周 佳，孫 勇，唐傳球，饒貞學(xué)，甘 露

（鄖陽(yáng)師范高等?？茖W(xué)校生物化學(xué)與環(huán)境工程系，湖北 十堰442000）

尿素是一種無色或白色的棒狀結(jié)晶體，有刺激性氣味，廣泛應(yīng)用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。目前國(guó)內(nèi)外有多種測(cè)定尿素濃度的方法，使用最多的有分光光度法［1－2］、紅外光譜法［3］和尿素酶法［4］，其中分光光度法又具有簡(jiǎn)便、快捷的特點(diǎn)，包括硫胺脲二乙酰一肟顯色測(cè)定法［5－6］和對(duì)二甲氨基苯甲醛（PDAB）顯色測(cè)定法［7］，但前者顯色產(chǎn)物不穩(wěn)定、操作復(fù)雜，而對(duì)二甲氨基苯甲醛顯色測(cè)定法操作簡(jiǎn)捷、準(zhǔn)確度較高，國(guó)內(nèi)對(duì)其報(bào)道［8－10］較多，但大多只對(duì)影響尿素濃度測(cè)定的單因素進(jìn)行研究，對(duì)于各因素之間的相互影響未作探討。

作者以對(duì)二甲氨基苯甲醛與尿素反應(yīng)生成顯色物，利用分光光度計(jì)在不同的波長(zhǎng)下對(duì)該顯色物進(jìn)行測(cè)定確定最佳波長(zhǎng)，然后通過單因素實(shí)驗(yàn)確定影響測(cè)定的主要因素，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化尿素濃度的測(cè)定條件，并繪制測(cè)定溶液中尿素濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑和儀器

尿素、濃硫酸、無水乙醇、對(duì)二甲氨基苯甲醛，均為分析純。

721型可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；1cm玻璃比色皿；BS225S型電子天平，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；HWS－28型恒溫水浴箱，上海齊新科學(xué)儀器有限公司。

1.2 溶液的配制

（1）尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取0.5000g尿素，用少量蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)移至100mL的容量瓶中定容，即得濃度為5.00g·L－1的尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別量取該標(biāo)準(zhǔn)溶液2mL、4mL、6mL、8mL、10mL、12mL、14mL、16mL，依次加入到100mL的容量瓶中定容，得到濃度（mg·L－1）分別為100、200、300、400、500、600、700、800的系列尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液。

（2）對(duì)二甲氨基苯甲醛溶液：稱取2.5000g對(duì)二甲氨基苯甲醛，溶解于500mL無水乙醇中。

1.3 反應(yīng)機(jī)理

對(duì)二甲氨基苯甲醛與尿素在濃硫酸作催化劑和無水乙醇作溶劑條件下，反應(yīng)生成黃棕色的有機(jī)化合物。其反應(yīng)方程式如下：

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 最佳波長(zhǎng)的確定

稱取2.0000g對(duì)二甲氨基苯甲醛固體溶解于48 mL無水乙醇中，加入2mL濃硫酸，置于棕色瓶中備用。量取10mL蒸餾水、10mL 100mg·L－1尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液和10mL 200mg·L－1尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次加入3支圓底試管中，分別向試管中加入1mL配制好的對(duì)二甲氨基苯甲醛溶液，搖勻后靜置10min，以空白試液調(diào)零，置于1cm的比色皿中，對(duì)兩組尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液在412～460nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。

1.4.2 單因素實(shí)驗(yàn)

取2支圓底試管，一支試管中的液體作為參比溶液，依次加入0.6mL濃硫酸、10mL對(duì)二甲氨基苯甲醛溶液和10mL蒸餾水；另一支試管中的液體作為測(cè)試溶液，依次加入0.6mL濃硫酸、10mL對(duì)二甲氨基苯甲醛溶液和10mL 200mg·L－1的尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液。一定溫度下反應(yīng)一定時(shí)間，測(cè)定所測(cè)試溶液的吸光度（基于參比溶液）。

1.4.3 正交實(shí)驗(yàn)

波長(zhǎng)為426nm時(shí)，以反應(yīng)得到的黃棕色溶液對(duì)應(yīng)的吸光度為考核指標(biāo)，以200mg·L－1尿素溶液用量、對(duì)二甲氨基苯甲醛用量、反應(yīng)溫度和濃硫酸用量為考察因素，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，設(shè)計(jì)L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)的因素和水平見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將配制好的100mg·L－1、200mg·L－1、300mg·L－1、400mg·L－1、500mg·L－1、600mg·L－1、700mg·L－1、800mg·L－1的尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液在426 nm處按正交實(shí)驗(yàn)選出的最優(yōu)條件進(jìn)行測(cè)定，確定尿素濃度與吸光度之間的線性關(guān)系。

2 結(jié)果與討論

2.1 最佳波長(zhǎng)的選擇

測(cè)得100mg·L－1、200mg·L－1尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度與吸收波長(zhǎng)的關(guān)系曲線見圖1。

由圖1可以看出，尿素溶液與對(duì)二甲氨基苯甲醛反應(yīng)得到的產(chǎn)物在426nm處有最大吸收峰。因此，選擇426nm作為測(cè)定尿素濃度的最佳波長(zhǎng)。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 反應(yīng)時(shí)間的影響

圖1 尿素溶液吸光度與吸收波長(zhǎng)關(guān)系曲線Fig.1 The relationship curves of absorbance and absorption wavelength for urea solutions

固定其它條件不變，常溫下反應(yīng)3min、6min、8min、10min、15min后進(jìn)行測(cè)定，對(duì)應(yīng)溶液的吸光度分別為0.1195、0.1196、0.1197、0.1198、0.1198。表明，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過8min時(shí)，顯色反應(yīng)基本完成。這與文獻(xiàn)［1，9］所得結(jié)論基本一致。

2.2.2 對(duì)二甲氨基苯甲醛用量的影響

固定其它條件不變，改變對(duì)二甲氨基苯甲醛的用量（3mL、6mL、10mL、14mL、18mL），常溫下反應(yīng)10min后進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖2。

圖2 對(duì)二甲氨基苯甲醛用量對(duì)吸光度的影響Fig.2 Effect of PDAB amount on absorbance

由圖2可知，當(dāng)對(duì)二甲氨基苯甲醛用量為10mL時(shí)，吸光度最大。

2.2.3 濃硫酸用量和尿素用量的影響

固定其它條件不變，于40℃水浴中反應(yīng)10min后進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得濃硫酸用量為0.4mL、0.6mL、1.0mL、1.2mL時(shí)對(duì)應(yīng)溶液的吸光度分別為0.1153、0.1261、0.0842、0.0736，表明，隨著濃硫酸用量的增加，吸光度先升后降，濃硫酸用量為0.6mL時(shí)吸光度最大；測(cè)得200mg·L－1尿素用量為5mL、10mL、15mL、20mL時(shí)對(duì)應(yīng)溶液的吸光度分別為0.0973、0.1242、0.1049、0.1076，表明，隨著尿素用量的增加，吸光度先升后降，200mg·L－1尿素用量為10mL時(shí)吸光度最大。

2.2.4 反應(yīng)溫度的影響

固定其它條件不變，在溫度為25℃、30℃、40℃、50℃的水浴中反應(yīng)10min后進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖3。

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)吸光度的影響Fig.3 Effect of reaction temperature on absorbance

由圖3可知，反應(yīng)溫度為30℃時(shí)，對(duì)應(yīng)溶液的吸光度最大。

2.3 測(cè)定條件的優(yōu)化

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，反應(yīng)時(shí)間對(duì)測(cè)定影響較小，其它因素影響較大。據(jù)此進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)（表1），結(jié)果見表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析Tab.2 Result and analysis orthogonal experiment

由表2可以看出，各因素對(duì)吸光度的影響大小為：對(duì)二甲氨基苯甲醛用量＞濃硫酸用量＞反應(yīng)溫度＞尿素用量。測(cè)定尿素濃度的最優(yōu)組合為A3B2C1D1，即200mg·L－1尿素溶液用量為14mL、對(duì)二甲氨基苯甲醛用量為10mL、反應(yīng)溫度為30℃、濃硫酸用量為0.4mL。

2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取200mg·L－1尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液，在兩臺(tái)分光光度計(jì)上按確定的最佳測(cè)定條件進(jìn)行測(cè)定，每臺(tái)分光光度計(jì)做4個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表3。

表3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的測(cè)定結(jié)果Tab.3 Determination results of repetitive experiment

由表3可以看出，測(cè)定結(jié)果與正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本吻合，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.29%和0.78%，說明本方法有較好的重復(fù)性。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

繪制尿素濃度（c）與對(duì)應(yīng)生成物的吸光度（A）的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖4所示。

圖4 尿素濃度與吸光度關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of relationship between urea concentration and absorbance

由圖4可以看出，以426nm作為測(cè)定波長(zhǎng)，尿素在100～800mg·L－1濃度范圍內(nèi)符合朗伯－比爾定律，計(jì)算得到尿素濃度與對(duì)應(yīng)生成物的吸光度的線性回歸方程：A＝0.0006c＋0.0168，相關(guān)系數(shù)R＝0.9996，表明尿素濃度與吸光度具有良好的線性關(guān)系。

3 結(jié)論

運(yùn)用對(duì)二甲氨基苯甲醛比色法測(cè)定溶液中尿素的濃度。通過單因素實(shí)驗(yàn)確定了主要的影響因素，并通過正交實(shí)驗(yàn)對(duì)尿素測(cè)定條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：測(cè)定尿素的最佳波長(zhǎng)為426nm；在該波長(zhǎng)下，最優(yōu)測(cè)定條件為：200mg·L－1尿素溶液用量14mL、對(duì)二甲氨基苯甲醛用量10mL、反應(yīng)溫度30℃、濃硫酸用量0.4mL。尿素濃度在100～800mg·L－1范圍內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為A＝0.0006c＋0.0168，相關(guān)系數(shù)R＝0.9996。該方法操作方便、快速、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，能夠用于溶液中尿素濃度的測(cè)定。

［1］苗曉杰，蔣恩臣，王佳，等.對(duì)二甲氨基苯甲醛顯色分光光度法檢測(cè)水溶液中常微量尿素［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，42（8）：87－92.

［2］翟少偉.二乙酰一肟法測(cè)定乳尿素氮的研究［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，49（3）：686－687，691.

［3］楊仁杰，劉蓉，徐可欣.基于中紅外光譜檢測(cè)牛奶中摻雜的尿素［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2011，31（9）：2383－2385.

［4］杜昌文，周健民.水溶液中微量尿素的測(cè)定［J］.土壤肥料，2002，（4）：41－43.

［5］施偉紅.改良二乙酰一肟－安替比林法測(cè)定游泳池水中尿素［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2008，18（7）：1319－1320.

［6］唐明江，劉宗林，王劍.游泳池水中尿素測(cè)定方法的研究［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2008，18（4）：641－642.

［7］武金鳳，郭志剛，郝美艷.飼料中尿素測(cè)定方法的研究［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2008，10（增2）：87－93.

［8］劉志剛，趙慶良，孫麗欣，等.PDAB比色法直接測(cè)定液相中的常量尿素［J］.哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，40（8）：1214－1217.

［9］李敏，鄭長(zhǎng)立，張勇.對(duì)二甲氨基苯甲醛比色法測(cè)定解析廢液中的微量尿素［J］.化工技術(shù)與開發(fā)，2005，34（3）：42－43.

［10］陳錄華.對(duì)二甲氨基苯甲醛法測(cè)定常量尿素［J］.大氮肥，1998，21（6）：422－424.