鄭世民，周首龍，趙良友，劉超男，高雪麗，呂曉萍

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評價中心，哈爾濱 150040）

豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉病毒二聯(lián)RT-PCR檢測方法的建立

鄭世民1，周首龍1，趙良友2，劉超男1，高雪麗1，呂曉萍1

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評價中心，哈爾濱 150040）

為建立豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）和豬流行性腹瀉病毒（PEDV）的快速檢測方法，參照GenBank已發(fā)表序列，根據(jù)TGEV和PEDV的S蛋白基因結(jié)構(gòu)各設(shè)計1套特異性通用引物，擴(kuò)增目的帶分別為426和583 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下于500 bp上、下各有一條電泳帶，達(dá)到區(qū)分和鑒別目的。經(jīng)優(yōu)化確立最佳反應(yīng)體系：引物、MgCl2和dNTP濃度分別為8、9和14 μmol·L-1，退火溫度54℃。該方法在捕獲信息和復(fù)雜基因分析方面具有快速、敏感、特異、低成本等優(yōu)點(diǎn)，可為TGEV和PEDV檢測及TGE和PED流行病學(xué)調(diào)查等提供技術(shù)支持。

豬傳染性胃腸炎病毒；豬流行性腹瀉病毒；反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；反應(yīng)條件

豬傳染性胃腸炎（Transmissible gastroenteritis，TGE）和豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由套式病毒目冠狀病毒科冠狀病毒屬的傳染性胃腸炎病毒（TGEV）和豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起的豬急性、高發(fā)性、高度接觸性腸道疾病[1-4]。兩種疾病均以患病豬嘔吐、腹瀉和脫水為特征，臨診癥狀極其相似，經(jīng)常出現(xiàn)二者混合感染現(xiàn)象，根據(jù)流行病學(xué)和臨診癥狀只能作出初步診斷，確診需進(jìn)行實(shí)驗室檢查，鑒別診斷工作較為困難[5]。因此，建立一種快速、敏感、特異、準(zhǔn)確的診斷方法是監(jiān)測豬傳染性胃腸炎和豬流行性腹瀉的關(guān)鍵。本試驗建立TGEV和PEDV二聯(lián)RT-PCR檢測方法，可提高檢測效率，減少成本，為鑒別診斷、病原檢測等工作提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 病毒與細(xì)胞

TGEV（H株）、PEDV（CV777）、豬瘟病毒（HCV）、偽狂犬病病毒（PRV）、豬呼吸與繁殖障礙綜合征病毒（PRRSV）、豬細(xì)小病毒（PPV）及PK-15細(xì)胞均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。

1.2 主要試劑與儀器

總RNA提取試劑盒（Trizol Reagent），購自Invit?rogen公司；反轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV Reverse Transcrip?tase），購自Promega公司；Taq DNA Polymerase，購自Fermentas公司；PTC-200 PCR儀，購自美國BIO-RAD公司。

1.3 引物設(shè)計與合成

參考GenBank上已發(fā)表的TGEV和PEDV全基因序列，比較分析二者S蛋白基因的保守區(qū)域，按照多重RT-PCR引物設(shè)計原則[6-7]，利用Primer 5.0軟件設(shè)計TGEV和PEDV特異性引物:TGEV（P1）5′TTGTCAACACACAAGGGCAAGC 3′，TGEV（P2）5′CAAGTCCAAAAGTGCGATCACC 3′，目的片段長度為426 bp；PEDV（P3）5′TCGTTTTGGGTGGTTA CCTACC 3′，PEDV（P4）5′AGTGGCAAATACATTG GCAGCG 3′，目的片段長度為583 bp。引物由北京英駿生物工程有限公司合成。

1.4 病毒培養(yǎng)與收集

分別將TGEV和PEDV接種于生長良好的單層PK-15細(xì)胞，盲傳數(shù)代并收集細(xì)胞培養(yǎng)液，置于-80℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PCR模板制備

參照Invitrogen公司提供的產(chǎn)品說明書，利用Trizol試劑盒提取細(xì)胞培養(yǎng)病毒懸液總RNA并鑒定提取質(zhì)量；參照Promega公司反轉(zhuǎn)錄酶說明書，分別將所提取的TGEV和PEDV總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，同時設(shè)無模板對照和陰性對照。

1.6 單項PCR擴(kuò)增

1.6.1 目的片段擴(kuò)增

分別以TGEV和PEDV的cDNA為模板，相應(yīng)P1/P2、P3/P4為引物，建立50 μL的PCR反應(yīng)體系:10.0 μL 10×PCRBuffer，8.0 μL dNTP Mixture（2.5 mmol·L-1），0.25 μL rTaq（5 U·μL-1），2.0 μL MgCl2（25 mmol·L-1），上、下游引物（10 mmol·L-1）各1.0 μL，4.0 μL cDNA，ddH2O補(bǔ)至50 μL，最后加入30 μL液體石蠟。反應(yīng)條件分別為:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，52℃退火45 s，72℃延伸45 s，共30個循環(huán)，72℃終延伸10 min（引物為P1/P2）；94℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，54℃退火45 s，72℃延伸30 s，共30個循環(huán)，72℃終延伸5 min（引物為P3/P4）。設(shè)陰性和無模板對照。擴(kuò)增產(chǎn)物上樣1%瓊脂糖凝膠電泳（DNA Marker DL2000作為參比對照），經(jīng)紫外檢測儀觀察結(jié)果。

1.6.2 目的片段的評價

將上述含目的片段的瓊脂糖凝膠分別切下，應(yīng)用小量膠回收試劑盒純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物后，連接pMD-18T載體并轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞（T-A克?。?，Amp+-LB平板篩選陽性克隆后以Amp+-LB液體培養(yǎng)基增菌，采用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)質(zhì)粒PCR擴(kuò)增、酶切后電泳鑒定，并測序分析，測序工作由北京英駿生物工程有限公司完成，測定結(jié)果以DNAStar軟件進(jìn)行基因序列分析。

1.7 二聯(lián)RT-PCR檢測方法的建立

1.7.1 二聯(lián)PT-PCR擴(kuò)增

建立25 μL二聯(lián)RT-PCR反應(yīng)體系:7.87 μL ddH2O，5.0 μL 10×PCR Buffer，4.0 μL dNTP Mix?ture（2.5 μmol·L-1），4種引物（10 μmol·L-1）各0.5 μL，2種病毒cDNA各2.0 μL，2.0 μL MgCl2（25 μmol·L-1），0.13 μL rTaq（5 U·μL-1）；反應(yīng)條件: 94℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，54℃退火45 s，72℃延伸45 s，共30個循環(huán)，72℃終延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物及陰性對照產(chǎn)物同DL2000 Marker上樣1%瓊脂糖凝膠，電泳后經(jīng)紫外檢測儀檢測并攝片。

1.7.2 反應(yīng)體系及條件優(yōu)化

在建立的二聯(lián)RT-PCR檢測方法的基礎(chǔ)上，逐一對反應(yīng)體系dNTP濃度、引物濃度、MgCl2及退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，確立反應(yīng)體系與最適反應(yīng)條件。

1.8 二聯(lián)RT-PCR檢測方法的評價

1.8.1 特異性檢驗

分別取TGEV cDNA模板、PEDV cDNA模板、TGEV和PEDV cDNA模板及對照病毒（HCV、PRV、PRRSV、PCV、PPV）反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物執(zhí)行已建立的二聯(lián)RT-PCR反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后紫外檢測儀觀察。

1.8.2 敏感性檢驗

將TGEV和PEDV病毒cDNA模板分別做10倍梯度稀釋，執(zhí)行優(yōu)化后二聯(lián)RT-PCR反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后紫外檢測儀觀察，以呈現(xiàn)陽性反應(yīng)條帶的模板用量，推算檢出病毒TCID50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的片段的PCR擴(kuò)增

以設(shè)計的2對引物，分別與試驗中制備的2種病毒PCR模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后利用紫外檢測儀觀察結(jié)果（見圖1）。

圖1 單項PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳Fig.1 Electropherogram of production from monomial RT-PCR

由圖1可見，在DL2000 Marker的500 bp標(biāo)準(zhǔn)指示條帶上、下各有一條清晰、完整的特異性條帶。目的片段經(jīng)基因測序，TGEV P1/P2引物擴(kuò)增產(chǎn)物長度426 bp，PEDV P3/P4引物擴(kuò)增產(chǎn)物長度583 bp，達(dá)到預(yù)期效果。DNAStar軟件分析發(fā)現(xiàn)，2條目的片段核苷酸序列與相應(yīng)病毒基因組序列同源性達(dá)99%以上。

2.2 二聯(lián)PCR反應(yīng)體系與條件優(yōu)化

以試驗建立的二聯(lián)PCR程序，分別對反應(yīng)體系引物濃度、dNTP濃度、MgCl2及退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，各變量項擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后利用紫外檢測儀觀察結(jié)果，可見反應(yīng)體系TGEV引物（P1/P2）濃度在8～10 μmol·L-1范圍內(nèi)，PEDV引物（P3/P4）濃度在6～10 μmol·L-1范圍內(nèi)均可擴(kuò)增出明亮條帶，且2者濃度均為8 μmol·L-1時，目的條帶最明亮（見圖2）；dNTP濃度在14～18 μmol·L-1范圍內(nèi)均可擴(kuò)增出明亮條帶（見圖3）；MgCl2濃度在6～9 μmol·L-1范圍內(nèi)均可擴(kuò)增出明亮條帶，且濃度為9 μmol·L-1時目的條帶最為明亮（見圖4）；退火溫度在44～58℃范圍內(nèi)，均可得到較好且完整的目的片段條帶，但54℃時條帶形狀最佳（見圖5）。

2.3 二聯(lián)PCR方法特異性與敏感性檢測

用建立的方法對TGEV和PEDV混合物、TGEV、PEDV、HCV、PRV、PPV、PRRSV 7個核酸樣品進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果含有TGEV和PEDV的核酸均擴(kuò)增出與試驗設(shè)計相符的目的片段條帶，其他樣品未見擴(kuò)增（見圖6）。敏感性檢測發(fā)現(xiàn)，該方法可檢出10-7稀釋的TGEV和10-5稀釋的PEDV cDNA模板（見圖7），據(jù)此計算出可分別檢出7.3 TCID50/0.1 mL的TGEV和9.6 TCID50/0.1 mL PEDV。

圖2 引物濃度優(yōu)化電泳Fig.2 Electropherogram of concentration optimization for primers

圖3 dNTP濃度優(yōu)化電泳Fig.3 Electropherogram of concentration optimization for dNTP

圖4 MgCl2濃度優(yōu)化電泳Fig.4 Electropherogram of MgCl2concentration optimization

圖5 退火溫度的優(yōu)化電泳Fig.5 Electropherogram of optimization of annealing temperature

圖6 特異性檢測電泳Fig.6 Electropherogram of specificity detection

圖7 敏感性檢測電泳Fig.7 Electropherogram of sensitivity detection

3 討論與結(jié)論

TGEV與PEDV引起動物疾?。═GE、PED）在臨診癥狀上極為相似，常出現(xiàn)合并感染，基因組結(jié)構(gòu)上與PRCV具有較高的同源性[1,8-10]；傳統(tǒng)診斷方法很難甄別。傳統(tǒng)TGE和PED診斷方法主要有病毒中和試驗、免疫熒光法、免疫電鏡法、ELISA和RT-PCR法等，隨分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展，熒光定量PCR和RT-LAMP等方法被用于病原檢測和病毒性疾病診斷，但其操作成本較高，難于推廣[11-12]。相比于上述方法，ELISA和RT-PCR法具有敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、不易造成誤診或漏診等優(yōu)點(diǎn)[5-6]。

本試驗根據(jù)TGEV和PEDV基因組自身特點(diǎn)，針對PRCV缺失的672 bp C抗原位點(diǎn)設(shè)計引物，成功建立同時檢測TGEV和PEDV二聯(lián)RT-PCR方法。優(yōu)化過程中發(fā)現(xiàn)，該方法對反應(yīng)條件要求較低、重復(fù)性極好。結(jié)合擴(kuò)增效果和操作成本，確立最佳反應(yīng)體系為：引物濃度為8 μmol·L-1、MgCl2濃度為9 μmol·L-1、dNTP濃度為14 μmol·L-1、退火溫度為54℃。

由于該方法敏感性和特異性較高，短時間（5 h）內(nèi)可做出準(zhǔn)確診斷，可為疾病有效控制提供技術(shù)支持。盡管試驗未對臨床病料進(jìn)行檢測，但試驗得出理論檢出水平分別為TGEV 7.3 TCID50/0.1 mL、PEDV 9.6 TCID50/0.1 mL已遠(yuǎn)低于臨床樣品病毒含量。因此，該方法用于臨診病料檢測可行。

[1]Costantini V,Lewis P,Alsop J,et al.Respiratory and fecal shed?ding of porcine respiratory coronavirus(PRCV)in sentinel weaned pigs and sequence of the partial S-gene of the PRCV isolates [J].Arch Virol,2004,149(5):957-974.

[2]H?lli O,Ala-Kurikka E,Nokireki T,et al.Prevalence of and risk factors associated with viral and bacterial pathogens in farmed Eu?ropean wild boar[J].Article The Veterinary Journal,2012,194(1): 98-101.

[3]Puranaveja S,Poolperm P,Lertwatcharasarakul P,et al.Chineselike strain of porcine epidemic diarrhea virus[J].Thailand Emerg Infect Dis,2009,15:1112-1115.

[4]Usami Y,Fukai K,Ichikawa Y,et al.Virological and serological studies of porcine respiratory coronavirus infection on a Japanese farm[J].J Vet Med Sci,2008,70(9):929-936.

[5]Sozzi E,Luppi A,Lelli D,et al.Comparison of enzyme-linked immunosorbent assay and RT-PCR for the detection of porcine epidemic diarrhoeavirus[J].Research in Veterinary Science, 2010,88(1):166-168.

[6]由超,趙大球,梁乘榜,等.PCR引物設(shè)計方法綜述[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,17:48-51.

[7]Chen Y F,Chen R C,Chan Y K,et al.Design of multiplex PCR primers using heuristic algorithm for sequential deletion applica?tions[J].Computational Biology and Chemistry,2009,33(2):181-188.

[8]Lee D K,Park C K,Kim S H,et al.Heterogeneity in spike protein genes of porcine epidemic diarrhea viruses isolated in Korea[J]. Virus Research,2010,149(2):175-182.

[9]Zhang X S,Hasoksuz M,Spiro D,et al.Complete genomic se?quences,a key residue in the spike protein and deletions in non-structural protein 3b of US strains of the virulent and attenu?ated coronaviruses,transmissible gastroenteritis virus and por?cine respiratorycoronavirus[J].Virology,2007,358(2):424-435.

[10]Ba I,Jackwood D J,Benfield D A,et al.Differentiation of trans?missible gastroenteritis virus from porcine respiratory coronavirus and other antigenic ally related coronaviruses by using cDNA probes specific for the 5′region of the S glycoprotein gene[J].J Clin Microbiol,1991,29(1):215-218.

[11]張雷.豬傳染性胃腸炎病毒的診斷研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī),2010(5):59-62.

[12]莊金秋,梅建國,王金良,等.豬流行性腹瀉病毒檢測方法研究進(jìn)展[J].中國獸藥雜志,2013,47(4):65-67.

Establishment of duplex RT-PCR assay for detection of transmissible gastroenteritis virus and porcine epidemic diarrhea virus/

ZHENG Shimin1,ZHOU Shoulong1,ZHAO Liangyou2,LIU Chaonan1,GAO Xueli1,LV Xiaoping1(1.School of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.Center for Safety Evaluation of Drugs,Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China)

Arapidduplex RT-PCR assay was developed for simultaneous detection and discrimination of transmissible gastroenteritis virus(TGEV)and porcine epidemic diarrhea virus(PEDV)using the primers designed basing on their S protein gene reported in GenBank.The producedemonstrated after agarose gels electrophoresis stained with ethidium bromide that one specific cDNA band of 426 bp for TGEV and another specific cDNA band of 583 bp for PEDV up and down the 500bp indicating band.Optimization reaction system:concentration of primers,MgCl2and dNTP were 8,9 and 14 μmol·L-1,respectively,and renaturation temperature was 54℃.This method took the advantages of rapid,sensitive,specific,andlow cost,in capturing information,analyzing the complexity of gene,which could provide technical support for detection of TGEV and PEDV,and epidemiological investigation of TGE and PED,etc.

transmissible gastroenteritis virus;porcine epidemic diarrhea virus;duplex RT-PCR; reaction condition

S852.65+1

A

1005-9369（2014）06-0057-04

時間 2014-6-11 16:03:36 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140611.1603.001.html

鄭世民,周首龍,趙良友,等.豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉病毒二聯(lián)RT-PCR檢測方法的建立[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2014,45 (6):57-60.

Zheng Shimin,Zhou Shoulong,Zhao Liangyou,et al.Establishment of duplex RT-PCR assay for detection of transmissible gastroenteritis virus and porcine epidemic diarrhea virus[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(6):57-60. (in Chinese with English abstract)

2013-12-12

黑龍江省教育廳面上項目（12531015）

鄭世民（1959-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向為畜禽病理學(xué)。E-mail：zhengshiminbl@sohu.com