揀卵母細(xì)胞。獲取卵母細(xì)胞移入平衡3～5 h成熟液中洗滌，然后按標(biāo)準(zhǔn)劃分卵母細(xì)胞級(jí)別，統(tǒng)計(jì)卵母細(xì)胞數(shù)量。

П（抽吸結(jié)合切割法）：先后采用I（抽吸法）和Ш（切割法）處理綿羊卵巢，將經(jīng)過兩種方法處理獲得卵母細(xì)胞按標(biāo)準(zhǔn)劃分卵母細(xì)胞級(jí)別，統(tǒng)計(jì)卵母細(xì)胞數(shù)量。

Ш（切割法）：在Φ60 mm培養(yǎng)皿中放入采卵液（PBI），將采卵綿羊卵巢置于其中。操作時(shí)，一手將卵巢用組織鑷固定后，另一只手用刀片在卵巢表面輕輕劃割，多次劃割后，用采卵液反復(fù)沖洗劃割后的卵巢。操作完畢，取出處理的綿羊卵巢，在體視顯微鏡下配合劃線法（見圖1）挑揀卵母細(xì)胞，然后按照標(biāo)準(zhǔn)劃分卵母細(xì)胞級(jí)別，并統(tǒng)計(jì)不同級(jí)別卵母細(xì)胞數(shù)量。

劃線法配合不同采集方法采集綿羊卵母細(xì)胞，是經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)證實(shí)適合卵母細(xì)胞采集的一種便捷方法。操作時(shí)，用黑色標(biāo)記筆在Φ60 mm培養(yǎng)皿的皿蓋外部劃出“Z”字形線條，然后將培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)倒置作為卵母細(xì)胞采集容器。用不同方法對(duì)綿羊卵巢進(jìn)行處理后，將含有卵母細(xì)胞的皿蓋移到顯微鏡下進(jìn)行挑揀，此法不但大大提高卵母細(xì)胞的挑揀速度，而且最大程度減少了因操作失誤而造成的卵母細(xì)胞丟失，確保獲取卵母細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)的準(zhǔn)確性。

圖1 劃線法Fig.1 Lineation method

卵泡液體外放置一段時(shí)間常會(huì)形成膠凍樣物質(zhì)，嚴(yán)重影響卵母細(xì)胞的收集。因此，在采集卵母細(xì)胞的過程中，每次處理完1個(gè)卵巢后，立即進(jìn)行卵母細(xì)胞的挑揀。

1.2.3 綿羊卵母細(xì)胞的分級(jí)

通過不同方法獲取的綿羊卵丘—卵母細(xì)胞復(fù)合體（Cumulus-oocyte complex，COCs）用成熟液洗滌2～3次后，置于體式顯微鏡下進(jìn)行等級(jí)劃分和評(píng)定。所獲卵母細(xì)胞按照形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)可以劃分為3個(gè)等級(jí)（參見圖2）：

A級(jí)：卵母細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞胞質(zhì)均一，卵母細(xì)胞周圍至少被3層以上卵丘細(xì)胞完全包裹，卵丘細(xì)胞致密，不擴(kuò)散；

B級(jí)：卵母細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)良好，卵母細(xì)胞周圍被1～3層的卵丘細(xì)胞所包裹；

C級(jí)：卵母細(xì)胞周圍沒有卵丘細(xì)胞存在，變形卵和退化的卵母細(xì)胞，或者裸卵。

研究結(jié)果證實(shí)，在現(xiàn)有體外成熟培養(yǎng)體系條件下，C級(jí)卵母細(xì)胞無法體外培養(yǎng)成熟，因此只選擇A、B級(jí)卵母細(xì)胞用于體外成熟的培養(yǎng)。

圖2 卵母細(xì)胞的等級(jí)劃分Fig.2 Classification of sheep oocyte

1.2.4 綿羊卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)

1.2.4.1 綿羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的3種成熟液

采用如下3種成熟液對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)：

成熟液1：TCM199-HCO3+10%FBS+1 μg·mL-1雌二醇+2.2 g·mL-1NaHCO3+50 μg·mL-1慶大霉素+ 5 μg·mL-1FSH+0.38 mmol·L-1丙酮酸鈉+1 IU·mL-1LH+10 mmol·L-1Hepes。

成熟液2：TCM199-HCO3+10%FBS+l μg·mL-1雌二醇+2.2 g·mL-1NaHCO3+50 μg·mL-1慶大霉素+10 μg·mL-1FSH+0.38 mmol·L-1丙酮酸鈉+1 IU·mL-1LH+10 mmol·L-1Hepes。

成熟液3：TCM199-HCO3+10%FBS+10 μg·mL-1雌二醇+2.2 g·mL-1NaHCO3+50 μg·mL-1慶大霉素+ 5 μg·mL-1FSH+0.38 mmol·L-1丙酮酸鈉+1 IU·mL-1LH+10 mmol·L-1Hepes。

1.2.4.2 綿羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)用卵巢的保存

分別采用10～15℃、15～20℃和20～30℃卵巢保存液保存卵巢。

1.2.5 綿羊卵母細(xì)胞成熟的判定

綿羊卵母細(xì)胞成熟包括核成熟和同步的胞質(zhì)成熟，胞質(zhì)成熟難以界定。因此，常以卵母細(xì)胞形態(tài)變化進(jìn)行判別。成熟卵母細(xì)胞周圍卵丘細(xì)胞常發(fā)生放射狀排列的彌散形擴(kuò)散（見圖3）。未成熟卵母細(xì)胞，其卵丘細(xì)胞仍呈成熟前與卵母細(xì)胞結(jié)合緊密狀態(tài)（見圖4）。統(tǒng)計(jì)卵母細(xì)胞成熟率以第一極體排出（見圖5）為標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.6 成熟卵母細(xì)胞的孤雌激活

采用方法1（IA23187+6-DMAP）、方法2（Ionomycin+6-DMAP）和方法3（7%乙醇+6-DMAP）激活成熟卵母細(xì)胞。分別在5 μmol/IA23187、5 μmol·L-1離子霉素（Ionomycin）和7%乙醇的SOFaa中激活成

圖3 成熟卵母細(xì)胞Fig.3 Matured oocyte

圖4 未成熟卵母細(xì)胞Fig.4 Unmatured oocyte

圖5 第一極體排出Fig.5 Elimination of the first polar body

圖6 細(xì)胞Fig.6 Cell

2 結(jié)果與分析

2.1 不同獲卵方法獲卵效果比較

由表1可以看出，從處理卵巢所用時(shí)間看，當(dāng)采用I（抽吸法）、П（抽吸結(jié)合切割法）和Ш（切割法）3種不同的采卵方法時(shí)，采集1個(gè)卵巢的卵母細(xì)熟卵母細(xì)胞5 min，再分別用濃度2 mmol·L-16-DMAP的SOFaa培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h。然后用SOFaa洗滌卵母細(xì)胞3～4次，移入培養(yǎng)液SOFaa中，在5%CO2空氣、38.5℃，飽和濕度下培養(yǎng)48 h后，檢查卵母細(xì)胞的2細(xì)胞（見圖6）卵裂情況，孤雌胚率為2細(xì)胞胚胎占成熟卵母細(xì)胞數(shù)的比率。胞，抽吸法耗時(shí)為61.33 s。與其比較，當(dāng)采用抽吸結(jié)合切割法和切割法采集1個(gè)卵巢的卵母細(xì)胞時(shí)，耗時(shí)分別為136.07 s和131.60 s，抽吸法處理卵巢耗時(shí)顯著低于抽吸結(jié)合切割法和切割法（P＜0.05），而抽吸結(jié)合切割法和切割法間耗時(shí)差異不顯著。

表1 不同收集卵母細(xì)胞方法的比較Table 1 Comparison of different collecting oocytes method

從所獲各級(jí)卵母細(xì)胞數(shù)量看，采用抽吸法、抽吸結(jié)合切割法和切割法處理1個(gè)卵巢時(shí)，能夠分別獲得1.37、2.00和3.97個(gè)的A級(jí)卵母細(xì)胞。A級(jí)卵母細(xì)胞獲得數(shù)，切割法要顯著的高于抽吸法和抽吸結(jié)合切割法（P＜0.05），而抽吸法與抽吸結(jié)合切割法相比差異不顯著；抽吸法、抽吸結(jié)合切割法和切割法處理1個(gè)卵巢時(shí)，B級(jí)卵母細(xì)胞獲得數(shù)分別為0.87、3.63和4.03個(gè)。B級(jí)卵母細(xì)胞獲得數(shù)，抽吸法顯著低于抽吸結(jié)合切割法和切割法（P＜0.05），抽吸結(jié)合切割法與切割法相比差異不顯著（P＞0.05）；抽吸法、抽吸結(jié)合切割法和切割法處理1個(gè)卵巢時(shí)，C級(jí)卵母細(xì)胞的獲得數(shù)分別為0.33、2.37和2.40個(gè)。C級(jí)卵母細(xì)胞獲得數(shù)，抽吸法顯著低于抽吸結(jié)合切割法和切割法（P＜0.05），而抽吸結(jié)合切割法與切割法相比差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 不同成熟液成熟效果比較

由表2可知，綿羊卵母細(xì)胞在3種不同培養(yǎng)液中體外成熟培養(yǎng)24 h后，成熟液1、成熟液2和成熟液3的成熟率分別為83.4%、81.1%和82.6%。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，3種成熟液體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞的成熟率差異均不顯著（P＞0.05）。

表2 不同成熟液成熟效果比較Table 2 Influence of different maturation liquid on oocyte maturation

2.3 綿羊卵巢不同保存溫度成熟效果比較

由表3可知，綿羊離體卵巢在10～15℃、15～20℃和20～30℃條件下保存，卵母細(xì)胞的體外成熟率分別為82.5%、85.2%和82.9%。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，3種溫度條件下的成熟率差異均不顯著（P＞0.05）。

2.4 不同激活液激活效果比較

由表4可知，采用方法1（IA23187+6-DMAP）、方法2（Ionomycin+6-DMAP）和方法3（7%乙醇+ 6-DMAP）激活體外成熟卵母細(xì)胞，孤雌胚率分別是91.5%、89.5%和60.5%。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，方法1與方法2的孤雌胚率差異不顯著，但方法1和方法2的孤雌胚率極顯著地高于方法3（P＜0.01）。

表3 綿羊卵巢不同保存溫度成熟效果比較Table 3 Influence of different conserved temperature for sheep ovary on oocyte maturation

表4 不同激活液激活效果比較Table 4 Comparison of different parthenogenetic activation liquid in sheep oocytes

3 討論

3.1 不同獲卵方法獲卵效果比較

采用不同方法獲取足夠數(shù)量卵母細(xì)胞對(duì)于胚胎工程技術(shù)具有重要意義，卵母細(xì)胞作為重組胚胎核受體，是核移植等胚胎工程技術(shù)操作先決條件。綿羊離體卵巢卵母細(xì)胞獲取方法主要有抽吸法、剖切（切割）法以及兩種方法相結(jié)合方法[6-8]。

本試驗(yàn)中，切割法和抽吸法每處理1個(gè)卵巢耗用時(shí)間分別為：131和61 s。這與王建鋒[9]等報(bào)道的剖切（切割）法耗用時(shí)間要顯著長(zhǎng)于抽吸法的研究結(jié)果相一致。其主要原因是在試驗(yàn)操作過程中，抽吸只針對(duì)卵巢表面可見卵泡進(jìn)行操作，發(fā)育成熟突出于卵巢表面的可見卵泡數(shù)量有限，而切割法需對(duì)卵巢廣泛表面反復(fù)進(jìn)行操作，耗用時(shí)間較長(zhǎng)。

本試驗(yàn)中，剖切（切割）法和抽吸法處理1個(gè)卵巢時(shí)，分別能夠獲得8個(gè)和2個(gè)可用卵母細(xì)胞。這與汪立芹等切割法能夠采集2～3個(gè)可用卵母細(xì)胞研究[10]有顯著差異。綿羊發(fā)情具有季節(jié)性，綿羊卵巢在不同季節(jié)處于不同的生殖發(fā)育狀態(tài)，即使季節(jié)相同，卵泡發(fā)育進(jìn)展情況也會(huì)因個(gè)體情況不同而存在較大差異。卵母細(xì)胞采集時(shí)，操作者采集卵母細(xì)胞的技術(shù)熟練程度差異較大，都是造成不同研究者卵巢獲卵數(shù)量差異較大的原因。此外，本試驗(yàn)卵母細(xì)胞采集過程中配合劃線法進(jìn)行輔助，減少卵母細(xì)胞的遺漏，也是卵母細(xì)胞獲取數(shù)量較為理想的原因。

Sommersberg等研究結(jié)果證實(shí)，卵母細(xì)胞成熟須在包裹卵丘細(xì)胞作用下完成[11]。體外成熟培養(yǎng)時(shí)，裸卵失去周圍卵丘細(xì)胞包裹，無法成熟。要求卵母細(xì)胞進(jìn)行采集時(shí)，采集方法應(yīng)盡量避免對(duì)卵母細(xì)胞周圍包裹卵丘細(xì)胞破壞。抽吸法采集卵母細(xì)胞，能夠通過更換針頭大小方法降低對(duì)卵丘細(xì)胞破壞，但當(dāng)針頭型號(hào)較大時(shí)，抽吸時(shí)會(huì)在卵巢表面形成較大空洞，卵泡液中卵母細(xì)胞流失，減少獲取卵母細(xì)胞數(shù)量。

為提高卵巢的利用率，盡可能從單個(gè)卵巢獲取更多可用卵母細(xì)胞。本試驗(yàn)將切割與抽吸兩種方法結(jié)合處理卵巢。從試驗(yàn)結(jié)果看，切割與抽吸相結(jié)合方法在處理時(shí)間、獲得1～3層卵母細(xì)胞數(shù)與切割法相比差異均不顯著，但獲得3層以上卵母細(xì)胞數(shù)卻顯著低于切割法（P＜0.05）。這可能是在進(jìn)行抽吸操作時(shí)，針頭抽吸卵泡形成較大孔洞，有部分卵母細(xì)胞隨卵泡液流出而導(dǎo)致丟失。因此，在耗時(shí)基本相同時(shí)，抽吸結(jié)合切割的方法不能顯著提高從卵巢上獲取卵母細(xì)胞數(shù)量。

3.2 不同成熟液成熟效果比較

哺乳動(dòng)物體內(nèi)激素作用機(jī)制尚不完全清楚，激素在生物體內(nèi)通過復(fù)雜機(jī)制對(duì)生殖細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育和凋亡起重要調(diào)控作用。進(jìn)行卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)時(shí)，在TCM199培養(yǎng)液基礎(chǔ)上額外添加激素[12]、各種離子[13]、細(xì)胞因子以及血清，是當(dāng)前研究卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)體系時(shí)普遍采用的方法。檀利長(zhǎng)等曾對(duì)比卵泡液在體外成熟培養(yǎng)時(shí)對(duì)卵母細(xì)胞成熟的促進(jìn)作用，并取得較為理想的效果[14]。為了獲得較高的成熟率，激素成為當(dāng)前而各種體外成熟培養(yǎng)體系中必不可少的添加物。

本試驗(yàn)比較5 μg·mL-1FSH與l μg·mL-1雌二醇，10 μg·mL-1FSH與l μg·mL-1雌二醇，5 μg·mL-1FSH與10 μg·mL-1雌二醇3種組合不同激素濃度條件下，體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞成熟情況。試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，成熟液1可獲得最高為83.4%成熟率，成熟液2成熟率最低為81.1%，成熟液3成熟率則為82.6%。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，3種成熟液體外成熟率差異均不顯著。本試驗(yàn)中，3種成熟液的卵母細(xì)胞體外成熟率都在81%以上，這與與楊志杰等報(bào)道[15]基本一致。

促卵泡素（Follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）是生物體內(nèi)的糖蛋白激素，對(duì)卵母細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育和成熟都具有促進(jìn)作用，能促進(jìn)卵泡顆粒細(xì)胞增生，促進(jìn)卵巢上卵泡生長(zhǎng)以及雌激素合成和分泌，及刺激卵泡細(xì)胞產(chǎn)生LH受體作用。FSH能夠誘導(dǎo)卵丘細(xì)胞擴(kuò)散，使生發(fā)泡破裂出現(xiàn)暫時(shí)性的抑制，使第一次成熟分裂時(shí)間發(fā)生改變，達(dá)到促進(jìn)胞質(zhì)成熟效果。目前，F(xiàn)SH在卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)中的作用機(jī)制，尚未達(dá)成共識(shí)。雌二醇是動(dòng)物體內(nèi)由雄激素轉(zhuǎn)化而來一類性腺類固醇激素，在生物體生殖過程中具有廣泛調(diào)節(jié)作用。卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)時(shí)，將FSH與LH協(xié)同添加，顯著提高卵母細(xì)胞的體外成熟率[16]。因此，當(dāng)前研究動(dòng)物卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)效果時(shí)，成熟液中多是不同種類的激素協(xié)同添加。

本試驗(yàn)證實(shí)，體外培養(yǎng)綿羊卵母細(xì)胞，培養(yǎng)液中5 μg·mL-1FSH與l μg·mL-1雌二醇濃度，能滿足一定數(shù)量卵母細(xì)胞的成熟需要，獲得較高的成熟率。但綿羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)時(shí)，F(xiàn)SH、LH和雌二醇等激素所需精確濃度仍待進(jìn)一步研究確定。

3.3 卵巢保存溫度對(duì)卵母細(xì)胞成熟效果的影響

活體動(dòng)物卵巢處于機(jī)體恒定內(nèi)環(huán)境中，不受外界因素影響。為保證卵巢上卵母細(xì)胞活性和發(fā)育能力，從離體卵巢獲取卵母細(xì)胞需對(duì)卵巢進(jìn)行保溫，使保存溫度盡量維持恒定。

Ravindranatha認(rèn)為低溫打擊能夠引起卵母細(xì)胞冷休克，并顯著降低卵母細(xì)胞發(fā)育能力[17]。潘曉燕等報(bào)道將豬卵巢保存在35℃，其卵泡液pH會(huì)隨保存時(shí)間延長(zhǎng)不斷降低，過酸環(huán)境和代謝廢物增加卵母細(xì)胞核DNA碎片化比率，降低卵母細(xì)胞的成熟能力[18]。本試驗(yàn)對(duì)比10～15℃、15～20℃和20～30℃保存綿羊離體卵巢，其卵母細(xì)胞的體外成熟率分別為82.5%、85.2%和82.9%。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，3種溫度條件下的成熟率差異均不顯著（P＞0.05）。試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，卵巢保存溫度從10℃到30℃，卵母細(xì)胞成熟率不受明顯影響，隨著溫度的升高和降低，卵母細(xì)胞成熟率未發(fā)現(xiàn)規(guī)律性變化。動(dòng)物離體卵巢保存在適宜溫度下是卵母細(xì)胞體外成熟的重要條件，但卵巢保存的極限高、低溫，及其對(duì)卵母細(xì)胞成熟的影響仍待深入研究。

3.4 體外成熟卵母細(xì)胞的孤雌激活

正常情況下，卵母細(xì)胞由動(dòng)物卵巢上排出時(shí)處于細(xì)胞周期的第二次減數(shù)分裂中期。從離體卵巢獲取的卵母細(xì)胞，只有借助外源物理或化學(xué)刺激恢復(fù)減數(shù)分裂，排出第二極體，才能繼續(xù)其細(xì)胞周期，完成發(fā)育過程。

乙醇早就被發(fā)現(xiàn)對(duì)卵母細(xì)胞具有激活作用，乙醇激活主要是通過水解細(xì)胞膜上4，5—二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）產(chǎn)生1，4，5—三磷酸肌醇（IP3），誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)源鈣向胞質(zhì)中釋放，引起胞質(zhì)鈣離子濃度升高，激活卵母細(xì)胞[19]。本試驗(yàn)利用7%乙醇對(duì)綿羊卵母細(xì)胞進(jìn)行孤雌激活，僅獲60.5%孤雌胚率，低于張?jiān)粕?5.5%孤雌胚率[20]。本試驗(yàn)7%乙醇是由卵母細(xì)胞成熟液配制而成，而張?jiān)粕?%乙醇為SOFaa配制而成[20]，卵母細(xì)胞成熟液與培養(yǎng)用SOFaa成分差別較大，是否由此引起兩者孤雌胚率差異懸殊有待研究證實(shí)。

A23187和離子霉素都是鈣離子載體，A23187是增加Ca2+跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高激活卵母細(xì)胞；離子霉素是通過動(dòng)員細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放，依次觸發(fā)Ca2+內(nèi)流而引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高，激活卵母細(xì)胞。A23187和離子霉素激活卵母細(xì)胞的效率均高于乙醇，單獨(dú)使用A23187和離子霉素激活時(shí)，卵母細(xì)胞無原核生成，因此A23187和離子霉素常與CHX或6-DMAP聯(lián)合使用，才能獲得理想的激活效果[21]。本試驗(yàn)利用A23187激活綿羊卵母細(xì)胞，獲得91.5%孤雌胚率，雖與離子霉素89.5%孤雌胚率相比差異不顯著，但極顯著高于7%乙醇的方法（P＜0.01）。比張紅琴[22]、潘曉燕[23]等報(bào)道80%孤雌胚率高很多。這是因?yàn)楸驹囼?yàn)所有激活卵母細(xì)胞都經(jīng)過嚴(yán)格形態(tài)學(xué)篩選，剔除形態(tài)較差的卵母細(xì)胞。成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行孤雌激活時(shí)，不但應(yīng)注意激活方法選擇，更應(yīng)重視激活卵母細(xì)胞篩選。

4 結(jié)論

采用切割、抽吸及切割結(jié)合抽吸3種方法從綿羊卵巢獲取卵母細(xì)胞時(shí)，切割方法獲卵效果最好，可以從1個(gè)綿羊離體卵巢上獲取8個(gè)可用卵母細(xì)胞；成熟液：TCM199-HCO3+10%FBS+l μg·mL-1雌二醇+2.2 g·mL-1NaHCO3+50 μg·mL-1慶大霉素+ 5 μg·mL-1FSH+0.38 mmol·L-1丙酮酸鈉+1 IU·mL-1LH+10 mmol·L-1Hepes，體外成熟培養(yǎng)卵母細(xì)胞可獲83.4%效果最好的卵母細(xì)胞成熟率；10～30℃卵巢保存溫度對(duì)其卵母細(xì)胞的體外成熟沒有顯著影響；A23187聯(lián)合6-DMAP可使成熟卵母細(xì)胞獲得91.5%的孤雌胚率，證實(shí)其具有較好的胚胎發(fā)育能力。

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Comparsion of different collecting oocytes method andin vitromatura- tion on sheep

NING Fangyong,BAI Xiujuan(School of of Animal Science and Technology, Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

The paper collected oocytes from the sheep ovary by using 3 methods:the syrine aspiration,slicing and syrine aspiration combining with slicing,and then compared the oocytes number and time consuming to acquire A,B and C standard sheep oocytes.The results showed that the time consuming are 136.07 s and 131.60 s by syrine aspiration combining with slicing and slicing method, respectively.both of them are significantly higher than the time consuming by syrine aspiration,which time is 61.33 s(P＜0.05);slicing is the best way to collect 8 available oocytes(including A and B sheep oocytes).compared the 3 kinds medium with different hormone dose,all the maturation rate is higher above 81%,however,the difference is not significant,the maturation medium:TCM199-HCO3+10% FBS+lμg·mL-1E2+2.2 g·mL-1NaHCO3+50μg·mL-1Gentamycin+5μg·mL-1FSH+0.38 mmol·L-1Na-Pyruvate 1 IU·mL-1LH+10 mmol·L-1Hepes can be obtained the highest oocytes maturation rate 83.4%;83.4%;the sheep oocytes conserve in 10-15℃,15-20℃and 20-30℃,all the oocytes maturation rate is 82%above,the difference is not significant;IA23187 and 6-DMAP be used for parthenogenetic activation,parthenogenetic activation embryo rate is the highest 91.5%.

sheep oocyte;collecting oocytes method;in vitromaturation;comparsion

S826

A

1005-9369（2014）08-0065-07

2012-03-28

國家自然科學(xué)基金（30771538，31000990）

寧方勇（1977-），男，講師，博士，研究方向?yàn)樘胤N經(jīng)濟(jì)動(dòng)物。E-mail:654293748@qq.com

*通訊作者：白秀娟，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樘胤N經(jīng)濟(jì)動(dòng)物。E-mail:bxj630306@163.com

時(shí)間2014-7-26 14:35:46[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140726.1435.004.html

寧方勇,白秀娟.綿羊卵巢不同獲卵方法及體外成熟效果比較[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45(8):65-71.

Ning Fangyong,Bai xiujuan.Comparsion of different collecting oocytes method andin vitromaturation on sheep[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(8):65-71.(in Chinese with English abstract)