張娜，王小艷，李慶章，姜毓君

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

ZHANG Na,WANG Xiaoyan,LI Qingzhang,JIANG Yujun(Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,NortheastAgricuLtural University,Harbin 150030,China)

奶牛乳腺中調(diào)控乳脂合成關(guān)鍵基因表達(dá)分析

張娜，王小艷，李慶章*，姜毓君

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

采用熒光定量PCR檢測(cè)高、低乳品質(zhì)奶牛乳腺中調(diào)控乳脂合成重要功能基因的表達(dá)，檢測(cè)乳脂合成關(guān)鍵酶活性。結(jié)果表明，ACC、ACSL1在高乳品質(zhì)組和低乳品質(zhì)組的表達(dá)量差異不顯著（P＞0.05），高乳品質(zhì)組奶牛乳腺中FAS的表達(dá)量顯著低于低乳品質(zhì)組（P＜0.05），高乳品質(zhì)組奶牛乳腺中FAS酶活性顯著高于低乳品質(zhì)奶牛組（P＜0.05），ACC酶活性二者差異不顯著。FABP3、SCD和AGPAT6在高乳品質(zhì)組的表達(dá)水平顯著高于低乳品質(zhì)組的表達(dá)量（P＜0.05）。結(jié)果表明，ACC活性對(duì)于維持乳脂分泌至關(guān)重要，F(xiàn)AS活性以及FABP3、SCD和AGPAT6基因表達(dá)影響乳脂含量。

奶牛；乳腺；脂肪酸合成；熒光定量PCR

乳脂是乳中主要能量成分，決定乳汁多種物理性質(zhì)和工藝特征，是評(píng)估乳及乳產(chǎn)品的感官指標(biāo)。乳脂由甘油三酯（占乳脂含量96%～98%）和少量的甘油二酯和甘油一酯（0.02%）、游離脂肪酸（0.22%）和視黃醇組成[1]。乳中生成甘油三酯的脂肪酸超過(guò)400種，在4～18碳的脂肪酸中，cis-9,16∶1、油酸（oleic acid,OA）、trans-18:1和亞油酸（Linoleic acid,LA）含量最高[1]。乳中甘油三酯主要有兩個(gè)來(lái)源，一是從外周循環(huán)血液吸收的脂肪酸；二是通過(guò)乳腺分泌細(xì)胞合成。根據(jù)奶牛品種、泌乳階段和日糧的不同，從頭合成的脂肪酸占牛奶中總脂肪酸的比例最少為0.60摩爾或按質(zhì)計(jì)算為0.40[2]。本研究旨在排除外在環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)因素情況下，通過(guò)檢測(cè)泌乳期高、低乳品質(zhì)奶牛乳腺中調(diào)控乳脂合成關(guān)鍵基因的表達(dá)和關(guān)鍵酶活性分析，研究中國(guó)荷斯坦奶牛個(gè)體差異對(duì)乳脂合成影響，為提高或降低乳脂含量奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)并提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)動(dòng)物為100頭體重約550 kg，泌乳天數(shù)為（90±10）d，產(chǎn)奶量均為20 kg·d-1第二產(chǎn)健康中國(guó)荷斯坦奶牛，根據(jù)牛奶乳成分分析結(jié)果中乳蛋白和乳脂含量（見(jiàn)表1），隨機(jī)挑選乳蛋白乳率、乳脂率高于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的3頭采樣奶牛作為高乳品質(zhì)奶牛組（H組），同時(shí)隨機(jī)挑選乳蛋白乳率、乳脂率低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)3頭采樣奶牛作為低乳品質(zhì)奶牛組（L組）并以豆腐渣為主要原料制備基礎(chǔ)飼糧，滿足中國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（NY/t34-2004）推薦營(yíng)養(yǎng)需求。飼糧組成與營(yíng)養(yǎng)水平如表2所示。

試驗(yàn)動(dòng)物采用栓系式飼養(yǎng)。日榨乳2次，機(jī)器榨奶；每日喂精、粗飼料3次；時(shí)間5:00，11:00，17:00；保證試驗(yàn)期間精、粗飼料及營(yíng)養(yǎng)水平一致。喂養(yǎng)3個(gè)月后，屠宰取奶牛乳腺組織-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

表1 奶牛乳成分分析Table 1 Composition of milk of dairy cows(%)

表2 飼糧組成與營(yíng)養(yǎng)水平（以干物質(zhì)為基礎(chǔ)）Table 2 Composition and nutrient levels of basal diets(air-dry basis)(%)

1.2 熒光定量PCR

1.2.1 乳腺組織總RNA的提取

乳腺組織液氮研磨后，采用TRIzol法提取乳腺組織中總RNA。取1 μL RNA樣用DEPC水1∶10稀釋后，使用NanoDrop 2000紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA溶液濃度和純度（OD260/OD280），所有樣本比值要求在1.8～2.0，檢測(cè)合格后，用于cDNA合成。

1.2.2 cDNA的合成

應(yīng)用PrimeScriptTM RT試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。RT反應(yīng)液在冰上配制，各組取出0.1 μg RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA。

1.2.3 熒光定量PCR

應(yīng)用Applied Biosystems 7300 real-time PCR System和SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒進(jìn)行熒光定量RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系20 μL，冰上配制反應(yīng)液。根據(jù)熒光定量-PCR引物設(shè)計(jì)原則，使用Primer Premier 5.0和Oligo 6軟件設(shè)計(jì)引物，并應(yīng)用NCBI（National Center for Biotechnology Information）的BLAST功能進(jìn)行同源性分析，保證引物的特異性，交由Invitrogen基因公司合成，乙酰輔酶A羧化酶（Acetyl-CoA carboxylase，ACC,E.C.6.4.1.2）、脂肪酸合成酶（Fatty acid synthase,FAS,E.C. 2.3.1.85）、長(zhǎng)鏈乙酰CoA合成酶（Long chain ac?yl-CoA synthetases,ACSL）、脂肪酸結(jié)合蛋白3（Fat?ty acid binding protein 3,FABP3）、長(zhǎng)鏈乙酰CoA合成酶硬脂酰輔酶A去飽和酶（Stearoyl-CoA desatu?rase,SCD,EC1.14.99.5）、1-?；视?3磷酸?；D(zhuǎn)移酶6（1-acyl glycerol 3-phosphate acyl transfer?ase 6,AGPAT 6），內(nèi)參基因β-actin合成的引物序列如表3所示。

表3 熒光定量PCR引物Table 3 Primer pairs used to real-time PCR

1.2.4 熒光定量PCR基因擴(kuò)增效率

模板cDNA進(jìn)行10倍濃度稀釋，設(shè)置5個(gè)濃度梯度，每個(gè)梯度為4個(gè)副孔。加入引物。一般為5個(gè)梯度，根據(jù)儀器給出曲線和方程計(jì)算擴(kuò)增效率。

1.3 關(guān)鍵酶活性的檢測(cè)

SCD、ACC、FAS活性的測(cè)定方法依據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。試劑盒根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）雙抗體加心法原理測(cè)定酶活性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA濃度和質(zhì)量

各組奶牛提取的總RNA濃度較高，OD260/OD280均在1.8～2.0，說(shuō)明RNA純度較好（表4）。

表4 各組奶?？俁NA濃度和質(zhì)量Table 4 Concentration and quality of total RNA in different groups of dairy cows (%)

2.2 調(diào)控乳脂合成重要功能基因和內(nèi)參基因的熔解曲線、擴(kuò)增曲線和擴(kuò)增效率

本試驗(yàn)各檢測(cè)基因的熔解曲線均是單一峰，表明PCR產(chǎn)物單一（見(jiàn)圖1）。

圖1 Real-time PCR的溶解曲線和擴(kuò)增曲線Fig.1 Solubility curves and amplification curves of Real-time PCR

本試驗(yàn)采用雙delta法檢測(cè)乳脂合成重要功能基因相對(duì)表達(dá)，內(nèi)參基因與目的基因的擴(kuò)增效率必須一致或相近。如表5所示，目的基因與內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率均在95%～105%且相差不差過(guò)5%，擴(kuò)增效率較好，不需要更換引物。

表5 熒光定量PCR的擴(kuò)增效率Table 5 Determination of real-time PCR amplification efficiency(%)

2.3 調(diào)控乳脂合成重要功能基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量

如圖2所示，高乳品質(zhì)組奶牛乳腺中FAS的表達(dá)量顯著低于低乳品質(zhì)組（P＜0.05）。ACC、ACSL1在高乳品質(zhì)組和低乳品質(zhì)組的表達(dá)量差異不顯著（P＞0.05）。FABP3、SCD和AGPAT6在高乳品質(zhì)組表達(dá)水平顯著高于低乳品質(zhì)組的表達(dá)量（P＜0.05）。

圖2 乳脂合成相關(guān)重要功能基因的mRNA水平的檢測(cè)Fig.2 Expression of functional genes related to the synthesis of lipids

2.4 乳脂合成關(guān)鍵酶活性

本研究測(cè)定脂肪酸合成酶（FAS）、硬脂酰輔酶A去飽和酶（SCD）、乙酰輔酶A羧化酶（ACC）3種酶在高、低乳品質(zhì)奶牛乳腺組織中的活性。由結(jié)果可知（見(jiàn)圖3），ACC酶活性在高乳品質(zhì)組和低乳品質(zhì)組中差異不顯著（P＞0.05）。FAS、SCD在高乳品質(zhì)組的活性顯著高于低乳品質(zhì)組（P＜0.05）。

圖3 乳脂合成關(guān)鍵酶的活性檢測(cè)Fig.3 Activity assay of key enzymes related to synthesis of lipids

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)供試奶牛所采取飼養(yǎng)方式基本一致，即采用固定舍飼和日糧組成基本穩(wěn)定，沒(méi)有明顯改變喂養(yǎng)方式。試驗(yàn)結(jié)果中，雖然ACC、AC?SL1在高乳品質(zhì)組和低乳品質(zhì)組的表達(dá)量差異不顯著（P＞0.05），而且高乳品質(zhì)組奶牛乳腺中FAS的表達(dá)量顯著低于低乳品質(zhì)組（P＜0.05），但是高乳品質(zhì)組奶牛乳腺中FAS酶活性顯著高于低乳品質(zhì)奶牛組（P＜0.05），ACC酶活性二者差異不顯著。乳腺上皮細(xì)胞利用乙酸和β-羥丁酸合成短鏈和中鏈脂肪酸，乳腺中從頭合成所有的4到12碳的脂肪酸，絕大多數(shù)的14碳（14∶0.95%）和大約50%的C16∶0分泌到乳汁內(nèi)，然而18碳和更長(zhǎng)鏈的脂肪酸被認(rèn)為從循環(huán)血液中獲得[3]。脂肪酸的從頭合成需要乙酰CoA存在，同時(shí)需要2種關(guān)鍵酶乙酰CoA羧化酶（ACC）和脂肪酸合酶（FAS），并且由NADPH提供還原當(dāng)量[4]。乳腺合成脂肪酸最初的4碳單位由乙酸和β羥丁酸提供。乙酸在胞漿中生成乙酰CoA，并通過(guò)丙二酰單酰CoA途經(jīng)，在脂肪酸合成時(shí)為碳鏈的延長(zhǎng)提供碳原子。而β羥丁酸進(jìn)入乳腺上皮細(xì)胞后直接轉(zhuǎn)化為丁酰CoA。由ACC催化，乙酸轉(zhuǎn)化為乙酰CoA是脂肪酸合成的限速步驟。本試驗(yàn)結(jié)果中，ACC活性在兩個(gè)試驗(yàn)組中差異不顯著，說(shuō)明ACC活性對(duì)于維持乳脂分泌至關(guān)重要，而高乳品質(zhì)組奶牛中FAS活性顯著升高，說(shuō)明FAS活性對(duì)乳脂含量高低至關(guān)重要。

FABP3、SCD和AGPAT6在高乳品質(zhì)組的表達(dá)水平顯著高于低乳品質(zhì)組的表達(dá)量（P＜0.05）。脂肪酸結(jié)合蛋白（Fatty acid binding protein,FABP）和長(zhǎng)鏈乙酰CoA合成酶（Long chain acyl-CoA synthetas?es,ACSL）是在體外乳腺細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)基因脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和基因敲除小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)的一系列在各種組織中參與長(zhǎng)鏈脂肪酸吸收的候選蛋白。FABP和ACBP是非反芻動(dòng)物細(xì)胞中主要的脂肪酸穿膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可使特定的長(zhǎng)鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)到特定的細(xì)胞器上[5]。長(zhǎng)鏈脂肪酸在細(xì)胞內(nèi)參與代謝之前，先通過(guò)酯化作用生成酯酰CoA，脂肪酸激活主要通過(guò)ACSL亞型參與作用的ATP依賴機(jī)制[6]。一些ACSL（ACSL1、3、4和5）和FABP（FABP1、3、4、5和6）亞型在泌乳期奶牛乳腺組織中也有表達(dá)，并且ACSL1、FABP3、FABP4和FABP5在泌乳期表達(dá)量很大，但ACBP的mRNA的含量比較低，說(shuō)明其在奶牛乳腺脂肪酸合成中作用很小[7]。本研究結(jié)果表明ACSL1和FABP3的表達(dá)量在高乳品質(zhì)奶牛乳腺中顯著高于低乳品質(zhì)組。Bionaz and Loor研究表明，奶牛乳腺中ACSL1和FABP3參與協(xié)同調(diào)節(jié)運(yùn)輸脂肪酸合成甘油三酯[8]。

長(zhǎng)鏈脂肪酸進(jìn)入乳腺分泌細(xì)胞后去飽和，但是無(wú)證據(jù)表明乳腺攝取的脂肪酸可再延長(zhǎng)[3]。乳腺上皮細(xì)胞中含有硬脂酰輔酶A去飽和酶（Stearoyl-CoA desaturase,SCD,EC1.14.99.5）復(fù)合物，通常簡(jiǎn)稱為D-9脫氫酶，這種酶催化脂肪?；o酶A酯的氧化，進(jìn)而在碳9和碳10之間引進(jìn)順式雙鍵。SCD催化反應(yīng)的底物包括細(xì)胞色素b5、NAD（P）-細(xì)胞色素b5還原酶、分子氧以及脂酰輔酶A。反芻動(dòng)物乳腺SCD活性維持和調(diào)控乳流動(dòng)性，能保證乳汁從乳腺內(nèi)高效流出[9]。硬脂酰輔酶A和棕櫚酰輔酶A是SCD催化18∶0生成OA的主要前體物，在牛乳腺上皮細(xì)胞中SCD催化反應(yīng)的主要產(chǎn)物是OA[10-11]。用于乳腺甘油三酯合成的49%～60%的18∶0脂肪酸發(fā)生去飽和作用，占分泌到乳汁內(nèi)OA的60%[12-14]。SCD催化的反應(yīng)產(chǎn)物貢獻(xiàn)奶牛乳脂中約90%cis-9,14∶1和50%～56%的順cis-9,16∶1[13]。許多其他飽和脂酰輔酶A也可以作為SCD底物，如C10∶0、C12∶0、C14∶0、C15∶0和C17∶0）[2,15]。64%～97%的cis-9，trans-11共軛亞油酸由SCD催化trans-11,18:1合成[10]。在奶牛乳腺內(nèi)由13C標(biāo)記的25%的trans-11,18:1去飽和生成cis-9，trans-11共軛亞油酸[16]。本試驗(yàn)中，高乳品質(zhì)組SCD的基因表達(dá)量和酶活性均顯著高于低乳品質(zhì)組。本課題組發(fā)表的另一篇文章氣相色譜檢測(cè)高、低乳品質(zhì)奶牛乳汁中脂肪酸含量結(jié)果顯示，高乳品質(zhì)組中脂肪酸C18∶2n6t、C18∶2n6c、C18∶3n6（γ-亞麻酸）含量顯著高于低乳品質(zhì)組[17]。SCD是催化飽和脂肪酸合成單不飽和脂肪酸的限速酶，所以高乳品質(zhì)組奶牛乳汁中長(zhǎng)鏈脂肪酸的含量較高。

從頭合成脂肪酸，攝取的長(zhǎng)鏈脂肪酸以及SCD產(chǎn)物共同形成合成甘油三酯的脂肪酸庫(kù)。酯化脂肪酸通過(guò)3-磷酸甘油途徑完成。1-?；视?3磷酸?；D(zhuǎn)移酶（1-acyl glycerol 3-phosphate acyl transferase,AGPAT,E.C.2.3.1.51）催化sn-2位置的脂肪酸酯化。AGPAT的8種亞型均在奶牛乳腺組織內(nèi)表達(dá)，且AGPAT6、AGPAT1和AGPAT3表達(dá)量分別是AGPAT總mRNA的60%、18%和10%[7]。AGPAT6的表達(dá)最易受泌乳階段的影響，在泌乳60 d奶牛乳腺組織AGPAT6的表達(dá)量是產(chǎn)前15 d表達(dá)量的15倍[8]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，高乳品質(zhì)組AG?PAT6基因表達(dá)量顯著高于低乳品質(zhì)組，說(shuō)明AG?PAT6在乳脂合成中發(fā)揮重要作用。

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Analysis of expression of lipogenic genes in dairy cows mammary with different qualities milk/

Expression of lipogenic genes in the mammary of cows with different qualities milk were detected by real-time PCR,and mammary enzymes involved in milk fat synthesis were detected simuLtaneously.The results showed that the expression of ACC and ACSL1 in the high quality milk groups (H groups)and the low milk quality groups(L groups)were not significant difference(P＞0.05),and the expression of FAS in H groups was significantly lower than the L groups(P＜0.05).FAS activity in H groups was significantly higher than L groups(P＜0.05),and the difference of ACC activity was not significant between H groups and L groups.The expression of FABP3,SCD and AGPAT6 in H groups were significantly higher than L groups(P＜0.05).The results showed that ACC activity was essential for maintaining the secretion of milk fat,and FAS activity and FABP3,SCD and AGPAT6 affect fat content.

dairy cow;milk;fat acidsynthesis;real-time PCR

S852.21

A

1005-9369（2014）06-0084-07

時(shí)間 2014-6-11 16:07:27 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140611.1607.005.html

ZHANG Na,WANG Xiaoyan,LI Qingzhang,JIANG Yujun(Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,NortheastAgricuLtural University,Harbin 150030,China)

張娜，王小艷，李慶章.奶牛乳腺中調(diào)控乳脂合成關(guān)鍵基因表達(dá)分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45(6):84-90.

Zhang Na,Wang Xiaoyan,Li Qingzhang,et al.Analysis of expression of lipogenic genes in dairy cows mammary with different qualities milk[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(6):84-90.(in Chinese with English abstract)

2013-12-20

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展（973）計(jì)劃項(xiàng)目（2011CB100804）；國(guó)家自然科學(xué)青年基金（31101784）；東北農(nóng)業(yè)大學(xué)博士啟動(dòng)基金（2012RCB15）

張娜（1981-），女，助理研究員，博士，研究方向?yàn)槿橄侔l(fā)育與泌乳生物學(xué)。E-mail:nazhang1981@126.com。

*通訊作者：李慶章，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槿橄侔l(fā)育與泌乳生物學(xué)。E-mail:qzli@neau.edu.cn