劉 瑛，陳景勇，黃勁松，黃彩珠，何 梅，歐文星

(1. 清遠(yuǎn)華能制藥有限公司，廣東 清遠(yuǎn) 511517;2. 清遠(yuǎn)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 清遠(yuǎn) 511510)

腸寧膠囊由扭肚藤、火炭母、石榴皮三味中藥制得，可用于治療胃腸炎、消化不良、腹痛痢疾等疾病。其中扭肚藤、火炭母的主要功效是清熱利濕、止痛止瀉，石榴皮的主要功效為澀腸止瀉，三藥合用具有良好的止瀉止痛作用［1，2］。胃腸寧方為民間驗(yàn)方，傳統(tǒng)使用方法是加水煎煮成湯劑直接服用，使用不便，不易保存。本課題組采用水提醇沉工藝提取其內(nèi)有效成分，加入淀粉等輔料，制得胃腸寧膠囊，使用攜帶方便，符合中藥“三效三小五方便”的發(fā)展原則。胃腸寧膠囊中扭肚藤為君藥，東莨菪內(nèi)酯為其主要藥效成分［3］。為有效控制胃腸寧膠囊的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以提取液中東莨菪內(nèi)酯的含量和干膏得率為評價指標(biāo)，對膠囊提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。

1 儀器與試藥

230 系列高效液相色譜儀(大連依利特分析儀器有限公司，DG230－4 在線脫氣機(jī)、LU230 低壓梯度混合器、P230 高壓恒流泵、UV230+紫外－可見檢測器及EC2000 工作站);KQ－500 型超聲儀(上海恒平科學(xué)儀器有限公司);RE－52 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);半自動膠囊填充板(吉首市中誠制藥機(jī)械廠)。

扭肚藤、火炭母、石榴皮均購自廣州至信藥業(yè)有限公司(批號分別為20131212，20131225，20131220);東莨菪內(nèi)酯對照品購自中國藥品生物制品檢定所(批號11538－201201);乙腈(色譜純，美國Fisher公司);其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 東莨菪內(nèi)酯HPLC 分析方法的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱Diaomonsil C18色譜柱(250 ×4.6mm，5μm)，ODS 預(yù)柱;流動相乙腈－0.2%磷酸水(15:85);流速1.0mL·min－1;檢測波長346nm;柱溫30℃;進(jìn)樣量20μ L。

2.1.2 溶液的配制 對照品溶液的制備:取東莨菪內(nèi)酯對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加甲醇制成0.502mg·mL－1的對照品儲備液備用。供試品溶液的制備:精密吸取胃腸寧提取液5mL，加甲醇5mL，精密稱重，超聲20min，取出放冷，稱定質(zhì)量，甲醇補(bǔ)足損失質(zhì)量，用0.45μm 微孔濾膜過濾，濾液即為供試品溶液。

2.1.3 線性關(guān)系考察 精密吸取東莨菪內(nèi)酯對照品儲備液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL，用甲醇稀釋定容至10mL 量瓶中，得系列對照品溶液。按上述色譜條件進(jìn)行測定，以東莨菪內(nèi)酯的峰面積(Y)對其濃度(X)進(jìn)行線性回歸，回歸方程Y=44.327X+1.1957，r =0.9997。結(jié)果表明:東莨菪內(nèi)酯在5.02 ～40.16μg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.4 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一濃度的對照品溶液(濃度為30.12μg·mL－1)，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6 次，峰面積的RSD 為1.4%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一胃腸寧提取液，按“2.1.2”的方法制成供試品溶液，在上述色譜條件下，分別于0、2、4、6 和8h 進(jìn)樣分析，峰面積的RSD 為1.6%，表明供試品溶液在8h 內(nèi)穩(wěn)定。2.1.6 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 精細(xì)吸取同一胃腸寧提取液6 份，按“2.1.2”的方法制成供試品溶液，進(jìn)樣，計(jì)算供試品中東莨菪內(nèi)酯的含量，RSD 為1.8%，表明本法重現(xiàn)性良好。

2.1.7 加樣回收實(shí)驗(yàn) 精密吸取已知東莨菪內(nèi)酯含量的胃腸寧提取液6 份，置三角瓶中，分別精密加入對照品50μg，按“2.1.2”的方法制成供試品溶液，進(jìn)樣測定，計(jì)算東莨菪內(nèi)酯平均回收率為98.56%，RSD 為1.3% (n=6)。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.2.1 因素與水平的確立

根據(jù)處方中藥物性質(zhì)及預(yù)經(jīng)驗(yàn)結(jié)果，以干膏得率和提取液中東莨菪內(nèi)酯的含量為評價指標(biāo)，選擇煎煮次數(shù)，煎煮時間，加水量，醇沉濃度為考察因素對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化［4］。各因素設(shè)計(jì)3 水平，因素水平表見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

2.2.2 正交樣品溶液的制備

按L9(34)正交試驗(yàn)表進(jìn)行水提醇沉處理，具體工藝流程如下:原處方藥材→加水煎煮→水提液→濃縮至一定體積→醇沉→減壓過濾→濾液回收乙醇→濃縮→定容至50mL→得9 份樣品溶液。

2.2.3 干膏得率的測定

參照《中國藥典》2010 年版一部(附錄XA)浸出物測定法［5］，精密吸取正交試驗(yàn)所得的藥液10mL，分別置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿(設(shè)重量為W1)中，水浴揮干，殘?jiān)?05℃干燥3h，取出，置干燥器中冷卻30min，迅速精密稱定重量(重量為W2)，通過以下公式計(jì)算干膏得率。

2.2.4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

評分標(biāo)準(zhǔn):綜合評分=干膏得率×30% +東莨菪內(nèi)酯含量×70%。

表3 干膏得率方差分析

表4 東莨菪內(nèi)酯含量方差分析

表5 綜合分析方差分析

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，影響干膏得率的因素依次為A ＞D ＞C ＞B，影響東莨菪內(nèi)酯含量提取效率的因素依次為A ＞B ＞D ＞C，通過方差分析表可知，提取次數(shù)對東莨菪內(nèi)酯含量的影響有顯著性影響，綜合干膏得率和東莨菪內(nèi)酯含量最優(yōu)的提取工藝為A3B1C2D2，即為煎煮3 次，每次1h，加10 倍量水，醇沉濃度為60%。將此最佳提取工藝與醇沉工藝，重復(fù)試驗(yàn)3 次，結(jié)果見表6。

由表6 可知，干膏得率均值為7.45%，東莨菪內(nèi)酯含量均值為52.35μg/mL，說明該提取工藝條件基本穩(wěn)定，具有重現(xiàn)性。

表6 提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

胃腸寧原方為湯劑，由扭肚藤、火炭母、石榴皮加水煎煮制得，故胃腸寧膠囊的提取也選擇了加水煎煮，但研究發(fā)現(xiàn)直接煎煮濃縮得到的浸膏含有較多的鞣質(zhì)、蛋白質(zhì)、糖類等，粘度太大，制粒需輔料較多，為純化提取物，本課題采用了水提醇沉工藝。通過對胃腸寧膠囊提取工藝的正交篩選，確定最優(yōu)的提取工藝為加10 倍量水，煎煮3 次，每次1h，醇沉濃度為60%，經(jīng)驗(yàn)證本工藝穩(wěn)定可行。

東莨菪內(nèi)酯的含量測定中流動相的選擇曾考察了甲醇－水、乙腈－水、甲醇－乙腈－磷酸水、乙腈－磷酸水、甲醇－磷酸水等多個系統(tǒng)多個比例，最終確定乙腈－0.2%磷酸水(15:85)時，東莨菪內(nèi)酯與各雜質(zhì)峰能達(dá)到較好分離(分離度大于1.5)，峰形較好，滿足含量測定要求。

［1］李沛波，王永剛，彭維，等. 復(fù)方扭肚藤膠囊對實(shí)驗(yàn)性腹瀉的影響［J］. 中國中藥雜志，2008，33(3):323－325

［2］李沛波，王永剛，彭維，等. 復(fù)方扭肚藤膠囊鎮(zhèn)痛、抗炎作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］. 中藥材，2008，31(1):118－120

［3］彭維，王小銳，王永剛，等.HPLC 測定扭肚藤藥材中東莨菪素的含量［J］. 中藥材，2007，30(5):562－563

［4］馬燕，韓剛，張曉鵬，等. 正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選栝樓根膠囊提取工藝的研究［J］. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(9):4－6

［5］國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典:2010 年版(一部)［S］. 中國醫(yī)藥科出版社，2010:附錄62