張亞玲，何璘，靳學(xué)慧，王寶玉，付迪

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

黑龍江省稻瘟病菌無毒基因Avrpiz-t群體結(jié)構(gòu)分析

張亞玲，何璘，靳學(xué)慧，王寶玉，付迪

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

利用NCBI中公布的Avrpiz-t基因序列設(shè)計特異引物，對黑龍江省四個作物種植區(qū)的108個稻瘟病菌菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，明確稻瘟病菌無毒基因Avrpiz-t在黑龍江省四個作物種植區(qū)的分布情況。結(jié)果表明，供試108個菌株中有82%的菌株是正?；颍瑥V泛分布于黑龍江省四個作物種植區(qū)，在供試的菌株中10.4%的菌株未擴(kuò)增出條帶，分布于Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ作物種植區(qū)，第Ⅳ作物種植區(qū)的菌株均能擴(kuò)增到條帶；高帶型菌株（有轉(zhuǎn)座子Pot3插入）10個，占供試菌株的9.4%，在四個作物種植區(qū)內(nèi)均有分布。

稻瘟病菌；無毒基因；群體結(jié)構(gòu)；作物種植區(qū)

稻瘟病菌（Magnaporthe oryzea B.Couch，無性態(tài)：Pyricularia grisea Cavara）引起的稻瘟病是水稻生產(chǎn)上最具毀滅性的病害之一[1-2]。目前，控制該病害最為經(jīng)濟(jì)有效且對環(huán)境安全的策略是抗病品種的使用。由于稻瘟病菌群體在田間極易發(fā)生變異，能快速地克服寄主的抗性而導(dǎo)致寄主“喪失”抗性變?yōu)楦胁　Ｒ阎九c稻瘟病菌之間特異性互作，符合“基因?qū)颉睂W(xué)說[3]，即抗性基因與其相對應(yīng)的無毒基因之間的特異性互作導(dǎo)致寄主表現(xiàn)抗性反應(yīng)。因此，病原菌無毒基因的存在與分布情況研究對于指導(dǎo)抗病品種的合理使用、更好地防治稻瘟病具有重要意義。

水稻抗性基因piz-t是北方粳稻非常有利用價值的一個重要稻瘟菌抗性基因，稻瘟病菌無毒基因Avrpiz-t是在水稻稻瘟病菌第7號染色體上[4]，可編碼108個氨基酸的分泌蛋白，不具有同源性。根據(jù)Li等研究表明，無毒基因Avrpiz-t在稻瘟病菌實驗室測序菌株70-15上表現(xiàn)為在其CDS區(qū)-462 bp處有一轉(zhuǎn)座子Pot3插入，使其失去功能[5]。黑龍江省屬于高寒地區(qū)，根據(jù)各地積溫的不同將黑龍江省劃分為六個積溫區(qū)，本研究結(jié)合黑龍江省水稻主要種植區(qū)域在四個積溫區(qū)內(nèi)采集稻瘟病菌菌株，對其無毒基因Avrpiz-t的分布特點進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

供試菌株為2012年秋季采集的黑龍江省水稻主栽地區(qū)稻瘟病菌菌株108個，分布于黑龍江省五個作物品種積溫區(qū)劃的四個積溫帶內(nèi)。菌種保存于黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)植物病理實驗室。

表1 供試菌株及地點Table 1 Isolates and their region

1.2 方法

1.2.1 菌絲培養(yǎng)與收集

將供試菌株活化于米糠培養(yǎng)基上，培養(yǎng)10 d后，每個菌株挑取4塊新鮮菌絲塊（0.5 cm×0.5 cm）接種于經(jīng)高壓滅菌的酵母液體培養(yǎng)基（酵母4 g，葡萄糖10 g，瓊脂粉5.5 g，500 mL水）中。然后置于搖床中28℃恒溫，170 r·min-1振蕩培養(yǎng)2～3 d，待菌絲體生長茂盛且未變黑時，滅菌紗布和濾紙真空過濾，再用滅菌蒸餾水抽洗2次，最后用濾紙盡可能地將菌絲中的水吸干，并分裝于1.5 mL離心管中，置于-20℃冰箱中冷凍保存。

1.2.2 稻瘟病菌基因組DNA提取

取約150 mg凍干菌絲置于預(yù)冷研缽中，加液氮研磨至粉末，然后，用DNA抽提試劑盒（E.Z.N. A.RFungal DNA Kit，Omega公司，美國）對基因組DNA進(jìn)行抽提，其提取方法參照試劑合說明書步驟進(jìn)行。

1.2.3 特異性引物設(shè)計

根據(jù)GenBank中公布的Avrpiz-t基因核苷酸序列（EU837058），利用Primer premier 5.0軟件引物，經(jīng)BROAD搜索后確定特異性。其引物設(shè)計方法見圖1，引物序列：

擴(kuò)增片段長度如基因內(nèi)有轉(zhuǎn)座子Pot3插入為4 696 bp（高帶型），如無轉(zhuǎn)座子長度為2 834 bp（低帶型），如未擴(kuò)增出條帶則為無帶型。

1.2.4 PCR擴(kuò)增

擴(kuò)增采用20 μL體系包括：14.7 μL ddH2O，2 μL 10×buffer（含Mg2+），1.6 μL dNTPs（4×10 mmol·L-1），引物0.3 μL×2（2.5 μmol·L-1），1 μL Taq酶（2 U·μL-1），模板1 μL（45 ng·μL-1）。

圖1 Avrpiz-t特點及引物設(shè)計Fig.1 Avrpiz-t characteristics and primer design

PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性4 min；94℃45 s，56℃或60℃45 s，72℃90 s，36個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 明確目的基因

選取測序菌株guy11和供試菌株中隨機(jī)取5個菌株進(jìn)行擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物純化后送上海英俊生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.6 基因型分析

觀察并記載PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上的電泳結(jié)果，可將供試稻瘟病菌無毒基因Avrpiz-t劃分為三種類型，即高帶型、低帶型和無帶型。根據(jù)特異性條帶的有無，統(tǒng)計出不同指紋類型的菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株中Avrpiz-t存在與缺失分析

通過兩對特異性引物檢測108個稻瘟病菌菌株，發(fā)現(xiàn)供試菌株中有11個稻瘟病菌菌PCR擴(kuò)增時無帶（見圖2），占供試菌株的10.4%（見表1）。在供試菌株中有近90%以上菌株都有該基因存在，說明Avrpiz-t基因在黑龍江省稻瘟病菌群體中分布較廣。

2.2 無毒基因Avrpiz-t在黑龍江省四個積溫帶的分布

在第一積溫帶供試的21個菌株中有2個菌株未擴(kuò)增到條帶，占供試菌株的9.5%，包括黑龍江省西部的泰來縣和肇源縣。第二積溫帶供試的41個菌株中有6個未擴(kuò)增出條帶，占供試菌株的14.6%，其中綏化有2株，雙河農(nóng)場、紅興隆管局、密山市和八五七農(nóng)場各1株。第三積溫帶供試的24個菌株中有3個未擴(kuò)增出條帶，占供試菌株的12.5%，分布于黑龍江省中部的慶安縣和東部的八五二農(nóng)場、八五六農(nóng)場；第四積溫帶中供試菌株22個，沒有未擴(kuò)增出條帶的菌株（見表2）。

圖2 部分供試菌株Avrpiz-t擴(kuò)增電泳Fig.2 Electrophoresis pattern of the isolates Avrpiz-t.

表2 供試菌株基因型表現(xiàn)Table 2 Gene type of isolates

2.3 無毒基因Avrpiz-t轉(zhuǎn)座子存在情況分析

當(dāng)Avrpiz-t啟動子區(qū)域在基因上游462 bp處有轉(zhuǎn)座子Pot3插入時會使基因功能破壞，因此本研究出現(xiàn)高帶型基因即為有轉(zhuǎn)座子Pot3插入（見圖2）。研究結(jié)果表明供試的108個菌株中高帶型菌株10個，占供試菌株的9.4%。四個積溫帶內(nèi)都有高帶型菌株存在，其中第Ⅳ積溫帶的供試菌株中所占比例最高，達(dá)18%（見表3）。

表3 供試菌株P(guān)CR擴(kuò)增結(jié)果Table 3 PCR amplication results of the Avrpiz-t

續(xù)表

3 討論與結(jié)論

根據(jù)已報道的稻瘟病菌無毒基因Avrpiz-t序列及基因特征，設(shè)計特異性引物對黑龍江省2012年采集的108個水稻稻瘟病菌菌株進(jìn)行擴(kuò)增，確定不同基因類型，明確稻瘟病菌無毒基因Avrpiz-t在黑龍江省各水稻種植區(qū)的分布，研究結(jié)果表明，稻瘟病菌無毒基因Avrpiz-t在黑龍江省稻瘟病菌中分布較廣泛，供試的108個菌株在黑龍江省水稻種植的四個作物積溫區(qū)內(nèi)均有分布，且正?；蝾愋停ǖ蛶停┱脊┰嚲甑?2%。說明稻瘟病菌無毒基因Avrpiz-t在黑龍江省各大水稻種植區(qū)域均分布廣泛，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中種植帶有稻瘟病抗病基因Piz-t的品種可減少稻瘟病發(fā)生。

供試的106個菌株中有11個菌株未擴(kuò)增到條帶，占供試菌株的10.4%，分布于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ積溫帶，而第四積溫帶菌株均能擴(kuò)增到條帶。此研究結(jié)果說明黑龍江稻瘟病菌存在Avrpiz-t缺失現(xiàn)象，這與孫庚等研究結(jié)果類似[7]。近年黑龍江省稻瘟病發(fā)生相對較重，稻瘟病菌中無毒基因的缺失或是水稻抗性基因的缺失都是稻瘟病發(fā)生的原因之一。

根據(jù)Avrpiz-t基因特點，在基因啟動子區(qū)域可能會有一轉(zhuǎn)座子Pot3插入，使基因表達(dá)不穩(wěn)定，因此即使是該基因的保守序列在大多數(shù)供試菌株中都存在，但其表達(dá)情況也可能存在差異。本研究通過設(shè)計特異性引物明確稻瘟病菌中Pot3在啟動子區(qū)域的存在情況，在供試的不同積溫區(qū)內(nèi)稻瘟病菌菌株中共有10個存在轉(zhuǎn)座子Pot3插入情況，即高帶型菌株，占供試菌株的9.4%，說明黑龍江省水稻種植區(qū)內(nèi)有此類基因型存在，但不是主要類群，大部分菌株還是以正常基因型（低帶型）的菌株類型存在。Li研究結(jié)果表明，當(dāng)Avrpiz-t啟動子區(qū)域內(nèi)有轉(zhuǎn)座子Pot3插入時其功能喪失[5]，轉(zhuǎn)座子插入現(xiàn)象也可能是造成黑龍江省稻瘟病發(fā)生的原因之一。

關(guān)于黑龍江省水稻稻瘟病菌其他無毒基因群體構(gòu)成的研究前面已有報道[6-10]，但對于Avrpiz-t研究還未見報道，本研究從基因型分析角度確定黑龍江省稻瘟病菌Avrpiz-t分布情況，在研究過程中未經(jīng)過致病性鑒定，在后續(xù)研究中要結(jié)合致病性研究黑龍江省稻瘟病菌Avrpiz-t群體進(jìn)化情況。

[1]Couch B C,Kohn L M.A multilocus gene genealogy concordant with host preference indicates segregation of a new species, Magnaporthe oryzea,from M.grisea[J].Mycologia,2002,94:683-693.

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[5]Li W,Wang B,Wu J,et al.The Magnaporthe oryzae avirulence gene Avrpiz-t encodes a predicted secreted protein that triggers the immunity in rice mediated by the blast resistance gene Piz-t [J].MPMI,2009,22(4):411-420.

[6]張崎峰,靳學(xué)慧,蔡鑫鑫,等.利用SSR鑒定黑龍江省水稻稻瘟病菌無毒基因[J].中國農(nóng)學(xué)通報,2010,26(10):250-254.

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Population structure analysis of avirulence genesAvrpiz-tofMagnaporthe oryzeain Heilongjiang Province

ZHANG Yaling,HE Lin,JIN Xuehui, WANG Baoyu,FU Di
(Agricultural College Heilongjiang Bayi Agricultural University Daqing Heilongjiang 163319,China)

Using PCR amplification method,and avirulence genes Avrpiz-t that published in NCBI gene sequence to design specific primer,108 isolates of Magnaporthe oryzea of four cultivation in Heilongjiang Province were test,to make it clear the rice blast fungus avirulence gene Avrpiz-t in distribution of four crop-growing zone in Heilongjiang Province.Research results indicated that 82% strains had normal gene of the 108 strains for test,broad distribution in Heilongjiang Province four crop planting zones.There were 10.4%strains of the 108 strains for test no strape,and distribution inⅠ,ⅡandⅢcrop planting zones,and the isolates inⅣcrop planting district of strains were all had strape;10 strains with high strape type(Pot3 insert),which ccounted for 10%,and distributed in four a crop planting district.

Magnaporthe oryzea;avirulence gene;population structure;crop plant zone

S435.111.1

A

1005-9369（2014）01-0041-06

2013-07-18

黑龍江省自然基金項目（QC2011C046）；黑龍江省農(nóng)墾總局科技攻關(guān)項目（HNK125A-08-06）；黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)“大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃”項目（2012）

張亞玲（1977-），女，副教授，碩士，研究方向為植物真菌病害。E-mail:byndzyl@163.com

時間2014-1-9 21:09:57[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140109.2109.010.html

張亞玲,何璘,靳學(xué)慧,等.黑龍江省稻瘟病菌無毒基因Avrpiz-t群體結(jié)構(gòu)分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2014,45(1):41-46.

Zhang Yaling,He Lin,Jin Xuehui,et al.Population structure analysis of avirulence genesAvrpiz-tofMagnaporthe oryzeain Heilongjiang Province[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(1):41-46.(in Chinese with English abstract)