許向陽(yáng)，于亭亭，趙婷婷，李帥，姜景彬，張賀，李景富

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱 150030）

番茄果實(shí)光滑基因F的分子標(biāo)記篩選及種質(zhì)資源鑒定

許向陽(yáng)，于亭亭，趙婷婷，李帥，姜景彬，張賀，李景富

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱 150030）

以含F(xiàn)基因的果實(shí)光滑型品種12509為母本，以果實(shí)皺褶型品種12510為父本配制雜交組合，以親本、F1及其F2代分離群體為研究材料，采用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)篩選與果實(shí)光滑基因F連鎖的分子標(biāo)記。通過(guò)對(duì)256對(duì)AFLP引物進(jìn)行篩選，獲得6個(gè)與F基因連鎖的標(biāo)記：E13M08、E11M07-B、E11M12-D、E11M08-A、E01M10和E10M16-E，連鎖遺傳距離分別為6.4、8.5、10.9、17.1、23.5和24.2 cM。將E13M08標(biāo)記用于種質(zhì)資源篩選，獲得45份果實(shí)光滑型材料，為番茄外觀品質(zhì)育種奠定基礎(chǔ)。

番茄；果實(shí)；F基因；AFLP；種質(zhì)資源

影響番茄果實(shí)形狀的主要位點(diǎn)有ovate、sun、fs8.1、f和lc[1]，此外也發(fā)現(xiàn)幾個(gè)次要位點(diǎn)存在。研究表明，番茄果實(shí)顏色受B、og、hp、dg（hp? dg）、Del、MOB等9個(gè)基因位點(diǎn)控制[2]，目前番茄育種工作主要著重于果實(shí)形狀、顏色、畸形果等外觀品質(zhì)研究，果實(shí)表面光澤度和光滑度與有無(wú)棱褶等方面有待進(jìn)一步研究，以培育更高商品性。

目前有多種分子標(biāo)記技術(shù)，如以Southern雜交為基礎(chǔ)RFLP、VNTR，以PCR為基礎(chǔ)SSR、SCAR、RGA等[3]，基于限制性酶切和PCR的DNA標(biāo)記，AFLP、CAPS等[4]，基于單核苷酸多態(tài)性的DNA標(biāo)記、SNP、RAPD，具有篩選準(zhǔn)確度高，可縮短育種周期等優(yōu)點(diǎn)。目前，關(guān)于番茄果實(shí)光滑基因F的分子標(biāo)記研究國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，本文應(yīng)用果實(shí)光滑型品種12509為母本和果實(shí)皺褶型品種12510為父本雜交獲F1代，經(jīng)F1代自交構(gòu)建標(biāo)記F2代群體；利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)親本、F1代及F2代群體進(jìn)行篩選，獲得與果實(shí)光滑基因F緊密連鎖的標(biāo)記，采用JoinMap4.0遺傳作圖軟件進(jìn)行遺傳連鎖分析，將該AFLP標(biāo)記定位，確定連鎖遺傳距離，利用所獲得的連鎖標(biāo)記對(duì)種質(zhì)資源進(jìn)行篩選，對(duì)需鑒定的種質(zhì)資源進(jìn)行田間表型調(diào)查，比較二者吻合率，確定標(biāo)記準(zhǔn)確性，為果實(shí)光滑型番茄遺傳育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

1.1.1 儀器

紫外分光光度計(jì)、高壓滅菌鍋、小型高速離心機(jī)、低溫離心機(jī)、-20℃冰箱、-80℃冰箱、超凈工作臺(tái)、液氮罐、德國(guó)Biometra T-Gradient The?moblock型PCR儀、凝膠自動(dòng)成像系統(tǒng)（GDS-800）、系列電泳儀、電泳槽等瓊脂糖凝膠電泳相關(guān)設(shè)備（DYY-8B型），聚丙烯酰胺凝膠電泳的相關(guān)設(shè)備、通風(fēng)櫥、Eppendorf Research和Reference系列移液器、電熱恒溫水浴鍋（DK-8D型）及其他常用分子生物學(xué)試驗(yàn)設(shè)備。

1.1.2 試劑

EDTA-Na2H2O、CTAB、RNase、Mse I、Eco R I、2×Taq Master Mix酶、ATP、T4DNA連接酶均為MBI公司產(chǎn)品，AFLP引物及接頭、DNA Marker由北京六合華大基因科技股份有限公司合成或生產(chǎn)，Repel、Binding由北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司生產(chǎn)，尿素、過(guò)硫酸銨、TEMED均為Amsensco。其他試劑如異戊醇、氯仿、氫氧化鈉、異丙醇、甲醛、冰乙酸等化學(xué)試劑由哈爾濱市寶瑞生物試劑公司和哈爾濱市德美試劑公司提供。瓊脂糖、Tris-HCl為進(jìn)口分裝，其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 材料

1.2.1 番茄材料

番茄母本材料12509為果實(shí)光滑型高代自交純合系，含有F基因；父本12510為果實(shí)皺褶型高代自交純合系，不含F(xiàn)基因；雜交F1代、自交F2代分離群體及70份用于種質(zhì)資源篩選的番茄材料，均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院番茄課題組提供。

1.2.2 AFLP引物

試驗(yàn)采用EcoR I和MseI酶切，其接頭序列為：

預(yù)擴(kuò)增引物為Eco R I pre 和Mse I pre，序列為:

選擇性擴(kuò)增的引物是根據(jù)番茄基因組大小和其堿基偏愛(ài)性，選擇上游E引物16條，下游M引物16條，其序列見(jiàn)表1。本試驗(yàn)用256對(duì)AFLP引物進(jìn)行分子標(biāo)記篩選，接頭采用E接頭和M接頭，所用AFLP引物均由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 番茄果型鑒定

在番茄果實(shí)成熟期，經(jīng)田間表型觀察區(qū)分確定果實(shí)形狀，即光滑型果實(shí)與皺褶型果實(shí)，母本為光滑型果實(shí)，父本為皺褶型果實(shí)（果實(shí)表面有棱褶），F(xiàn)1代雜交群體均為光滑型果實(shí)，F(xiàn)2代群體中果型出現(xiàn)分離現(xiàn)象，如圖1所示。

1.3.2 番茄葉片DNA提取

在F2代分離群體果實(shí)成熟時(shí)期取其幼嫩葉片200 mg裝在已滅菌的EP管內(nèi)，液氮速凍后，-80℃貯存，試驗(yàn)采用CTAB法[5]提取葉片DNA。1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)提取物濃度，并用滅菌后去離子水將各樣本濃度稀釋至50 ng·μL-1，于-20℃冰箱內(nèi)貯存，以用于AFLP分子標(biāo)記研究。

1.3.3 番茄果型基因池建立

根據(jù)番茄果型的田間調(diào)查情況，分別從果實(shí)光滑及皺褶的植株中各隨機(jī)選取25株，利用BSA法[6]建立果型基因池。

表1 AFLP標(biāo)記的E引物和M引物Table 1 AFLP E primers and M primers

圖1 番茄成熟果實(shí)Fig.1 Tomatomature fruit

1.3.4 AFLP分子標(biāo)記

番茄葉片DNA采用EcoR I和MseI進(jìn)行酶切。具體AFLP分子標(biāo)記方法[7]參考Vos等，酶切連接體系為：DNA（100～500 ng）3.0 μL，Eco RⅠadapter（5 pmol·μL-1）1.0 μL，MseⅠadapter（50 pmol·μL-1）1.0 μL，ATP（10 mmol·L-1）1.0 μL，10×Buffer 6.0 μL，EcoRⅠ（10 U·μL-1）0.5 μL，MseⅠ（10 U·μL-1）0.5 μL，T4DNA Ligase（5 U·μL-1）0.6 μL，加ddH2O至50 μL，反應(yīng)程序?yàn)?7℃酶切與連接6～8 h（時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)）。

預(yù)擴(kuò)增體系為DNA（酶切連接后產(chǎn)物）6.0 μL，EcoR I-primer 0.6 μL，MseI-primer 0.6 μL，2× TaqMaster Mix 8.0 μL，加ddH2O至25 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4℃3 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃ 1 min，24個(gè)循環(huán)；72℃10 min，4℃終止反應(yīng)。取5 μL預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，依據(jù)條帶清晰度情況，確定將預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物稀釋40倍為最佳，以用于選擇性擴(kuò)增，余下的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物于-20℃保存。

選擇性擴(kuò)增體系為DNA（預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋40×）6.0 μL，Exx（50 ng·μL-1）1.0 μL，Mxx（50 ng·μL-1）1.0 μL，2×TaqMaster Mix 8.0 μL，加ddH2O至25 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4℃3 min；94℃30 s，65℃30 s，（每個(gè)循環(huán)降低0.7℃），72℃1 min，12個(gè)循環(huán)；94℃30 s，56℃30 s，72℃1 min，25個(gè)循環(huán)（每個(gè)循環(huán)增加1 s）；72℃10 min；4℃終止反應(yīng)。將選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物在PCR儀中95℃變性8 min后立即置于冰水混合物中，用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離變性產(chǎn)物，銀染參照Bassam等方法[8]，銀染后進(jìn)行分析。

1.3.5 種質(zhì)資源篩選

利用E13M08標(biāo)記對(duì)70份種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定，并與田間表型鑒定結(jié)果結(jié)合分析，獲得有應(yīng)用價(jià)值的種質(zhì)資源。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間果型鑒定

觀察供試材料在果實(shí)成熟期的田間表型。經(jīng)鑒定表明，兩個(gè)親本間果實(shí)表現(xiàn)差異明顯，父本表現(xiàn)為皺褶型果實(shí)，母本表現(xiàn)為光滑型果實(shí)，F(xiàn)1代雜交群體均表現(xiàn)為光滑型果實(shí)，F(xiàn)2代分離群體果實(shí)光滑型與皺褶型實(shí)際比例為3.174∶1，x2檢測(cè)符合3∶1的分離比例。分析結(jié)果表明，母本12509中所含F(xiàn)基因符合單基因顯性遺傳規(guī)律。

表2 不同世代試驗(yàn)材料F基因的遺傳分析Table 2 Genetic analysis of F gene in different generation

2.2 AFLP分子標(biāo)記篩選及分析

利用父本（12510）與母本（12509）對(duì)256對(duì)AFLP引物進(jìn)行篩選，獲得82對(duì)差異性引物（見(jiàn)圖2），詳細(xì)引物見(jiàn)表3，利用果實(shí)光滑與皺褶的果型基因池進(jìn)行復(fù)選，篩選出33對(duì)差異較顯著的AFLP引物（見(jiàn)圖3）。使用篩選出33對(duì)引物對(duì)F2代分離群體共288株試驗(yàn)材料分別進(jìn)行擴(kuò)增，詳細(xì)引物見(jiàn)表4。對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行記錄，有帶記為“1”，無(wú)帶記為“0”（見(jiàn)圖4），應(yīng)用JoinMap4.0軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，確定遺傳連鎖距離（cM），得到6個(gè)連鎖標(biāo)記：E13M08、E11M07-B、E11M12-D、E11M08-A；E01M10和E10M16-E，連鎖遺傳距離分別為6.4、8.5、10.9、17.1、23.5和24.2 cM，AFLP分子標(biāo)記遺傳連鎖圖譜見(jiàn)圖5。

圖212509 ×12510群體篩選的部分AFLP引物Fig.2 Screening AFLP primers on 12509×12510 population

圖3 混合基因池篩選出的部分AFLP特異性引物Fig.3 Screening AFLP primers on mix pool

表3 從親本中篩選到的特異引物Table 3 Screening the specific primers from 12509 and 12510

表4 用于群體F2單株選擇性擴(kuò)增的特異引物Table 4 Primers used in amplication of F2individual plants of 12509×12510

圖4 引物E13M08在部分F2群體中的AFLP擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 AFLP PCR amplification results using E13M08 primers in partial F2population

圖5 AFLP分子標(biāo)記遺傳連鎖圖譜Fig.5 Genetic linkage map of AFLP markers

2.3 種質(zhì)資源篩選

對(duì)70份種質(zhì)資源進(jìn)行田間表型鑒定和分子標(biāo)記鑒定，田間表型鑒定70份材料中有50份為光滑品種，應(yīng)用E13M08標(biāo)記對(duì)70份種質(zhì)資源進(jìn)行篩選，二者結(jié)果吻合的品種為45份，吻合率為90%。具體見(jiàn)表5。

表5 F2代分離群體中部分單株的分子鑒定結(jié)果與田間表型鑒定結(jié)果Table 5 Result of molecular identification and field in partial F2population

3 討論與結(jié)論

經(jīng)典遺傳學(xué)認(rèn)為控制果實(shí)光滑性狀F基因符合單基因顯性遺傳規(guī)律，而B(niǎo)arrero等認(rèn)為控制此性狀是由主效基因和多個(gè)微效基因共同作用，為數(shù)量遺傳[9]。試驗(yàn)通過(guò)對(duì)親本、F1代雜交群體及F2代分離群體進(jìn)行田間果型鑒定，父本表現(xiàn)為皺褶型果實(shí)，母本表現(xiàn)為光滑型果實(shí)，F(xiàn)1代雜交群體均表現(xiàn)為光滑型果實(shí)，F(xiàn)2代分離群體果實(shí)光滑型與皺褶型比例接近3∶1，F(xiàn)基因符合單基因顯性遺傳規(guī)律。

目前分子標(biāo)記技術(shù)因選育周期短、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)而被應(yīng)用于番茄品質(zhì)育種工作中，其中AFLP分子標(biāo)記技術(shù)可靠性強(qiáng)、多態(tài)性高、可重復(fù)性較好、條帶豐富清晰，被認(rèn)為是有效分子標(biāo)記技術(shù)，本試驗(yàn)通過(guò)利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)，獲得6個(gè)與果實(shí)光滑基因F相連鎖分子標(biāo)記，且有兩個(gè)標(biāo)記（E13M08、E11M07-B）在10 cM以內(nèi)，可用于分子遺傳育種，在種質(zhì)資源篩選過(guò)程中，分子鑒定結(jié)果與田間表型鑒定結(jié)果差異性顯著，除環(huán)境或人為原因外，也可能E13M08標(biāo)記與F基因連鎖不緊密，這與試驗(yàn)材料親緣關(guān)系有關(guān)，還有待于篩選連鎖更為緊密的分子標(biāo)記，為今后分子育種工作奠定基礎(chǔ)。

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Screening of molecular markers linked to fruit smoothFgene intomato and identification of germplasm resource/

XU Xiangyang,YU Tingting, ZHAO Tingting,LI Shuai,JIANG Jingbin,ZHANG He,LI Jingfu(School of Horticulture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Study identified the molecular marker linked to smooth fruitFgene of tomato.The linked marker was screened with a F2population between a smooth and fasciated parent（12509×12510）by AFLP technology.Total six AFLP markers had been identified to linked withFgene,E13M08,E11M07-B, E11M12-D,E11M08-A,E01M10 and E10M16-E.The genetic distances were 6.4,8.5,10.9,17.1,23.5 and 24.2 cM,respectively.AFLP marker E13M08 was used for the screening of germplasm resources.We obtained 45 cultivars which contained this marker.The study provided the basis for the appearance quality of tomato breeding.

tomato;fruit;Fgene;AFLP;germplasm resource

S641.2

A

1005-9369（2014）06-0032-06

時(shí)間 2014-6-11 16:08:56 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140611.1608.007.html

許向陽(yáng),于亭亭,趙婷婷,等.番茄果實(shí)光滑基因F的分子標(biāo)記篩選及種質(zhì)資源鑒定[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45(6):32-37.

Xu Xiangyang,Yu Tingting,Zhao Tingting,et al.Screening of molecular markers linked to fruit smoothFgene in tomato and identification of germplasm resource[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(6):32-37.(in Chinese with English abstract)

2013-12-06

國(guó)家自然科學(xué)基金（31272171）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金（CARS-25）；黑龍江省杰出青年科學(xué)基金（JC201204）

許向陽(yáng)（1969-），男，研究員,博士，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槭卟诉z傳育種。E-mail:xxy709@126.com