姜巨全，劉賀男，肖鴻禹，付曉薇，朱光宇

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

產(chǎn)甲酸草酸桿菌細(xì)胞數(shù)群體感應(yīng)系統(tǒng)基因hdtS克隆和功能分析

姜巨全，劉賀男，肖鴻禹，付曉薇，朱光宇

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

為鑒定產(chǎn)甲酸草酸桿菌（Oxalobacter formigenes）是否具有細(xì)胞數(shù)群體感應(yīng)（QS）系統(tǒng)，將費(fèi)氏弧菌（Vibrio fischeri）和熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorences）QS系統(tǒng)相關(guān)基因與產(chǎn)甲酸草酸桿菌（O.formigenes）基因組序列進(jìn)行比對(duì)，初步確定hdtS和AGPA為QS系統(tǒng)候選基因。通過(guò)PCR和T-A克隆方法分別克隆以上兩個(gè)基因并將其構(gòu)建成表達(dá)載體pET19-hdtS和pET19-AGPA，借助SDS-PAGE凝膠電泳證實(shí)以上兩個(gè)基因均在大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中高效表達(dá)，采用平板菌株報(bào)告法鑒定hdtS具有?；呓z氨酸內(nèi)酯（AHL）合成酶的功能，而AGPA則不具有該功能。這是國(guó)內(nèi)外首次報(bào)道產(chǎn)甲酸草酸桿菌（O.formigenes）中QS系統(tǒng)有關(guān)基因，對(duì)該菌株QS系統(tǒng)了解及分析影響該菌株在人腸道內(nèi)定殖因素具有重要意義。

克??；鑒定；產(chǎn)甲酸草酸桿菌；細(xì)胞數(shù)群體感應(yīng)系統(tǒng)；hdtS；AGPA

細(xì)胞數(shù)群體感應(yīng)（Quorum-sensing system,QS）效應(yīng)是細(xì)菌群體行為調(diào)控機(jī)制。QS系統(tǒng)作用機(jī)制是細(xì)菌產(chǎn)生并釋放一種自誘導(dǎo)物（Autoinducer，AI）?；呓z氨酸內(nèi)酯（Acylhomoserine lactone,AHL），當(dāng)該物質(zhì)積累到一定濃度（閾值）時(shí)，可被自身及其他細(xì)菌檢測(cè)到，誘導(dǎo)細(xì)菌中QS相關(guān)基因表達(dá)[1]。研究表明，細(xì)菌通過(guò)QS系統(tǒng)可獲得單個(gè)菌體本身無(wú)法完成的群體性生理功能[2-4]。如雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）等腸道益生菌在腸道定殖及與腸道共生作用[2-3]，病原微生物霍亂弧菌（Vibrio cholerae）對(duì)機(jī)體病原性侵染等[4]。

目前，革蘭氏陰性菌的QS系統(tǒng)根據(jù)AHL合成酶及其調(diào)控蛋白可分為3類：LuxI-LuxR系統(tǒng)[1]、LuxM-LuxN/AinS-AinR系統(tǒng)[5-7]和HdtS[8-9]。前兩類系統(tǒng)的研究比較深入詳細(xì)，均由AHL合成酶及其調(diào)控蛋白組成；第三類QS系統(tǒng)研究卻非常有限。在熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorences）中，HdtS蛋白能夠產(chǎn)生3-羥基-碳14∶1、碳10∶1或碳6∶1的3種AHL[8]。在專性嗜酸的氧化亞鐵硫桿菌（Acidi?thiobacillus ferrooxidans）中，Act蛋白與熒光假單胞菌中的HdtS有37%同源性，編碼該蛋白的act基因與編碼甘氨酸t(yī)RNA合成酶的α、β亞單位的glyQ和glyS及編碼磷酸脂酶的gph形成一個(gè)基因簇。這一基因位點(diǎn)在整個(gè)變性菌門（Proteobacteria）中具有高度保守性，基因序列一致。Act蛋白被證實(shí)編碼合成鏈長(zhǎng)為14碳AHL，后者負(fù)責(zé)調(diào)控氧化亞鐵硫桿菌（A.ferrooxidans）中Lux類型QS系統(tǒng)[9]。第三類QS系統(tǒng)僅限于AHL合成酶鑒定，但未發(fā)現(xiàn)與其相關(guān)的任何調(diào)控蛋白。

產(chǎn)甲酸草酸桿菌（Oxalobacter formigenes）是一株專性厭氧的革蘭氏陰性菌，以草酸作為唯一碳源和能源。試驗(yàn)表明，產(chǎn)甲酸草酸桿菌對(duì)降低尿中草酸濃度具有重要作用：①可通過(guò)降解食物中的草酸，減少血液從腸道食物中吸收的草酸，進(jìn)而降低尿中草酸濃度[10-11]；②可與腸道黏膜相互作用，使血液中過(guò)高的草酸向腸道反向轉(zhuǎn)運(yùn)，降低血液中草酸濃度和尿中草酸濃度[12]。臨床調(diào)查顯示，在腎結(jié)石患者腸道內(nèi)，產(chǎn)甲酸草酸桿菌定殖率明顯低于其在健康人腸道內(nèi)定殖率[12-13]。產(chǎn)甲酸草酸桿菌定殖與腎結(jié)石的再發(fā)率呈顯著負(fù)相關(guān)[14]。目前影響產(chǎn)甲酸草酸桿菌定殖的因素仍不清楚。只有少數(shù)研究報(bào)道，在腎結(jié)石患者中，該菌株的喪失與抗生素的過(guò)量服用有密切關(guān)系[15]。

既然很多腸道細(xì)菌的定殖受QS系統(tǒng)控制[2-4]，該系統(tǒng)也可能對(duì)產(chǎn)甲酸草酸桿菌的定殖同樣起到重要作用。至今尚無(wú)任何關(guān)于產(chǎn)甲酸草酸桿菌的QS系統(tǒng)的報(bào)道。因此，為鑒定該菌QS系統(tǒng)，本研究對(duì)QS系統(tǒng)中有關(guān)基因進(jìn)行克隆及功能分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)hdtS基因具有AHL合成酶功能。這是國(guó)內(nèi)外首次報(bào)道產(chǎn)甲酸草酸桿菌（O.formigenes）中QS系統(tǒng)有關(guān)基因，對(duì)增進(jìn)對(duì)該菌株QS系統(tǒng)了解及分析影響該菌株在人腸道內(nèi)定殖因素具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株與載體

產(chǎn)甲酸草酸桿菌HOxBLS和根瘤菌（Sinorhizobi?um meliloti）Rm1021來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室；根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）NTL4（pZLR4）由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)張立群教授提供，該菌株含有一個(gè)包括融合基因traI:lacZ和traR的pTiC58質(zhì)粒（慶大霉素抗性）；大腸桿菌（E.coli）DH5α、BL21、Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自全式金生物公司。原核表達(dá)載體pET19-pp-histag（氨芐霉素抗性）由美國(guó)維克森林大學(xué)W.Todd Lowther教授提供，該載體由提供者在Qiagen公司購(gòu)買的原核表達(dá)載體pET19的組氨酸殘基后，加入一個(gè)PreScission Proteinase蛋白酶的酶切位點(diǎn)。

1.1.2 主要儀器

美國(guó)Bio-Rad公司Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司PowerPac HC型電泳儀，TC-96/G/H(b)B型PCR儀，寧波新芝生物公司N&DN系列（LCD）型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，美國(guó)ThermoFisher公司Pico17離心機(jī)，上海安亭TGL-16B臺(tái)式離心機(jī)等。

1.1.3 主要藥品與試劑

氨芐青霉素、慶大霉素購(gòu)自美國(guó)AMRESCO公司；核酸和蛋白Marker、Taq DNA聚合酶、dNTPs、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購(gòu)自天根生物技術(shù)有限公司；Nde I、Bam H I均購(gòu)自Ta?KaRa公司；pEASY-T3 Simple Cloning Kit、Easy Pfu DNA polymerase、T4DNA連接酶均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

LB培養(yǎng)基（1 L）：酵母提取物5 g，蛋白胨10 g，NaCl 10 g，用5 mmol·L-1NaOH調(diào)pH至7.0。如需配制固體培養(yǎng)基，加入15 g瓊脂。大腸桿菌（E.coli）轉(zhuǎn)化子在LB平板上37℃培養(yǎng)；根癌農(nóng)桿菌（A.tumefaciens）NTL4在LB液體培養(yǎng)基中160 r·min-1、28℃培養(yǎng)24 h。

TY培養(yǎng)基（1 L）：酵母提取物3 g，蛋白胨5 g，CaCl20.6 g，用5 mol·L-1NaOH調(diào)pH至7.0。如需配制固體培養(yǎng)基，加入15 g瓊脂。根瘤菌Sm1021在液體培養(yǎng)基中160 r·min-1、28℃振蕩培養(yǎng)24 h。

AB培養(yǎng)基：5×A母液（1 L）：（NH4）2SO42 g，Na2HPO49.6 g，KH2PO43 g，NaCl 3 g，用蒸餾水定容至200 mL；1×B母液（1 L）：0.1 mol·L-1CaCl21 mL，1 mol·L-1MgCl21 mL，0.003 mol·L-1FeCl31 mL，用蒸餾水定容至800 mL，分別121℃滅菌30 min備用。配制AB培養(yǎng)基時(shí)，將200 mL 5×A與800 mL 1×B混合，并向AB培養(yǎng)基中加入終濃度為0.2%葡萄糖或0.4%醋酸鹽作為碳源。

1.2 方法

1.2.1 QS系統(tǒng)候選基因的全基因組分析

產(chǎn)甲酸草酸桿菌OXCC13（序列號(hào)ACDQ 00000000.1）和HOxBLS（序列號(hào)ACDP00000000.2）的基因組已經(jīng)被測(cè)序完成。在本研究中，借助已知的QS系統(tǒng)模式菌株費(fèi)氏弧菌(V.fischeri)的luxI/ luxR基因（序列號(hào)YP_206882.1/AAQ90196.1）、luxM/luxN基因（序列號(hào)BAF43686.1/BAF43687.1）和ainS/ainR基因（序列號(hào)YP_204420.1/YP_ 204419.1）以及熒光假單胞菌的hdtS基因（序列號(hào)AEV60042.1），與產(chǎn)甲酸草酸桿菌的基因組進(jìn)行比對(duì)，獲得QS系統(tǒng)的候選基因。

1.2.2 熱啟動(dòng)PCR擴(kuò)增基因

根據(jù)QS系統(tǒng)候選基因序列，使用Primer Pre?mier 5.0設(shè)計(jì)引物，由華大基因合成，引物序列見(jiàn)表1，其中：CATATG為Nde I酶切位點(diǎn)；GGATCC為Bam H I酶切位點(diǎn)。平末端加A之后，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的片段。

表1 hdtS與AGPA上下游引物Table 1 Upstream and downstream primers of genes hdtS and AGPA

1.2.3 T-A克隆載體構(gòu)建

按照北京全式金生物技術(shù)有限公司pEASY-T3 Cloning Kit的說(shuō)明書進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化。藍(lán)白斑法挑取菌落白色的陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR驗(yàn)證及雙酶切驗(yàn)證，基因測(cè)序由華大基因公司完成。

1.2.4 表達(dá)載體構(gòu)建

提取質(zhì)粒pET19-pp-histag和T-A克隆的重組質(zhì)粒，分別用Nde I、Bam H I進(jìn)行雙酶切（100 μL雙酶切體系：10×Buffer 10 μL，質(zhì)粒50 μL，Nde I 2 μL，Bam H I 2 μL，ddH2O 36 μL）。將雙酶切后的pET19-pp-histag及目的基因片段，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收后，16℃過(guò)夜連接（連接方法按T4DNA連接酶使用說(shuō)明書操作）。取適量連接體系，轉(zhuǎn)化大腸桿菌（E.coli）BL21感受態(tài)細(xì)胞。操作方法按大腸桿菌（E.coli）BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞使用說(shuō)明書操作。

培養(yǎng)后挑取陽(yáng)性重組子，進(jìn)行PCR及雙酶切驗(yàn)證正確后，送華大基因公司測(cè)序，最終確定hdtS與AGPA是否融合到表達(dá)載體histag的開(kāi)放閱讀框架（ORF）內(nèi)。

1.2.5 候選基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

分別過(guò)夜培養(yǎng)BL21/pET19-HdtS、BL21/pET 19-AGPA，轉(zhuǎn)接100 mL LB培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600為1.0。各取1 mL上述兩種菌液，離心收集菌體，作為誘導(dǎo)前樣品。向上述兩種培養(yǎng)液中分別添加終濃度1 mol·L-1的IPTG，37℃誘導(dǎo)表達(dá)3 h。各取1 mL上述兩種菌液，離心收集菌體，作為誘導(dǎo)后樣品。將上述兩種菌液剩余部分，離心收集菌體，用50 mmol·L-1的PBS（pH 7.2～7.4）緩沖液清洗兩次，離心，去上清，再取適量緩沖液重懸細(xì)胞（保證菌體破壁后蛋白總量與1 mL菌液的蛋白量相同），同時(shí)加入終濃度為1 mmol·L-1的PMSF，最后在冰浴中進(jìn)行超聲波破碎至菌液澄清（超聲波的具體參數(shù)為10%Hz，工作時(shí)間20 min，每次超聲1 s，間隔時(shí)間1.5 s）。取破碎液，離心，收集上清及沉淀。上清作為可溶性蛋白樣品，沉淀用等體積的緩沖液重懸，作為不可溶性蛋白樣品。以上所有樣品進(jìn)行SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳檢測(cè)。

1.2.6 AHL合成酶的平板菌株報(bào)告法

分別將根癌農(nóng)桿菌NTL4、根瘤菌Rm1021、BL21/pET19-HdtS、BL21/pET19-AGPA和BL21/ pET19-pp-histag分別接入AB基本培養(yǎng)基（X-gal終濃度為40 μg·mL-1）中，28℃恒溫培養(yǎng)后觀察菌落周圍顏色是否變藍(lán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 QS系統(tǒng)候選基因的確定

如表2所示，在兩株產(chǎn)甲酸草酸桿菌的基因組中，沒(méi)有任何序列與ainS/ainR基因具有同源性；而一些序列分別與luxI/luxR基因、luxM/luxN基因具有非常低的同源性（4.6%～15.8%）；然而，一個(gè)編碼推測(cè)的1-?；?sn-甘油-3-磷酸轉(zhuǎn)移酶（Puta?tive 1-acyl-sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase）的基因（在HOxBLS中的序列號(hào)為OFAG_01224）與熒光假單胞菌的hdtS具有高度同源性（分別為36.0%和36.7%）。

研究發(fā)現(xiàn)，該基因不僅與熒光假單胞菌的hdtS高度同源，而且與目前被鑒定的氧化亞鐵硫桿菌中的編碼HdtS型AHL合成酶的act基因也高度同源（見(jiàn)圖1）。此外，產(chǎn)甲酸草酸桿菌中hdtS基因與編碼甘氨酸t(yī)RNA合成酶的α、β亞單位的glyQ和glyS以及編碼磷酸脂酶的gph形成一個(gè)基因簇（見(jiàn)圖2），這與氧化亞鐵硫桿菌中的act基因與編碼甘氨酸t(yī)RNA合成酶的α、β亞單位的glyQ和glyS及編碼磷酸脂酶gph形成的基因簇的基因順序也高度一致。因此，推測(cè)編碼1-酰基-sn-甘油-3-磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因很可能就是產(chǎn)甲酸草酸桿菌中編碼HdtS類的QS系統(tǒng)候選基因，定名為hdtS。

表2 產(chǎn)甲酸草酸桿菌HOxBLs及OXCC13的群體感應(yīng)系統(tǒng)基因組學(xué)分析Table 2 Genomic analyses for quorum sensing systems ofOxalobacter formigenesHOxBLS and OXCC13

圖1 hdtS和AGPA的推測(cè)氨基酸序列及其與同源物的同源性比對(duì)Fig.1 Deduced amino acid sequences of hdtS and AGPA,together with alignment between them and their homologs

圖2 HOxBLS的hdtS基因及其上下游序列形成的基因簇結(jié)構(gòu)Fig.2 Mapping of hdtS and its upstream and downstream sequences from O.formigenes HOxBLS

在基因組分析過(guò)程中，還意外發(fā)現(xiàn)另一個(gè)基因（序列號(hào)OFAG_01272）也被推測(cè)為編碼1-?；?sn-甘油-3-磷酸轉(zhuǎn)移酶，該基因編碼蛋白與熒光假單胞菌hdtS蛋白（41.7%）、氧化亞鐵硫桿菌中Act蛋白（36.7%）及上述HdtS蛋白（19.7%）均具有一定同源性（見(jiàn)圖1C）。選擇AGPA作為另一個(gè)AHL合成酶的候選基因，將其定名為AGPA（putative 1-acyl-sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase）。基因hdtS和AGPA的核苷酸序列和推測(cè)蛋白序列如圖1A、B。

2.2 QS系統(tǒng)候選基因克隆載體和表達(dá)載體的構(gòu)建

以產(chǎn)甲酸草酸桿菌HOxBLS基因組DNA為模板，使用PCR分別擴(kuò)增hdtS與AGPA基因，并通過(guò)T-A克隆方法將PCR產(chǎn)物克隆到pEASY-T3載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞得到陽(yáng)性克隆，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證二者均與原序列一致。為驗(yàn)證這兩個(gè)基因是否具有AHL合成酶功能，將hdtS與AGPA構(gòu)建到表達(dá)載體pET19-pp-histag中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌（E.coli）BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR擴(kuò)增、雙酶切及測(cè)序驗(yàn)證，hdtS與AGPA均成功融合到表達(dá)載體histag的開(kāi)放閱讀框架（ORF）內(nèi)。轉(zhuǎn)入表達(dá)載體大腸桿菌（E.coli）BL21（DE3），分別命名為BL21/pET19-hdtS和BL21/pET19-AGPA。

2.3 pET19-hdtS及pET19-AGPA在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

為鑒定hdtS與AGPA是否表達(dá)，分別對(duì)BL21/ pET19-hdtS與BL21/pET19-AGPA進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)，并在誘導(dǎo)前后取樣，將樣品與相應(yīng)細(xì)胞破碎后的上清和沉淀樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。如圖3所示，BL21/pET19-hdtS與BL21/pET19-AGPA在35 ku附近均出現(xiàn)一條明顯的粗帶，與預(yù)測(cè)hdtS或AGPA蛋白分子質(zhì)量（34 ku）接近，表明hdtS與AG?PA基因在大腸桿菌（E.coli）BL21（DE3）中被高效誘導(dǎo)表達(dá)。此外，在BL21/pET19-hdtS或BL21/ pET19-AGPA細(xì)胞破碎后的上清液中也出現(xiàn)同樣大小且濃度相近的粗帶（見(jiàn)圖3），表明誘導(dǎo)表達(dá)的hdtS或AGPA蛋白大部分可溶，說(shuō)明在大腸桿菌（E.coli）BL21（DE3）中異源表達(dá)后，hdtS或AGPA蛋白應(yīng)該正確折疊且具有活性。

圖3 hdtS與AGPA在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白可溶性分析Fig.3 Expression and solubility analysis of hdtS and AGPA in E.coli BL21

2.4 hdtS及AGPA的功能分析

使用平板菌株報(bào)告法，驗(yàn)證BL21/pET19-hdtS及BL21/pET19-AGPA是否具有AHL合成酶功能。報(bào)告菌株根癌農(nóng)桿菌NTL4含1個(gè)包括融合基因traI：lacZ和traR的pTiC58質(zhì)粒，如果受測(cè)試菌株產(chǎn)生AHL，而AHL又可以由胞內(nèi)向胞外分泌，這樣就可以通過(guò)AHL誘導(dǎo)該質(zhì)粒lacZ的表達(dá)，從而降解X-gal而使平板上的菌落周圍產(chǎn)生藍(lán)色圓圈。根瘤菌Rm1021自身可以產(chǎn)生AHL，故被用作正對(duì)照檢測(cè)試驗(yàn)體系正確與否。如圖4中所示，在根瘤菌（Rm1021周圍產(chǎn)生藍(lán)色菌圈，說(shuō)明試驗(yàn)體系正確。BL21/pET19-pp-histag和BL21/pET19-AGPA周圍并沒(méi)有產(chǎn)生藍(lán)色菌圈，而BL21/pET19-hdtS周圍卻產(chǎn)生明顯的藍(lán)色菌圈。由此可以證明hdtS蛋白確實(shí)具有AHL合成酶功能，而AGPA蛋白并不具有該功能。

圖4 平板菌株報(bào)告法檢測(cè)AHL合成酶活性Fig.4 Identification of an AHL synthase using a reporter strain Agrobacterium tumefaciens NTL4

3 討論與結(jié)論

至今為止，沒(méi)有任何產(chǎn)甲酸草酸桿菌的QS系統(tǒng)有關(guān)基因報(bào)道。本研究首次克隆該菌hdtS類的QS系統(tǒng)基因并對(duì)基因功能進(jìn)行鑒定。借助生物信息學(xué)方法，將已知的QS系統(tǒng)基因與產(chǎn)甲酸草酸桿菌的基因組進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)HOxBLS中存在一個(gè)編碼推測(cè)的1-酰基-sn-甘油-3-磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因與hdtS基因高度同源，通過(guò)對(duì)該基因的克隆與功能分析，最終確定該基因是產(chǎn)甲酸草酸桿菌中hdtS類的QS系統(tǒng)基因。

目前普遍使用AHL檢測(cè)方法是生物學(xué)方法，即平板菌株報(bào)告法[2-4]。本研究中，根癌農(nóng)桿菌NTL4作為報(bào)告菌株，在一定濃度X-gal存在的平板上，能快速、且直觀地檢測(cè)到菌落周圍是否顯示藍(lán)色，從而證明所克隆基因是否編碼AHL[2-4]。通過(guò)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)HdtS蛋白確實(shí)具有AHL合成酶功能。在對(duì)hdtS基因鑒定的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)AGPA與前者具有一定同源性，但通過(guò)功能分析，確定后者不具有AHL合成酶功能。

對(duì)細(xì)菌中AHL進(jìn)行選擇性定量檢測(cè)方法為氣譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）法。該方法可評(píng)估不同生長(zhǎng)階段AHL產(chǎn)生模式[6]，對(duì)檢測(cè)表達(dá)多種獨(dú)立信號(hào)系統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)物中的AHL在量上變化更為有效[7-8]，可進(jìn)一步研究確定其生物合成途徑及AHL獨(dú)特細(xì)胞交流功能[1-2,9]，在對(duì)群體感應(yīng)系統(tǒng)信號(hào)分子研究中應(yīng)用廣泛[1-2]。在平板菌株報(bào)告法結(jié)論基礎(chǔ)上，后續(xù)研究將對(duì)BL21/pET19-hdtS細(xì)菌培養(yǎng)提取物進(jìn)行GC-MS檢測(cè)，進(jìn)一步證明其具有AHL合成酶功能，確定HdtS具體合成AHL種類和不同生長(zhǎng)階段AHL變化動(dòng)態(tài)。

[1]Waters C M,Bassler B L.Quorum sensing:Cell-to-cell communi?cation in bacteria[J].AnnuRev Cell Dev Biol,2005,21:319-346.

[2]Sturme,M H,Franke C,Siezen R J,et al.Making sense of quo?rum sensing in Lactobacilli:A special focus on Lactobacillus plan?tarum WCFS[J].Microbiology,2007,153:3939-3947.

[3]Mitsuma T,Odajima H,Momiyama Z,et al.Enhancement of gene expression by a peptide p(CHWPR)produced by Bifidobacterium lactis BB-12[J].Microbiol Immunol,2008,52:144-155.

[4]Hammer B K,Bassler B L.Quorum sensing controls biofilm for?mation in Vibrio cholerae[J].Mol Microbiol,2003,50:101-104.

[5]Bass ler B L,Wright M,Showalter R E,et al.Intercellular signal?ling in Vibrio harveyi:Sequence and function of genes regulat?ing expression of luminescence[J].Mol Microbiol,1993(9):773-786.

[6]Milton D L,Chalker V J,Kirke D,et al.The LuxM Homologue VanM from Vibrio anguillarum directs the synthesis of N-(3-Hy?droxyhexanoyl)homoserine Lactone and N-hexanoyl-homoser?ine Lactone[J].J Bacteriol,2001,183:3537-3547.

[7]Gilson L,Kuo A,Dunlap P V.AinS and a new family of autoin?ducer synthesis proteins[J].J Bacteriol,1995,177:6946-6951.

[8]Laue B E,Jiang Y,Chhabra S R,et al.The biocontrol strain Pseu?domonas fluorescens F113 produces the Rhizobium small bacterio?cin,N-(3-hydroxy-7-cis-tetradecenoyl)homoserine lactone,via HdtS,a putative novel N-acylhomoserine lactone synthase[J].Mi?crobiology,2000,146:2469-2480.

[9]Rivas M,Seeger M,Jedlicki E,et al.Second acyl homoserine lac?tone production system in the extreme acidophile Acidithiobacil?lus ferrooxidans[J].Appl Environ Microbiol,2007,73:3225-3231.

[10]Mittal R D,Kumar R,Mittal B,et al.Stone composition,metabol?ic profile and the presence of the gut-inhabiting bacterium Oxalo?bacter formigenes as risk factors for renal stone formation[J].Med Princ Pract,2003(12):208-213.

[11]Mikami K,Akakura K,Takel K,et al.Association of absence of intestinal oxalate degrading bacteria with urinary calcium oxalate stone formation[J].Int J Urol,2003,10:293-296.

[12]Troxel S A,Sidhu H,Kaul P,et al.Intestinal Oxalobacter formi?genes colonization in calcium oxalate stone formers and its rela?tion to urinary oxalate[J].J Endourol,2003,17:173-176.

[13]Kwak C,Jeong B C,Kim H K,et al.Molecular epidemiology of fe?cal Oxalobacter formigenes in healthy adults living in Seoul,Ko?rea[J].J Endourol,2003,17:239-243.

[14]Kaufman D W,Kelly J P,Curhan G C,et al.Oxalobacter formi?genes may reduce the risk of calcium oxalate kidney stones[J].J Am Soc Nephrol,2008,19:1197-1203.

[15]Kharlamb V,Schelker J,Francois F,et al.Oral antibiotic treat?ment of Helicobacter pylori leads to persistently reduced intestinal colonization rates with Oxalobacter formigenes[J].J Endourol, 2011,25:1781-1785.

Cloning and identification ofhdtSgene fromOxalobacter formigenes encoding an acylhomoserine lactone synthase of quorum-sensingsystem/

JIANG Juquan,LIU Henan,XIAO Hongyu,FU Xiaowei,ZHU Guangyu（School of Life Sciences,NortheastAgricultural University,Harbin 150030,China)

To identify the quorum-sensing system(QS)genes inOxalobacter formigenes,QS-related genes fromVibrio fischeriandPseudomonas fluorenceswere aligned with the genome sequence ofO. formigenes.The geneshdtSandAGPAwere chosen as the candidate QS-related genes,cloned by PCR into the vector pEASY-T3,and constructed into pET19-pp-histag.The resulting expression vectors designated pET19-hdtS and pET19-AGPA were transformed intoEscherichia coliBL21(DE3),respectively, followed by the induction by IPTG.SDS-PAGE showed that the genes hdtS and AGPA were over-expressed inE.coliBL21(DE3).ThehdtSgene,butAGPAnot,was finally established to encode an acylhomoserine lactone(AHL)synthaseviaan AHL reporter strain,Agrobacterium tumefaciensNTIA(pZLR4)through the double-agar diffusion method.To the best of our knowledge,this is the first report on the cloning andidentification of the QS-realted gene fromO.formigenes,which is very helpful for better understanding of the quorum sensing system ofO.formigenesand analysis of impact factors of its colonization in human intestines.

cloning;identification;Oxalobacter formigenes;quorum-sensing system;hdtS;AGPA

Q933；Q751

A

1005-9369（2014）06-0049-08

時(shí)間 2014-6-11 16:17:57 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140611.1617.017.html

姜巨全,劉賀男,肖鴻禹,等.產(chǎn)甲酸草酸桿菌細(xì)胞數(shù)群體感應(yīng)系統(tǒng)基因hdtS克隆和功能分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45 (6):49-56.

Jiang Juquan,Liu Henan,Xiao Hongyu,et al.Cloning and identification ofhdtSgene fromOxalobacter formigenesencoding an acylhomoserine lactone synthase of quorum-sensing system[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45 (6):49-56.(in Chinese with English abstract)

2014-04-02

黑龍江省自然科學(xué)基金留學(xué)項(xiàng)目（LC201025）；教育部留學(xué)回國(guó)人員基金項(xiàng)目（2012940）；哈爾濱市科技創(chuàng)新人才項(xiàng)目（2012RFLXN004）

姜巨全（1977-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)榉肿游⑸飳W(xué)與生物技術(shù)制藥。E-mail：jjqdainty@163.com.