李文濱，周失，李永光

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

大腸桿菌谷氨酸脫氫酶基因的克隆及功能分析

李文濱1,2，周失1,2，李永光1,2

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

谷氨酸脫氫酶是生物體內(nèi)最主要的氧化脫氨基酶類，為進(jìn)一步研究其功能，將大腸桿菌（Escherichia coli）BL21菌株中克隆得到的谷氨酸脫氫酶基因gdhA插入pCAMBIA3301質(zhì)粒載體上，替換bar基因，構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-gdhA。用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化煙草（Nicotiana tobaccum）havana425，成功得到轉(zhuǎn)基因植株。對盆栽煙草干旱脅迫，同時(shí)取T1代轉(zhuǎn)基因后代葉片使其自然失水7 h。結(jié)果表明，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因煙草表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗旱性，葉片保水力較強(qiáng)。草銨膦試驗(yàn)表明，gdhA基因可顯著提高煙草抗除草劑性能。

谷氨酸脫氫酶基因；煙草；抗旱；草銨膦

谷氨酸脫氫酶（GDH）是生物界中廣泛存在的一種多聚酶，其催化反應(yīng)為：NH4++α-酮戊二酸+ NAD（P）H→谷氨酸+NAD（P）+[1]。在植物生長發(fā)育過程中，氨的同化作用非常重要。谷氨酰胺和谷氨酸為植物體內(nèi)重要含氮化合物的合成提供所需的氮[2]。谷氨酰胺合成酶（GS）在氮代謝過程中起作用，是重要解毒酶，可解除氨基酸降解、光呼吸及硝酸鹽還原釋放出銨毒性，草銨膦（Glufosinate，PPT）作用的靶酶為GS[3]。在PPT處理植物組織后，抑制GS活性，打破植物體內(nèi)穩(wěn)定的氮循環(huán)，最終可致植物死亡。同時(shí)，GDH通過另一個(gè)途徑催化谷氨酸合成，維持植物體內(nèi)氮循環(huán)穩(wěn)定，這可能是GDH提高植物抗草銨膦能力的原因。草銨膦雖能抑制生物體內(nèi)GS，但不能進(jìn)入哺乳動物血液和腦組織，所以應(yīng)用草銨膦安全[4]。

已有報(bào)道植物在高溫、干旱、高鹽、污染以及病原菌侵染等逆境條件下都會造成GDH活性升高，其原因可能在逆境環(huán)境中容易造成植物體蛋白質(zhì)降解，釋放出大量的銨引起植物中毒[5]。而組織中銨含量的顯著上升，誘導(dǎo)NADH-GDH活性上升，使NADH-GDH在銨同化中所起的作用加強(qiáng)，以減輕植物因銨的過量積累造成的傷害，起到保護(hù)作用[6]。同時(shí)它在植物受到水分脅迫等狀況下表達(dá)[7]，能夠提高植物對干旱的耐受性。已證實(shí)低等單細(xì)胞生物中的GDH對底物氨的Km值僅為0.02 mmol·L-1，而高等植物中GDH催化底物卻需要很高的Km值，約10～80 mmol·L-1，可認(rèn)為低等單細(xì)胞生物GDH具有更高的氮同化能力。將大腸桿菌（Escherichia coli）strK12菌株中的gdhA基因克隆并轉(zhuǎn)入煙草和玉米中，都出現(xiàn)產(chǎn)量提高，細(xì)胞內(nèi)脯氨酸、可溶性糖濃度增加，抗旱能力較強(qiáng)的現(xiàn)象。在水分脅迫時(shí)，植物體內(nèi)脯氨酸和可溶性糖含量增加[8]，對于大腸桿菌（Escherichia coli）strK12菌株中g(shù)dhA基因提高植物抗旱能力的原因可能在于一方面提高植物體內(nèi)氨基酸和可溶性糖含量，另一方面調(diào)節(jié)氣孔開合的機(jī)制和植物體水分利用率以減少失水量，同時(shí)根結(jié)構(gòu)的改變更利于其從土壤中吸水。

為利用谷氨酸脫氫酶基因的抗除草劑和抗逆性，本研究從大腸桿菌（Escherichia coli）BL21中克隆出gdhA基因，并將其與組成型啟動子CaMV 35S融合，構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-gdhA通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入煙草。結(jié)果表明，gdhA基因提高了煙草抗除草劑和抗旱的能力，可為農(nóng)作物遺傳轉(zhuǎn)化和抗旱基因工程研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌（Escherichia coli）BL21，植物表達(dá)載體pBI3301，農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefacieus）LBA4404，煙草品種havana425，35S：bar煙草均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)載體構(gòu)建與葉盤法轉(zhuǎn)化煙草

根據(jù)GenBank上查找大腸桿菌（Escherichia coli）BL21中的gdhA基因序列設(shè)計(jì)引物，引物設(shè)計(jì)如下：

PCR反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性5 min，94°C變性30 s，50.7°C退火30 s，72°C延伸30 s，40個(gè)循環(huán)，72°C終延伸10 min。

用XhoⅠ單酶切質(zhì)粒pCAMBIA3301，將克隆并測序正確的目的基因與載體連接，構(gòu)建重組載體pCAMBIA3301-gdhA（見圖1），凍融法轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌，通過葉盤法轉(zhuǎn)化煙草。

圖1 pCAMBIA3301-gdhA表達(dá)載體圖譜Fig.1 pCAMBIA3301 plasmid vector

1.2.2 再生植株P(guān)CR鑒定

用SDS法提取轉(zhuǎn)基因煙草總DNA，Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后PCR，PCR呈陽性的植株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3 除草劑抗性鑒定

取10 μL草銨膦溶液（濃度呈梯度）點(diǎn)狀涂抹在轉(zhuǎn)gdhA基因煙草、轉(zhuǎn)bar基因煙草和野生型havana425煙草自上而下第3片展開葉上，5 d后觀察葉色變化。

1.2.4 離體葉片保水性試驗(yàn)

取PCR檢測呈陽性的轉(zhuǎn)35S：gdhA基因的煙草植株和野生型煙株形態(tài)大小較一致的生長狀態(tài)良好葉片，使用葉面積測量儀測量葉面積后，置于濾紙上，在室溫條件下使其自然失水7 h，每隔0.5 h稱量一次葉重，記錄葉片失水情況，計(jì)算單位葉面積累積失水量。每組3次重復(fù)。

將失水后的葉片在濕濾紙上復(fù)水0.5 h后，用鑷子撕取下表皮，顯微成像系統(tǒng)下觀察下表皮上的氣孔器和氣孔大小。觀察10個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)氣孔密度，求平均值，并用目鏡測微尺測量下表皮上氣孔器和氣孔長寬。

每組用直徑8 mm的打孔器取15個(gè)葉盤，用去離子水將其淹沒，真空泵抽氣20 min，電導(dǎo)率儀測初試電導(dǎo)率（S1），然后置沸水浴中20min，冷卻后于室溫測終電導(dǎo)率（S2）。相對電導(dǎo)率（%）=S1/S2×100%。

1.2.5 盆栽抗旱試驗(yàn)

將煙苗移栽至土中以后定量澆水，約40 d后停止?jié)菜?，自然干?0 d，每隔5 d取一次樣，測定脯氨酸、丙二醛、可溶性糖和SOD值，測定方法參見文獻(xiàn)[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因煙草鑒定

2.1.1 轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR鑒定

為驗(yàn)證gdhA基因是否已整合到基因組中，提取具有草丁膦抗性的T0代煙草植株DNA，以總DNA為模板、gdhA基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增（見圖2）。

同時(shí)以總RNA反轉(zhuǎn)錄之后得到的cDNA為模板進(jìn)行半定量PCR擴(kuò)增（見圖3），表明該基因在植物體內(nèi)正常表達(dá)。T0代共獲得14株煙草植株，最終確定9個(gè)株系為轉(zhuǎn)基因陽性植株。

2.1.2 轉(zhuǎn)基因陽性植株草銨膦抗性確定

為驗(yàn)證gdhA基因?qū)煵輰τ诓蒌@膦抗性的影響，將其與常用的bar基因作比較。在35S：gdhA煙草-12株系和-13株系、35S：bar煙草和野生型煙草正常生長的T1代植株中各隨機(jī)選取10株，將草銨膦配制成如圖4所示6個(gè)濃度的溶液，點(diǎn)狀涂抹于從上向下數(shù)第3片展開葉，35S：gdhA煙草、野生型和35S：bar煙草涂抹同樣的梯度，5 d之后觀察，發(fā)現(xiàn)草銨膦濃度在300 mg·L-1時(shí)野生型已明顯黃化，35S：bar煙草在500 mg·L-1濃度時(shí)略微變黃，而轉(zhuǎn)基因葉片在600 mg·L-1濃度時(shí)幾乎沒有變化（見圖4）。說明轉(zhuǎn)gdhA基因煙草對草銨膦的抗性有顯著提高。

圖2 轉(zhuǎn)基因煙草PCR產(chǎn)物電泳Fig.2 Product of PCR amplification ofgdhA-transgenic tobacco

圖3 轉(zhuǎn)基因煙草半定量PCR產(chǎn)物電泳Fig.3 Product of semi-quantitive PCR amplification of transgenic tobacco

2.2 離體葉片保水性分析

2.2.1 離體葉片保水力測定

葉片保水力能在一定程度上體現(xiàn)植物的抗旱性。本研究中，在剪葉7 h后，野生型葉片萎蔫，葉面積明顯縮小，葉色黯淡；轉(zhuǎn)基因葉片萎蔫較輕，葉面積縮小但沒有野生型變化明顯，葉色較亮（見圖5）。葉片在剪葉后1 h內(nèi)失水速率較快，失水量大；2 h后失水速率減慢，但累積失水量不斷增加（見圖6）。轉(zhuǎn)基因煙草和野生型相比，在開始1 h內(nèi)，野生型明顯比轉(zhuǎn)基因葉片失水快，2 h后失水速率減慢，但從圖中折線趨勢看，野生型葉片仍比轉(zhuǎn)基因的失水快。說明轉(zhuǎn)35S：gdhA基因可提高煙草葉片保水性能。

圖4 轉(zhuǎn)基因煙草葉片對草丁膦抗性鑒定Fig.4 Resistance of transgenic tobacco to glufosinate

圖5 自然失水前后的葉片F(xiàn)ig.5 Leaves around the natural water loss

圖6 單位葉面積累積失水量Fig.6 Accumulative water loss per unit leaf area

2.2.2 離體葉片氣孔觀察

為分析轉(zhuǎn)基因煙草葉片保水性能與組織器官特異性的關(guān)系，分析做保水性試驗(yàn)的同一片葉子氣孔密度和大小（見圖7）。gdhA煙草葉片的下表皮氣孔密度為25.8個(gè)/視野，而野生型的為36.6個(gè)/視野，gdhA葉片的氣孔密度小于野生型。表明轉(zhuǎn)gdhA基因煙草的下表皮氣孔數(shù)明顯減少。

圖7顯示，轉(zhuǎn)gdhA煙草和野生型相比，下表皮氣孔較長，氣孔長寬比較大；下表皮氣孔器較長，寬度較小，氣孔器長寬比較大，氣孔開度小，說明轉(zhuǎn)基因煙草的氣孔開度小于野生型。

本研究中，在盆栽失水后，野生型煙草丙二醛含量總體呈增加趨勢，隨著脅迫時(shí)間的延長，含量差異越發(fā)明顯（見圖8-A），而轉(zhuǎn)基因煙草的丙二醛含量總體保持在一個(gè)水平。在脅迫20 d之后，野生型煙草丙二醛含量上升趨勢明顯高于轉(zhuǎn)基因煙草，表明轉(zhuǎn)基因煙草比野生型煙草的細(xì)胞膜受損程度低，抗旱適應(yīng)性比非轉(zhuǎn)基因煙草植株強(qiáng)。

在干旱脅迫后，轉(zhuǎn)基因煙草仍保持綠色，生長狀態(tài)良好，而野生型煙草葉片幾乎全部黃化萎蔫，僅有少數(shù)葉片仍保持綠色（見圖9）。說明轉(zhuǎn)基因煙草抗旱性得到顯著提高。同時(shí)轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草可溶性糖含量及脯氨酸含量都有所升高，但是野生型煙草上升趨勢明顯高于轉(zhuǎn)基因煙草（見圖8-B、C），可能轉(zhuǎn)gdhA基因煙草的抗旱調(diào)節(jié)通過其他途徑完成。干旱處理后，野生型煙草的SOD活性迅速升高，上升速率明顯高于轉(zhuǎn)基因煙草（見圖8-D）。

圖7 離體葉片下表皮氣孔觀察Fig.7 Observing stoma in lower epidermis

圖8 干旱脅迫對煙草生理指標(biāo)的影響Fig.8 physiological indexes in drought stress

圖9 干旱脅迫后的轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草Fig.9 Drought stress of transgenic tobacco

3 討論與結(jié)論

煙草基因具轉(zhuǎn)化技術(shù)簡單、效率高、速度快等特點(diǎn)，在許多未知基因功能鑒定、基因各調(diào)控元件作用的研究中，往往被作為外源基因遺傳轉(zhuǎn)化的模式植物，甚至被用作生物反應(yīng)器。前人已證明gdhA基因具有諸多功能。GDH有六聚體也有四聚體的報(bào)道，GDH在催化反應(yīng)的過程中需要輔酶參與，需要NADPH的GDH主要存在葉綠體中，而需要輔酶NADH的GDH存在于線粒體中，主要參與光呼吸作用，所以對以NADH為電子受體的GDH研究較為深入。NAD（H）-GDH由六個(gè)亞基組成，亞基主要有兩種類型α和β。β亞基普遍存在于植物體的所有結(jié)構(gòu)里，但并不總是能檢測到α亞基，據(jù)此推測其生理功能不盡相同[13]。Oaks等分離出玉米莖中的線粒體，并發(fā)現(xiàn)能夠單獨(dú)合成谷氨酸，認(rèn)為GDH在植物中主要起合成谷氨酸的作用，是與GS-GOGAT循環(huán)同時(shí)存在的一種銨同化途徑[14]。Fox等研究胡蘿卜懸浮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞對氨需求量較大時(shí)，GDH活性較低，當(dāng)培養(yǎng)基中較缺乏碳源時(shí)GDH活性最高，在缺乏碳源時(shí)，GDH主要起分解代謝的作用[15]。GDH在植物缺乏碳源時(shí)起分解作用，為植物提供碳源，而當(dāng)?shù)催^量時(shí)起到同化銨的作用。由于已明確植物體內(nèi)主要的銨同化途徑是GSGOGAT，推測GDH可能主要在植物處于逆境或衰老過程中發(fā)揮作用。已有報(bào)道植物在高溫、干旱、高鹽、污染以及病原菌侵染等逆境條件下都會造成GDH活性的升高，其原因可能在逆境環(huán)境中容易造成植物體蛋白質(zhì)降解，釋放出大量的銨引起植物中毒，此時(shí)GSGOGAT途徑受到限制，所以GDH在緩解植物銨中毒的過程中發(fā)揮主要作用[5]。

為了驗(yàn)證本試驗(yàn)所克隆的大腸桿菌BL21菌株中的gdhA基因在其他物種中能否正常表達(dá)、表達(dá)產(chǎn)物是否具有谷氨酸脫氫酶活性以及在轉(zhuǎn)基因植株中的抗旱、抗除草劑作用中的生理功能，為下一步gdhA基因轉(zhuǎn)化農(nóng)作物并獲得抗旱新種質(zhì)提供基礎(chǔ)。本試驗(yàn)首次從大腸桿菌BL21菌株中克隆gdhA基因，并將其導(dǎo)入煙草havana425中，主要從gdhA的抗旱性及抗除草劑性方面分析，結(jié)果表明與野生型相比較，轉(zhuǎn)基因煙草氣孔較少，在自然失水后氣孔關(guān)閉情況較好；轉(zhuǎn)基因葉片具有更高的保水力。轉(zhuǎn)基因煙草葉片在涂抹500 mg·L-1草丁膦的情況下仍保持綠色，無變化，與35S：bar煙草相比抗性有所提高。試驗(yàn)結(jié)果初步證明，轉(zhuǎn)gdhA基因煙草植株的抗旱性有所提高，可能與谷氨酸脫氫酶的銨同化作用有關(guān)，在植物遭到干旱脅迫時(shí)，谷氨酸脫氫酶活性會顯著提高，也可能是因?yàn)檗D(zhuǎn)gdhA基因的作物具有較高的水分利用率，但水分利用率是否可以作為植物抗旱指標(biāo)目前仍存爭議。其他脅迫條件如鹽脅迫、低溫脅迫對轉(zhuǎn)gdhA煙草的影響尚待深入研究。谷氨酸脫氫酶的表達(dá)狀況受脅迫條件的影響，因此gdhA基因在不同脅迫條件下發(fā)揮的具體作用，將是今后研究方向。

[1]Britton K L,Baker P J,Rice D W,et al.Structural relationship between the hexameric and tetrameric family of glutamate dehydrogenases[J].Eur J Biochem,1992,209:851.

[2]張宏軍,倪漢文,周志強(qiáng),等.抗草銨膦轉(zhuǎn)基因作物及其生物安全性研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2002,7(5):54-56.

[3]張宏軍,劉學(xué),張佳,等.草銨膦的作用機(jī)理及其應(yīng)用[J].農(nóng)藥科學(xué)與管理,2004(4):23-27.

[4]向文勝,肖振平,趙長山.抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1998,29(2):201-208.

[5]Srivastava H S,Singh R P.Role and regulation of L-glutamate dehydrogenase activity in higher plants[J].Phytochemistry,1987, 26:597-610.

[6]Kumar R G,Shah K,Dubey R S.Salinity induced behavioral changes in maltase dehydrogenase and glutamate dehydrogenase activities in rice seedlings of differing salt tolerance[J].Plant Sci, 2000,156:23-34.

[7]Melo-Oliveira R,Cunha-Oliveira I,Coruzzi G M.Arabidopsis mutant analysis and gene regulation define a nonuredundant role for glutamate dehydrogenase in nitrogen assimilation[J].Proc Natl Acad Sci USA,1996,93:4718-4723.

[8]高蕾,劉麗君,董守坤,等.干旱脅迫對大豆幼苗葉片生理生化特性的影響[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,40(8):1-4.

[9]李合生.植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M]．北京:高等教育出版社,2000.

[10]Jaglo Ottosen K R,Gilmour S J,Zarka D G,et al.Arabidopsis CBF1 over-expression induces COR genes and enhances freezing tolerance[J].Science,1998,280:104-106.

[11]Kasuga M,Liu Q,Miura S,et al.Improving plant drought,salt,and freezing tolerance by gene transfer of a single stress-inducible transcription factor[J].Nature Biotechnology,1999,17:287-291.

[12]押輝遠(yuǎn),谷運(yùn)紅,秦廣雍,等.導(dǎo)入Prd29A:DREB1A融合基因獲得抗逆性小麥的探索與實(shí)踐[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2004(2):12-15.

[13]Turano F J,Thakkar S S,Tung F,et al.Characterization and expression of NAD(H)-dependent glutamate dehydrogenase gene in Arabidopsis[J].Plant Physiol,1997,113:1329-1341.

[14]Oaks A.Evidence for deamination by glutamate dehydrogenase in higher plants:Reply[J].Can J Bot,1995,73:1112-1115.

[15]Robinson S A,Slade A P,Fox G G,et al.The role of glutamate dehydrogenase in plant nitrogen metabolism[J].Plant Physiol, 1991,95:509-516.

Cloning and functional analysis of glutamate dehydrogenase gene
(gdhA)inE.coliBL21

LI Wenbin1,2,ZHOU Shi1,2,LI Yongguang1,2
(1.Soybean Research Institute,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.Key Laboratory of Soybean Biology of Chinese Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Glutamate dehydrogenaseis the main oxidative deamination enzymein vivo.In order to further study its function,Glutamate dehydrogenasegene cloned inE.coli(Escherichia coli)BL21 was inserted into pCAMBIA3301 plasmids carrier to replace the bar gene.The transformed tobacco(Nicotiana tobacum)havana425 using the plasmid was obtained.Drought stress to pottedNicotiana tabacumand leaf water retention capacity test was investigated.Blades of T1generation of transgenic offspring naturally dehydrate for 7 h.The results showed that transgenic-gdhANicotiana tabacumshowed higher resistance to drought and higher water retention capacity than that of the non-transgenicNicotiana tabacum.The glufosinate test showed that transgenic-gdhANicotiana tabacumshowed higher resistance to herbicide.

gdhA;Nicotiana tabacum;drought resistance;Glutamate dehydrogenase;glufosinate

S572

A

1005-9369（2014）01-0053-06

2013-03-28

農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因重大專項(xiàng)（2013ZX08004-001，2013ZX08004-002）

李文濱（1958-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)榇蠖惯z傳育種和生物技術(shù)。E-mail:wenbinli@yahoo.com

時(shí)間2014-1-9 22:50:51[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140109.2250.018.html

李文濱,周失,李永光.大腸桿菌谷氨酸脫氫酶基因的克隆及功能分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45(1):53-58.

Li Wenbin,Zhou Shi,Li Yongguang.Cloning and functional analysis of glutamate dehydrogenase gene(gdhA)inE.coliBL21[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(1):53-58.(in Chinese with English abstract)