王瑩瑩 劉玉 姬妍茹 張正海 周廣麒 劉宇峰

（1.大連工業(yè)大學生物工程學院，大連 116034；2.黑龍江省科學院大慶分院，大慶 163319）

二酰甘油?；D移酶（DGAT）是催化三酰甘油（TAG）合成最后一步的反應酶，也是其合成過程中唯一的限速酶［1］，對油脂合成代謝起到正調控作用［2］，具有促進TAG 積累的作用［3］。DGAT 廣泛存在于動物、植物及微生物中，迄今為止發(fā)現該酶 存 在4 種 類 型：DGAT1、DGAT2、WS/DGAT 和CytoDGAT［4］。近年來研究表明，大量表達編碼該酶的基因可以明顯提高油脂含量，如Jako 等［5］發(fā)現在過量表達AtDGAT1 基因的野生型擬南芥中油脂積累量增加，Zheng 等［6］發(fā)現過量表達DGAT1 基因玉米可以明顯提高玉米種子含油量、胚含油量和油酸含量。紫蘇［Perilla frutescens（L.）Britt］為唇形科紫蘇屬一年生草本植物，藥食兩用，其油脂含量高達35%-64%［7］，并且主要以TAG 形式存在［8］，另外在NCBI 網站中也公布了紫蘇基因組中DGAT1基因cDNA 的相關信息，所以利用RT-PCR 方法克隆紫蘇DGAT1 基因是完全可行的。

四尾柵藻（Scenedesmus quadricanda）屬于綠藻門柵藻科，細胞呈紡錘形或長筒形，藻體一般為2、4 或8 個細胞組成的單列群體，繁殖迅速，適應性強，是國內外廣泛分布的一種淡水藻類［9］。據已有報道四尾柵藻的含油量不高［10］，因此很少選擇其作為制備生物柴油的原料，但由于其具有環(huán)境適應能力強和生長速度迅速等優(yōu)點，如果能將其進行品種改良提高含油量，就可以將改良后的四尾柵藻作為原料制備生物柴油，并有望解決微藻生物柴油產業(yè)化進程中的瓶頸問題。近年來，國內外學者利用基因工程技術在分子水平上對微藻進行品種改良均得到了較好的效果，Manuell 等［11］將牛乳腺免疫血清蛋白的編碼區(qū)（M-SAA）與衣藻葉綠體psbA 基因編碼區(qū)直接替換實現了重組蛋白的表達，所得蛋白總量達5%以上。郭鎖蓮等［12］利用電擊法將酵母絮凝基因FI07 導入天然非絮凝斜生柵藻中，獲得了具有絮凝性狀的轉基因藻細胞。Pasquale 等［13］以帶有CaMV35S 啟動子的pGEM 7zF 為載體將編碼真菌漆酶的poxA1b 基因成功導入到衣藻、針形纖維藻和小球藻中，與野生型相比其異源漆酶的酶活性顯著增加。王長海等［14］以pBI121 質粒為載體成功將外源植酸酶基因導入到海水小球藻中，轉化后微藻的植酸酶活性比未轉化對照樣品平均值高4 倍。在國內外研究中，關于紫蘇DGAT1 基因克隆及利用植物表達載體pBI121 構建四尾柵藻表達載體的研究還未見報道。本研究將紫蘇DGAT1 基因cDNA 片段與植物表達載體pBI121 質粒進行重新拼接，在四尾柵藻中表達DGAT1 基因以改善四尾柵藻油脂含量低的缺點，旨在為利用基因工程方法改良四尾柵藻品種奠定堅實基礎，對實現生物柴油產業(yè)化開發(fā)提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 紫蘇種子由黑龍江省科學院大慶分院林甸基地提供。

1.1.2 菌株和質粒 Escherichia coli DH5α，菌種編號81023-1 購自寶生物工程（大連）有限公司；植物表達載體pBI121 購自上海希匹吉生物技術有限公司；四尾柵藻（Scenedesmus quadricanda），藻種編號FACHB-1476 購自中科院水生生物研究所淡水藻種庫。

1.1.3 引物的設計和合成 根據NCBI 網站中紫蘇DGAT1 基因的cDNA 序列（GenBank 登錄號：AF2-98815.1）利用軟件DNAMAN 設計PCR 引物，并在引物兩端分別加入Xba I 和BamH I 限制性酶切位點，由中美泰和生物技術（北京）有限公司合成。引物序列如下：DGAT1-F：5'-GCATCTAGAATGGCGATCTTGGACTC-3'；DGAT1-R：5'-CGGATCCCTACCTTGCACTAGCTTTTC-3'。

1.1.4 主要試劑 Taq 聚合酶，Wide Range DNA Marker，購自中美泰和生物技術（北京）有限公司；Trizol，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，SanPrep 柱式質粒小量提取試劑盒，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；RNAiso Plus，T4 DNA連接酶，SanPrep 柱式DNA 膠回收試劑盒，TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.3.0，pMD19-T Vector Cloning Kit，限制性內切酶Xba I 和BamH I，DNAiso Reagent，瓊脂糖購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 紫蘇總RNA 的提取方法 用75%乙醇浸泡10 min，再用0.1% DEPC 處理水清洗3 次，最后用無菌濾紙吸干殘余水分，稱取經過預處理的紫蘇種子100 mg 放入已滅菌研缽中，同時加入液氮充分研磨，再加入6 mL RNAiso Plus 提取液按照試劑盒說明書所述步驟提取紫蘇總RNA，利用紫外分光光度計測取OD260/OD280比值和1.2%（W/V）瓊脂糖凝膠電泳檢測提取RNA 的純度及完整性。

1.2.2 紫蘇DGAT1 基因克隆及克隆載體pMDDGAT1 的構建 以紫蘇種子提取的RNA 為對象，按RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒所述步驟合成cDNA 第一鏈，再以此cDNA 為模板，以DGAT1-F 和DGAT1-R 為引物對紫蘇DGAT1基因進行PCR 擴增，條件為：94℃ 5 min；94℃ 45 s，54℃ 45 s，72℃ 75 s，35 個循環(huán)；72℃ 10 min；4℃終止。將PCR 產物用1.0%（W/V）瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，對PCR 產物切膠回收，得到目的基因DGAT1。將DGAT1 基因連接到pMD19-T 載體，轉化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，涂布于LB/Amp/XGal/IPTG 平板培養(yǎng)基進行藍白斑篩選，挑取白色菌落，通過菌落PCR 鑒定。最后，將鑒定的陽性克隆送中美泰和生物技術（北京）有限公司測序，將測序結果進行Blast 比對分析。

1.2.3 表達載體pBI121-DGAT1 的構建 將克隆載體pMD-DGAT1 和pBI121 空載體分別用Xba I和BamH I 進行雙酶切，反應條件如下：克隆載體pMD-DGAT1 或pBI121 空載體30 μL，限制酶Xba I 和BamH I 各1 μL，10×共用酶切緩沖液10 μL，加無菌水補足至50 μL，37℃水浴鍋中酶切2 h。再將雙酶切后的產物用1.0%（W/V）瓊脂糖凝膠電泳進行分離和檢測，切割目的基因DGAT1 片段和開環(huán)的載體片段所在凝膠，并按照DNA 膠回收試劑盒所述步驟分別回收后進行連接。反應條件如下：目的基因DGAT1 片段5 μL，開環(huán)的載體片段3 μL，buffer 1 μL，T4 DNA 連接酶1 μL，16℃連接過夜。將連接后產物轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，涂布于含卡那霉素抗性的LB 固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12 h 后挑取單菌落于LB 液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)。最后將所得轉化菌體按照SanPrep 柱式質粒小量提取試劑盒所述步驟提取重組載體pBI121-DGAT1 并用Xba I 和BamH I 進行雙酶切驗證。

1.2.4 表達載體pBI121-DGAT1 轉化四尾柵藻情況的檢測 利用電轉化方法［15］將構建好的表達載體pBI121-DGAT1 導入四尾柵藻中，涂布于含卡那霉素抗性的BG11 固體培養(yǎng)基并放置于人工氣候箱中觀察其生長情況。如有四尾柵藻藻落生長，分別挑取數個單藻落接種至BG11 液體培養(yǎng)基中光照搖床培養(yǎng)，編號備用。收集轉化后的四尾柵藻藻體，按照DNAiso Reagent 說明書所述步驟提取基因組DNA，再以其為模板，以DGAT1-F 和DGAT1-R 為引物，按1.2.2 所述的擴增條件進行PCR 驗證。以未轉化的四尾柵藻作對照，將四尾柵藻藻體冷凍干燥，準確稱取10 g 干藻粉利用索氏抽提法［16］進行油脂提取。通過比較轉化后和未轉化的四尾柵藻油脂含量，確定目的基因是否表達，以驗證四尾柵藻表達載體pBI121-DGAT1 的構建是否具有應用價值。

2 結果

2.1 紫蘇總RNA的提取

從紫蘇種子中提取總RNA 經紫外分光光度計檢測OD260/OD280比值在1.8-2.0 之間，表明總RNA 幾乎無降解。凝膠電泳檢測結果（圖1）顯示，28S、18S rRNA 條帶清晰明亮，濃度比約為2∶1，同時5S rRNA 條帶較微弱，表明提取的紫蘇總RNA 質量和純度均符合下一步逆轉錄的試驗要求。

圖1 紫蘇總RNA 電泳檢測

2.2 紫蘇DGAT1基因克隆及載體pMD-DGAT1構建

以紫蘇RNA 反轉錄的cDNA 為模板，PCR 擴增結果（圖2-A）顯示，產物長度約為1 600 bp，與預期大小一致?；厥占兓撈?，構建克隆載體pMDDGAT1，菌落PCR 結果（圖2-B）顯示，擴增產物長度約為1 600 bp，測序顯示此片段長度為1 657 bp。通過Blast 比對結果顯示此片段與GenBank 中紫蘇DGAT1 基因序列的最大同源性為97%，說明克隆得到紫蘇DGAT1 基因完整的編碼區(qū)序列，表明紫蘇DGAT1 基因克隆及載體pMD-DGAT1 構建成功。

圖2 RT-PCR（A）及菌落PCR（B）擴增產物電泳檢測

2.3 表達載體pBI121-DGAT1的構建

對克隆載體pMD-DGAT1 和pBI121 空載體進行Xba I 和BamH I 雙酶切，分別回收長度約為1 600 bp 和14 700 bp 的DGAT1 基因和pBI121 空載體片段，連接后所得產物轉化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞，從轉化菌落中提取得到重組載體，命名為pBI121-DGAT1。將重組載體進行Xba I 和BamH I 雙酶切驗證。結果（圖3）顯示，經雙酶切得到兩條片段長度分別為1 657 bp 和14 729 bp，與連接前長度一致，表明表達載體pBI121-DGAT1 構建成功。

圖3 重組載體pBI121-DGAT1 雙酶切驗證

2.4 表達載體pBI121-DGAT1轉化四尾柵藻的檢測

利用電轉化方法將表達載體pBI121-DGAT1 導入四尾柵藻中，涂布于含有卡那霉素抗性的BG11固體培養(yǎng)基中可觀察到有四尾柵藻生長，而未轉化的四尾柵藻涂布于含有卡那霉素抗性的BG11 固體培養(yǎng)基中未見生長。以轉化后的四尾柵藻基因組DNA 為模板進行PCR 驗證，結果（圖4）顯示，4個轉化后的四尾柵藻樣品均擴增出大小為1 657 bp的片段，與基因DGAT1 長度一致，表明載體pBI121-DGAT1 已成功轉化四尾柵藻。另外，利用索氏抽提法分別測定未轉化和轉化后四尾柵藻的油脂含量，結果（圖5）顯示，未轉化和轉化后四尾柵藻的油脂含量達細胞干重的6.3%和11.8%，轉化后四尾柵藻的油脂含量較轉化前提高近1 倍，說明DGAT1 基因已經在四尾柵藻中成功表達。

3 討論

圖4 表達載體pBI121-DGAT1 轉化四尾柵藻PCR 驗證

圖5 未轉化和轉化后的四尾柵藻油脂含量對比圖

近年來，生物柴油作為一種新型環(huán)?？稍偕茉闯蔀榱藝鴥韧鈴V泛研究的熱點問題。目前制備生物柴油的主要原料是油料作物，但由于其具有生長周期長、產量低和占用耕地等缺點制約了生物柴油的進一步發(fā)展。微藻因其具有生長周期短、產量高、不占用耕地等優(yōu)點而被認為是一種高潛力的生物柴油新型原料［17］，但微藻油脂存在單位光照面積產量低和生產成本高等問題，因此如何能有效地提高微藻體內油脂含量成為新一輪的研究熱點。微藻油脂合成代謝途徑是一個復雜的生理生化過程，涉及到多種酶的協同作用和質體、內質網及細胞質等亞細胞結構的參與，同時與糖類和蛋白質代謝也有著密切的關系［18］，所以微藻產油量的提高可以從生化途徑和基因工程途徑兩方面入手。生化途徑是一種通過控制營養(yǎng)或培養(yǎng)條件將光合作用產生的代謝流更多地導向脂類的生物合成途徑，但由于營養(yǎng)物限制或生理逆境作用而抑制細胞分裂導致生物量下降，因此利用其提高微藻產油量存在很大的局限性。基因工程途徑是指在體外將外源基因插入病毒、質粒等載體中構建重組DNA 分子，然后將重組DNA 分子導入受體細胞內，使外源基因在受體細胞內進行復制、轉錄和翻譯的分子操作途徑，與生化途徑相比利用基因工程途徑可以從根本上提高微藻的產油量。因此本研究以紫蘇RNA 為模板反轉錄克隆得到DGAT1 基因，并將其與植物表達載體pBI121 進行重組構建成以CaMV35S 啟動子驅動的四尾柵藻表達載體，最后利用電轉化方法獲得了轉基因四尾柵藻。植物表達載體pBI121 本身就帶有強大的CaMV35S啟動子和卡那霉素抗性基因，實現了基因的表達以及轉化子的有效篩選。篩選后獲得的四尾柵藻油脂含量與未轉化的野生型相比提高了近1 倍，說明DGAT1 基因通過基因工程途徑提高四尾柵藻產油量達到了一定的效果，但是轉化后的四尾柵藻油脂含量為11.8%，與油脂含量較高的微藻（如硅藻［19］）相比差距還是很大，所以在今后的研究中可嘗試將多個DGAT1 基因并列連接到一個表達載體中，構建DGAT1 超表達載體，以期實現轉基因四尾柵藻產油量的大幅度提高。本研究成功構建DGAT1 四尾柵藻表達載體，并達到了提高四尾柵藻油脂含量的應用效果，為開發(fā)高產油微藻新品種提供新方向，也為實現微藻生物柴油產業(yè)化生產提供充分的理論依據。

4 結論

以紫蘇總RNA 為模板，采用RT-PCR 方法擴增出DGAT1 基因的cDNA 編碼區(qū)序列并構建克隆載體pMD-DGAT1，經測定克隆所得DGAT1 基因片段長度為1 657 bp，與GenBank 中紫蘇DGAT1 基因序列的最大同源性為97%。Xba I/BamH I 雙酶切克隆載體pMD-DGAT1 和pBI121 空載體，連接目的片段成功構建四尾柵藻表達載體pBI121-DGAT1，電轉化后四尾柵藻的油脂含量較轉化前提高近1 倍。

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