紀(jì)巍，楊麗坤，柏錫，朱延明，才華

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

cry6Aa2m基因植物表達(dá)載體構(gòu)建及大豆的遺傳轉(zhuǎn)化

紀(jì)巍，楊麗坤，柏錫，朱延明，才華

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

cry6Aa2殺線蟲(chóng)晶體蛋白基因?qū)€蟲(chóng)有很高的殺蟲(chóng)活性，根據(jù)大豆密碼子的偏愛(ài)性，人工合成殺線蟲(chóng)最小毒力區(qū)間cry6Aa2m基因。以pCAMBIA3300為骨架，構(gòu)建由組成型強(qiáng)啟動(dòng)子E12 CaMV35S調(diào)控的cry6Aa2m基因、篩選標(biāo)記基因?yàn)槌輨┛剐詁ar基因的植物表達(dá)載體pCBE-cry6，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)東農(nóng)50大豆子葉節(jié)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，通過(guò)PCR和RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果證明cry6Aa2m基因已整合到大豆基因組中并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，獲得轉(zhuǎn)cry6Aa2m基因大豆新株系18株，為大豆抗線蟲(chóng)分子育種研究提供材料。

大豆；cry6Aa2m基因；遺傳轉(zhuǎn)化；農(nóng)桿菌介導(dǎo)；轉(zhuǎn)基因株系

大豆胞囊線蟲(chóng)（Heterodera glycines）是一種大豆毀滅性病害，線蟲(chóng)寄生后對(duì)根部造成機(jī)械損傷，嚴(yán)重阻礙水分和無(wú)機(jī)鹽從根部吸收和向上運(yùn)輸，同時(shí)產(chǎn)生刺激植物的物質(zhì)，引起寄主植物畸形，如蟲(chóng)癭、根結(jié)、胞囊，影響大豆產(chǎn)量，并引發(fā)其他病害并發(fā)感染[1]。大豆胞囊線蟲(chóng)病對(duì)我國(guó)大豆產(chǎn)量和品質(zhì)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。

蘇云金芽胞桿菌作為目前世界上應(yīng)用最廣泛、最成功的生物殺蟲(chóng)劑和轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)育種原動(dòng)力資源庫(kù)，保持近90年的安全高效使用記錄[2]，對(duì)多種昆蟲(chóng)、線蟲(chóng)、螨類和原生動(dòng)物等具有特異性殺蟲(chóng)活性[3-4]。目前發(fā)掘的殺線蟲(chóng)基因還很少，其中cry1、cry5、cry6、cry12、cry13、cry14、cry21是現(xiàn)有具有殺線蟲(chóng)能力的晶體蛋白基因，cry6與其他cry類基因親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上與其他殺蟲(chóng)晶體蛋白差異較大，單獨(dú)作為cry6亞家族；其余被歸為cry5亞家族[5]。Li等把cry6A基因基于植物密碼子偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化，由強(qiáng)組成型啟動(dòng)子35S啟動(dòng)并且轉(zhuǎn)化番茄，結(jié)果顯示cry6A基因在番茄根中大量表達(dá)，而且線蟲(chóng)能攝取54 ku的cry6A晶體蛋白，與對(duì)照相比線蟲(chóng)產(chǎn)卵數(shù)減少4倍[6]。Li等把cry5B成功轉(zhuǎn)化番茄，晶體蛋白表達(dá)后番茄根中的線蟲(chóng)產(chǎn)卵數(shù)降低3倍[7]。表明晶體蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中具有殺線蟲(chóng)的能力。

cry6Aa2基因是從對(duì)北方根結(jié)線蟲(chóng)有高毒力的蘇云金芽胞桿菌野生型菌株YBT-1518中最新克隆到的一個(gè)Bt基因[8]，通過(guò)殺蟲(chóng)活性測(cè)定表明，晶體蛋白cry6Aa2對(duì)線蟲(chóng)有高毒力殺蟲(chóng)能力，半致死濃度為23.9 μg·mL-1[9]。本研究根據(jù)大豆密碼子偏愛(ài)性，人工合成cry6Aa2基因的最小毒力區(qū)間，利用東北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物基因工程與分子生物學(xué)研究室已建立的高效大豆遺傳轉(zhuǎn)化體系（農(nóng)桿菌介導(dǎo)法），轉(zhuǎn)化大豆東農(nóng)50，通過(guò)PCR技術(shù)篩選和驗(yàn)證，初步獲得轉(zhuǎn)基因大豆新株系，對(duì)大豆胞囊線蟲(chóng)的防治、大豆產(chǎn)量和品質(zhì)提高，具有重要的研究?jī)r(jià)值和廣闊的應(yīng)用開(kāi)發(fā)前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

大豆品種東農(nóng)50，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

所用培養(yǎng)基及其成分參見(jiàn)文獻(xiàn)[10-11]方法。

1.1.3 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌DH5α，農(nóng)桿菌EHA105由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物生物工程研究室保存。cry6Aa2基因由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。以pCAMBIA3300為骨架，構(gòu)建由強(qiáng)組成型啟動(dòng)子E12 CaMV35S調(diào)控的含有cry6Aa2m目的基因、除草劑抗性Bar基因?yàn)楹Y選標(biāo)記基因的植物表達(dá)載體pCBE-cry6，參考Hofgen和Willmitzer凍融法[12]直接將質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株中，其T-DNA區(qū)的結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 質(zhì)粒pCBE-cry6的T-DNA區(qū)Fig.1 Linear map of plant expression plasmid pCBE-cry6 T-DNA cassette

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 密碼子改造

基于大豆基因組中最優(yōu)密碼子對(duì)編碼cry6Aa2基因的核酸序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化。去除原序列中存在的poly A和富含AT的ATTTA序列等不穩(wěn)定元件，并選用大豆偏愛(ài)的密碼子，使G+C含量從27.24%提高到44.26%。

1.2.2 載體構(gòu)建

根據(jù)cry6Aa2m基因序列設(shè)計(jì)特異性引物（cry6Aa2m-S：5'GGATCCATGATCATTGACTC 3'cry6Aa2m-AS：5'GAGCTCACTCACTATAGGGC 3'），引物兩端分別引入Bam HⅠ和SacⅠ酶切位點(diǎn)。從pEASY-Blunt Simple載體上用高保真酶PCR擴(kuò)增得到全長(zhǎng)基因，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1 500 bp，反應(yīng)條件為（25 μL體系）：98℃預(yù)變性10 min；98℃30 s，55℃15 s，72℃90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。經(jīng)雙酶切鑒定正確的轉(zhuǎn)化子送交測(cè)序，序列完全正確的命名為pEASY-cry6BS。

將pEASY-cry6BS質(zhì)粒和pCBE-GsGST13表達(dá)載體經(jīng)大量提取與純化后，分別采用Bam HⅠ、SacⅠ雙酶切，分別回收cry6Aa2m小片段和pCBEGsGST13大片段，通過(guò)T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有Km的LB培養(yǎng)基平板上篩選轉(zhuǎn)化菌落，Bam HⅠ、SacⅠ雙酶切鑒定轉(zhuǎn)化子，經(jīng)鑒定的重組子命名為pCBE-cry6。

1.2.3 重組載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

采用凍融法將已構(gòu)建的植物表達(dá)載體pCBE-cry6轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105，涂布在含有相應(yīng)抗生素的YEB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，用cry6Aa2m基因特異性引物對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR鑒定。引物和反應(yīng)體系同1.2.2。

1.2.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的子葉節(jié)轉(zhuǎn)化法

挑選飽滿、無(wú)菌斑的大豆種子經(jīng)氯氣滅菌接種在萌發(fā)培養(yǎng)基上。萌發(fā)5 d后，縱向平均分開(kāi)2片子葉，去除頂芽和側(cè)芽后在垂直于子葉與下胚軸連接處的有效分化部位輕劃5～7刀；將制備好的子葉節(jié)外植體置于菌液中，侵染30 min后在22℃進(jìn)行3 d共培養(yǎng)；轉(zhuǎn)入不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基；14 d后轉(zhuǎn)入含2 mg·L-1Glufasinate的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選培養(yǎng)；經(jīng)過(guò)28 d的不定芽誘導(dǎo)后，將外植體接入伸長(zhǎng)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；待不定芽伸長(zhǎng)到3～5 cm后轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基中，根長(zhǎng)到2～3 cm時(shí)，移栽到混合土（蛭石/珍珠巖/黑鈣土（或黑土）=1/1/1），散射光下覆膜保濕培養(yǎng)，約3～5 d后轉(zhuǎn)入正常光下培養(yǎng)[13]。

1.2.5 PCR檢測(cè)

取抗性植株葉片，用DNA提取試劑盒（Easy pure Plant Genomic DNA Extraction Kit）提取基因組DNA；用bar基因特異性引物（S：5'TGCACCATCG TCAACCACTACATCG 3'，AS：5'CCAGCTGCCAG AAACCCACGTCATG 3'）進(jìn)行PCR檢測(cè)，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為450 bp，反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性10 min；94℃30 s，63℃30 s，72℃35 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。25 μL PCR反應(yīng)體系，含有2.5 μL 10倍的PCR Buffer，2 μL 2 mmol·L-1的dNTP Mixture，1 μL 10 μmol·L-1的引物，1 μL的模板，0.25 μL 5 U·μL-1的rTaq聚合酶。

1.2.6 PT-PCR檢測(cè)

取大豆T1代PCR陽(yáng)性植株葉片，用RNA prep Plant Kit試劑盒提取樣品總RNA，純化后，以Super ScriptTMⅢReverse Transcriptase試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，應(yīng)用cry6Aa2m基因特異性引物（S：5' AGACTGGATTGGGTTTGCCTG 3'，AS：5'CACCA GAGCAACCTTGAAACCG 3'）進(jìn)行PCR檢測(cè)，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為210 bp，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性10 min；94℃30 s，50℃30 s，72℃10s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。25 μL PCR反應(yīng)體系，含有2.5 μL 10倍的PCR Buffer，2 μL 2 mmol·L-1的dNTP Mixture，1 μL 10 μmol·L-1的引物，1 μL的模板，0.25 μl 5 U·μL-1的rTaq聚合酶。內(nèi)參是以18srRNA序列設(shè)計(jì)的引物（S：5'GGGGGGAGTAT GGTCGCAAG 3'，AS：5'TCGCTCCACCAACTAAG AACGG 3'），擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約200 bp，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性10 min；94℃30 s，58℃30 s，72℃20 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。25 μL PCR反應(yīng)體系，含有2.5 μL 10倍的PCR Buffer，2 μL 2 mmol·L-1的dNTP Mixture，1 μL 10 μmol·L-1的引物，1 μL模板，0.25 μL 5 U·μL-1rTaq聚合酶。

2 結(jié)果與分析

2.1 載體構(gòu)建

從pEASY-Blunt Simple載體上PCR擴(kuò)增得到cry6Aa2m全長(zhǎng)基因，大小1 500 bp，如圖2所示。

圖2 cry6Aa2m基因的PCR克隆Fig.2 PCR amplification of full lengthcry6Aa2m gene

克隆到的cry6Aa2m全長(zhǎng)基因PCR產(chǎn)物連接到pEASY-Blunt cloning kit載體后經(jīng)Bam HⅠ和SacⅠ雙酶切鑒定，切出4 000和1 500 bp兩條帶，測(cè)全長(zhǎng)序列，經(jīng)比對(duì)后序列完全正確，說(shuō)明完全正確的cry6Aa2m全長(zhǎng)基因已連接到克隆載體pEASY-cry6BS上。用Bam HⅠ和SacⅠ雙酶切pEASY-cry6BS質(zhì)粒和pCBE-GsGST13表達(dá)載體后，將pEASY-cry6BS質(zhì)粒上的cry6Aa2m小片段和pCBEGsGST13表達(dá)載體的大片段連接如圖3所示，經(jīng)Bam HⅠ和SacⅠ雙酶切鑒定重組子，切出11 300和1 500 bp兩條帶。證明該質(zhì)粒確為重組質(zhì)粒pCBE-cry6，如圖4所示。

圖3 植物表達(dá)載體pCBE-cry6的構(gòu)建Fig.3 Construction of plant expression vector pCBE-cry6

圖4 植物表達(dá)載體pCBE-cry6的酶切鑒定Fig.4 Characterization with endonucleases of plant expression vector pCBE-cry6

2.2 重組載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

挑取單菌落為模板，用cry6Aa2m基因特異性引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。由圖5可以看出，泳道3～5均擴(kuò)增出約1 500 bp條帶，證明重組質(zhì)粒pCBE-cry6已正確導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌中。

2.3 抗性植株的獲得

農(nóng)桿菌侵染后，將外植體進(jìn)行共培養(yǎng)（見(jiàn)圖6A）；3 d后取出洗凈轉(zhuǎn)至不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基（見(jiàn)圖6B）；14 d后接入含Glufasinate的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選培養(yǎng)（見(jiàn)圖6C）；28 d的不定芽誘導(dǎo)后，將外植體接入伸長(zhǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)（見(jiàn)圖6D）；待不定芽伸長(zhǎng)到3～5 cm時(shí)，轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基中（見(jiàn)圖6E）；根長(zhǎng)至約2～3 cm后，馴化、移栽（見(jiàn)圖6F）。最終獲得抗性植株44株。

圖5 植物表達(dá)載體pCBE-cry6轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌落PCR鑒定結(jié)果Fig.5 PCR analysis of pCBE-cry6 expression vector transferred into Agrobacterium

圖6 大豆遺傳轉(zhuǎn)化及再生Fig.6 Genetic transformation and regeneration of soybean

2.4 抗性植株檢測(cè)

2.4.1 T0代植株P(guān)CR檢測(cè)

分批對(duì)約500個(gè)子葉節(jié)進(jìn)行侵染后得到44株轉(zhuǎn)pCBE-cry6 T0代大豆品種東農(nóng)50的抗性植株，以抗性植株的總DNA為模板，pEASY-cry6BS質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，以水和非轉(zhuǎn)基因基因東農(nóng)50作為陰性對(duì)照，Bar特異序列為引物，進(jìn)行PCR檢測(cè)經(jīng)過(guò)三次生物學(xué)重復(fù)后。其中34株能擴(kuò)增到450 bp，而陰性對(duì)照均無(wú)擴(kuò)增帶，初步證明cry6Aa2m基因已整合到大豆基因組中，轉(zhuǎn)pCBE-cry6 T0代大豆品種東農(nóng)50抗性植株的PCR陽(yáng)性率達(dá)到77.3%（PCR陽(yáng)性率=PCR陽(yáng)性植株數(shù)/抗性植株數(shù)）。PCR結(jié)果見(jiàn)圖7。

2.4.2 T1代植株的RT-PCR檢測(cè)

以T1代34株P(guān)CR陽(yáng)性植株總RNA分別為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA后，進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，18株P(guān)CR陽(yáng)性植株均能擴(kuò)增約210 bp的特異條帶，證明cry6Aa2m基因在大豆中正常轉(zhuǎn)錄。RT-PCR陽(yáng)性率達(dá)到了40.9%（RT-PCR陽(yáng)性率=RT-PCR陽(yáng)性植株數(shù)/抗性植株數(shù)）。RT-PCR電泳結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖7 抗性植株P(guān)CR檢測(cè)Fig.7 PCR detection of Glufasinate resistant plants

圖8 T1代植株RT-PCR檢測(cè)Fig.8 RT-PCR detection of T1plants

3 討論與結(jié)論

本研究選用導(dǎo)入抗性基因方式進(jìn)行抗線蟲(chóng)育種。cry6Aa2基因其編碼的晶體蛋白對(duì)線蟲(chóng)有很高的殺蟲(chóng)活性，與其高度相似的cry6Aa1基因已在番茄中驗(yàn)證具有殺線蟲(chóng)能力，所以將功能確定的cry6Aa2基因轉(zhuǎn)入大豆，對(duì)轉(zhuǎn)基因后代進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)和抗蟲(chóng)檢測(cè)，獲得抗蟲(chóng)、可穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因純合體植株，對(duì)大豆胞囊線蟲(chóng)的防治、大豆產(chǎn)量和品質(zhì)提高有重大意義。cry6Aa2基因來(lái)自蘇云金芽胞桿菌，直接轉(zhuǎn)入高等植物中效果不理想。因?yàn)樽畛趵靡吧虰t基因獲得的轉(zhuǎn)基因植株抗蟲(chóng)能力都很弱，表達(dá)的毒蛋白只占總蛋白的0.1001%或者幾乎檢測(cè)不到。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Bt基因由于是原核基因，在植物中mRNA不穩(wěn)定，進(jìn)行翻譯時(shí)由于某些種類tRNA含量過(guò)少而降低了翻譯效率。Zou等將Bt毒蛋白基因轉(zhuǎn)入棉花，先將富含AT（63%）密碼子的cryIA（b）和cryIA（c）型毒蛋白基因的21%的密碼子改造成植物偏愛(ài)的同義密碼子，使G+C含量從37%提高到49%，最終使外源基因在棉花中的表達(dá)量分別提高10倍和100倍[14]。本研究將cry6Aa2m基因在不改變氨基酸序列的前提下選用大豆偏愛(ài)的密碼子，通過(guò)人工改造重新合成基因并結(jié)合使用強(qiáng)啟動(dòng)子，有望提高毒蛋白的表達(dá)水平，從而提高轉(zhuǎn)基因大豆抗線蟲(chóng)能力。

本研究對(duì)已轉(zhuǎn)質(zhì)粒pCBE-cry6的抗性植株進(jìn)行PCR檢測(cè)RT-PCR檢測(cè)，獲得cry6Aa2m基因已經(jīng)整合到大豆基因組中并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)基因植株，為進(jìn)一步確定cry6Aa2m基因插入植物基因組的拷貝數(shù)，需進(jìn)行Southern Blot檢測(cè)，進(jìn)一步確定cry6Aa2m基因是否可以在植物中正常表達(dá)，進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。本研究根據(jù)大豆密碼子的偏愛(ài)性，人工合成殺胞囊線蟲(chóng)最小毒力區(qū)間cry6Aa2m基因，以pCAMBIA3300為骨架，構(gòu)建由組成型強(qiáng)啟動(dòng)子E12 CaMV35S調(diào)控cry6Aa2m基因、篩選標(biāo)記基因?yàn)槌輨┛剐訠ar基因的植物表達(dá)載體pCBE-cry6，采用已經(jīng)建立的高效穩(wěn)定農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)再生體系，對(duì)東農(nóng)50進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。本研究侵染子葉節(jié)約500個(gè)，最終獲得抗性苗44株，PCR陽(yáng)性植株34株，PCR陽(yáng)性率達(dá)到77.3%（PCR陽(yáng)性率=PCR陽(yáng)性植株數(shù)/抗性植株數(shù)），RT-PCR陽(yáng)性植株18株，RT-PCR陽(yáng)性率達(dá)到40.9%（RT-PCR陽(yáng)性率=RT-PCR陽(yáng)性植株數(shù)/抗性植株數(shù)）。

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Construction of plant expression vector ofcry6Aa2mgene and transformation intoGlycine max

JI Wei,YANG Likun,BAI Xi,ZHU Yanming,CAI Hua
(School of Life Sciences,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Bacillus thuringiensis(Bt)crystal(cry)proteins are present in thecry6Aa2 intoxicate free-living nematodes.As bacterial codon usage is incompatible with expression in plants,the paper codon-modifiedcry6Aa2 genes designed by selecting the optimal codon usage for each amino acid based on the soybean genome information.The expression vector pCBE-cry6 was constructed.In the vector,cry6Aa2mgene was driven by promoter E12 CaMV35S.Bar served as selection marker andcry6Aa2mgene was transformed into Dongnong50 viaAgrobacterium-mediated method.Total 18 soybean transgenic resistant lines were acquired.PCR and RT-PCR detection indicated that thecry6Aa2mwas successfully integrated into soybean genome and expressed.The research materials yielded in this study might be useful on study of resistence toHeterodera glycines.

soybean;cry6Aa2mgene;genetic transformation;Agrobacterium-mediated method; transformed plant

S572

A

1005-9369（2014）01-0059-06

2012-02-14

國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)（2009ZX08009-032B）

紀(jì)巍（1982-），女，副教授，博士，研究方向?yàn)橹参锘蚬こ膛c分子生物學(xué)。E-mail:iwei-ji@neau.edu.cn

時(shí)間2014-1-9 19:30:59[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140109.1930.001.html

紀(jì)巍,楊麗坤,柏錫,等.cry6Aa2m基因植物表達(dá)載體構(gòu)建及大豆的遺傳轉(zhuǎn)化[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45(1):59-64.

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