徐清斌， 袁婭妮， 王 洋， 劉俊梅， 買淑霞， 熊愛(ài)琴， 馬 萍， 鄭 萍，戴貴東

(1. 寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，寧夏銀川750004;2. 寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，寧夏銀川750004;3. 銀川市口腔醫(yī)院藥劑科，寧夏銀川750001;4. 凱里學(xué)院化學(xué)與材料工程學(xué)院，貴州凱里556011)

氧化苦參堿(oxymatrine)別名苦參素，是寧夏特色回藥材苦豆子Sophora alopecuroides L. 中提取的一種喹諾哩西啶類結(jié)構(gòu)生物堿［1］。具有抗心律失常、抗病毒和抗腫瘤等多種藥理作用［1］。其對(duì)心血管也具顯著作用［1-2］，氧化苦參堿可對(duì)冠脈結(jié)扎所致大鼠急性心肌梗死具有保護(hù)作用，逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)［3］。心肌肥厚是心臟對(duì)增加的工作負(fù)荷的一種適應(yīng)性反應(yīng)，是慢性心力衰竭的重要病理特征。研究表明，心力衰竭時(shí)心血管系統(tǒng)內(nèi)皮功能障礙導(dǎo)致內(nèi)皮素(ET-1)與一氧化氮(NO)平衡失調(diào)，ET-1 增加可使血管分布的組織血流明顯減少，持續(xù)高水平的ET-1可導(dǎo)致心肌肥厚、心室重構(gòu)［4-5］;而心力衰竭時(shí)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)減少可使內(nèi)源性NO 合成減少，內(nèi)皮細(xì)胞依賴的舒血管作用減弱，加重心力衰竭［6-7］。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)探討氧化苦參堿是否是通過(guò)恢復(fù)血清ET-1 和NO 水平，調(diào)節(jié)心肌組織NO 水平和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表達(dá)，從而抑制慢性心力衰竭大鼠的心肌肥厚，進(jìn)一步闡述氧化苦參堿抑制慢性心力衰竭的機(jī)制。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 氧化苦參堿(寧夏紫荊花藥業(yè)有限公司提供，批號(hào)20091028);異丙腎上腺素(ISO) (上海梯西愛(ài)有限公司提供，批號(hào)MVSTF-NF);內(nèi)皮素(ET-1)酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測(cè)試劑盒(武漢華美試劑有限公司提供);組織一氧化氮(NO)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所提供);全蛋白提取試劑盒及BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物科技有限公司提供);兔抗山羊eNOS 一抗(Abcam 公司提供);小鼠抗β-actin 抗體、山羊抗兔二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)公司提供)［8］。

1.2 主要儀器 H1850R 型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司);TY96-ⅡN 型超生細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司);Mutiskan Go 多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)賽默飛世爾儀器公司);蛋白凝膠電泳儀(美國(guó)伯樂(lè)公司);凝膠成像系統(tǒng)(上海培清科技有限公司，型號(hào)培清JS-860B)［8］。

1.3 動(dòng)物 健康雄性SD 大鼠，體質(zhì)量(230 ±20)g，合格證為SCXK (寧)2012-0001，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［8］。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥 大鼠40 只，隨機(jī)分成5 組，分別為正常對(duì)照組、單用氧化苦參堿100 mg/kg 組、異丙腎上腺素模型組(ISO)、氧化苦參堿100 mg/kg 組和氧化苦參堿50 mg/kg 組。根據(jù)文獻(xiàn)［8-10］，ISO 模型組和氧化苦參堿各組，皮下多點(diǎn)給予5 mg/(kg·d)ISO，連續(xù)7 d，正常對(duì)照組及單用氧化苦參堿組皮下給予等體積生理鹽水，且皮下注射ISO 均在灌胃給藥1 h 前進(jìn)行，單用氧化苦參堿組和氧化苦參堿各組于ISO 注射前，提前7 d 灌胃氧化苦參堿，共計(jì)14 d，正常對(duì)照組和ISO 組給予相應(yīng)體積生理鹽水灌胃［8］。

2.2 心肌肥厚指數(shù)的檢測(cè) 各組動(dòng)物在取血后立即處死，開(kāi)胸取心臟，于4 ℃生理鹽水清洗，剝離整個(gè)心臟，數(shù)字分析天平稱取全心質(zhì)量(HW，Heart weight);沿冠狀溝方向分離并稱重左心室質(zhì)量(LVW，left ventricular weight)。計(jì)算全心質(zhì)量/體質(zhì)量(HW/BW，mg/g)及左心室質(zhì)量/體質(zhì)量(LVW/BW，mg/g)比值。

2.3 心肌組織病理觀察和統(tǒng)計(jì) 切取部分心尖，10%中性甲醛固定后逐級(jí)乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，取4 μm 厚切片，行HE 染色，100 倍光鏡下觀察。將心肌病理?yè)p傷分為4 等級(jí)，分別為未見(jiàn)異常(-)、輕度損傷(+)、中度損傷(+ +)和重度損傷(+ + +)［8，11］。記錄心肌病理?yè)p傷不同等級(jí)大鼠的只數(shù)。

2.4 血清中ET-1、NO 水平及心肌組織中NO 測(cè)定 從-70 ℃冰箱取待測(cè)血清，按照ELISA 試劑盒廠家說(shuō)明書操作，檢測(cè)ET-1 和NO 水平。從-70 ℃冰箱取待測(cè)心肌組織100 mg，經(jīng)液氮研磨，加入0.89% 生理鹽水超聲勻漿，4 ℃離心機(jī)2 500 r/min 離心15 min 取上清，嚴(yán)格按廠家說(shuō)明檢測(cè)心肌組織NO 的水平。

2.5 Western blot 分析心肌組織eNOS 的表達(dá) 提取心肌組織蛋白并定量為6.25 μg/mL，加入SDS-PAGE 上樣緩沖液使終質(zhì)量濃度調(diào)至5 μg/mL，煮沸10 min，3 000 r/min 離心1 min 混勻。取變性后的蛋白60 μg 在7.5%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離(SDS-PAGE)。電泳后采用濕法轉(zhuǎn)膜，將條帶轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶封閉液室溫下孵育1 h 后分別用一抗(eNOS，1 ∶300 稀釋)和β-actin (1 ∶1 000 稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜，PBS-T 洗膜3 次后分別加入二抗山羊抗兔(1 ∶3 000)和兔抗小鼠(1 ∶5 000)室溫孵育2 h，PBS-T 洗膜4 次后，取出硝酸纖維素膜加入化學(xué)發(fā)光劑顯色，曝光膠片，條帶以目的蛋白與相關(guān)β-actin 光密度比表示，結(jié)果采用培清JS-860B 凝膠成像系統(tǒng)半定量分析。

2.6 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 11.5 軟件，計(jì)量資料組間比較采用One-way ANOVA 分析。等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)［編秩，確定秩次范圍，計(jì)算平均秩次(mean rank)］。數(shù)據(jù)以±s 表示，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠心肌肥厚指數(shù) 與正常對(duì)照組比較，單用氧化苦參堿組大鼠HW/BW 和LVW/BW 無(wú)顯著性差異。ISO組大鼠HW/BW 和LVW/BW 與正常對(duì)照組相比顯著增大(P ＜0.01)，氧化苦參堿(100 和50 mg/kg)組HW/BW和LVW/BW 均下降(P ＜0.01)。提示氧化苦參堿可改善ISO 致大鼠的心肌肥厚。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 氧化苦參堿對(duì)ISO 致心力衰竭大鼠HW/BW 和LVW/BW 的影響(±s，n=8)

表1 氧化苦參堿對(duì)ISO 致心力衰竭大鼠HW/BW 和LVW/BW 的影響(±s，n=8)

注:與正常對(duì)照組比，＊＊P ＜0.01;與ISO 模型組比，#P ＜0.05，##P ＜0.01

組別 劑量/(mg·kg -1)初始體質(zhì)量/g終末體質(zhì)量(BW)/g全心質(zhì)量(HW)/g左心室質(zhì)量(LVW)/g HW/BW/(mg·g -1)LVW/BW/(mg·g -1)正常對(duì)照單用氧化苦參堿—230.1 ±12.6 231.1 ±12.3 314.6 ±30.7 322.9 ±32.3 1.04 ±0.08 1.06 ±0.08 0.69 ±0.05 0.72 ±0.07 3.31 ±0.22 3.31 ±0.31 2.22 ±0.21 2.24 ±0.21 ISO 5 230.6 ±10.4 287.8 ±23.4 ＊＊ 1.49 ±0.10 ＊＊ 1.00 ±0.06 ＊＊ 5.08 ±0.15 ＊＊ 3.41 ±0.19 ＊＊ISO+氧化苦參堿 100 236.1 ±10.6 291.8 ±15.9 1.38 ±0.09 # 0.93 ±0.06 # 4.71 ±0.14 ## 3.19 ±0.16 ##50 232.8 ±13.3 300.5 ±13.9 1.39 ±0.07 # 0.96 ±0.07 4.78 ±0.24 ## 3.15 ±0.19 100##

3.2 各組大鼠心肌組織病理的改變 光鏡下觀察HE 染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組和單用氧化苦參堿組大鼠心肌纖維排列整齊，細(xì)胞核染色清晰;ISO 組心肌纖維紊亂，纖維化嚴(yán)重，少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，僅見(jiàn)少量正常心肌細(xì)胞;氧化苦參堿干預(yù)組病理改變優(yōu)于ISO 組，介于正常對(duì)照組和ISO組之間，尤以氧化苦參堿(100 mg/kg)組改善情況最為明顯。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比較，單用氧化苦參堿組秩次無(wú)顯著差異(P ＞0.05)，而與ISO 組秩次存在顯著性差異(P ＜0.01);氧化苦參堿各組與ISO 組比較秩次均存在顯著性差異(P ＜0.05)。說(shuō)明氧化苦參堿能減輕ISO 致心衰大鼠的心肌損傷［8］。結(jié)果見(jiàn)表2 和圖1。

表2 各組大鼠心肌組織病理分級(jí)的影響(±s，n=8)

表2 各組大鼠心肌組織病理分級(jí)的影響(±s，n=8)

注:與正常對(duì)照組相比，＊＊P ＜0.01;與ISO 組相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01

組別 劑量/(mg·kg -1)心肌病理改變平均秩次正常對(duì)照 —- + + + + + +8 0 0 0 8.5單用氧化苦參堿 100 8 0 0 0 8.5 ISO 5 0 0 2 6 34.88＊＊ISO+氧化苦參堿 100 0 4 4 0 24.25##50 0 3 4 1 26.38#

圖1 各組大鼠心肌組織病理變化的觀察(HE 染色400×)

3.3 各組大鼠血清ET-1、NO 和心肌組織NO 水平 與正常對(duì)照組相比較，單用氧化苦參堿組血清ET-1、NO 水平和心肌組織NO 水平無(wú)顯著性差異。ISO 組血清ET-1、NO水平顯著增高(P ＜0.01)，心肌組織NO 水平明顯降低(P ＜0.05);與ISO 組比較，氧化苦參堿 (100 和50 mg/kg)組ET-1 水平降低(P ＜0.01)，而心肌組織NO 水平升高(P ＜0.05)，但對(duì)升高的血清NO 水平無(wú)影響(P ＞0.05)。提示氧化苦參堿對(duì)心力衰竭大鼠損傷的內(nèi)皮功能具有保護(hù)作用。結(jié)果見(jiàn)表3。

3.4 各組大鼠心肌組織eNOS 的表達(dá) 與正常對(duì)照組比較，單用氧化苦參堿組心肌組織eNOS 表達(dá)無(wú)顯著差異，ISO 組大鼠心肌eNOS 的表達(dá)顯著降低(P ＜0.01)。氧化苦參堿各組eNOS 表達(dá)與ISO 組比較顯著升高(P ＜0.05)。提示氧化苦參堿可通過(guò)提高心肌組織eNOS 表達(dá)而增加心肌NO 水平。結(jié)果見(jiàn)圖2 和圖3。

表3 氧化苦參堿對(duì)ISO 誘導(dǎo)的心力衰竭大鼠ET-1 和NO 水平的影響(±s，n=8)

表3 氧化苦參堿對(duì)ISO 誘導(dǎo)的心力衰竭大鼠ET-1 和NO 水平的影響(±s，n=8)

注:與正常對(duì)照組相比，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與ISO 組相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01

組別 劑量/(mg·kg -1) 血清ET-1/(pg·mL -1) 血清NO/(pg·mL -1) 心肌組織NO/(μmol·gprot -1)正常對(duì)照單用氧化苦參堿—0.33 ±0.05 0.28 ±0.06 ISO 5 88.55 ±5.35 ＊＊ 580.55 ±78.61 ＊＊ 0.21 ±0.03 *ISO+氧化苦參堿 100 72.22 ±11.26 ## 553.56 ±49.67 * 0.33 ±0.05 ##50 72.36 ±13.62 ## 569.71 ±139.79 * 0.28 ±0.08 100 68.11 ±4.63 60.93 ±4.40 418.73 ±33.13 500.09 ±106.37#

圖2 Western blotting 檢測(cè)大鼠左心室組織中eNOS 蛋白表達(dá)圖像

圖3 比較大鼠左心室組織中eNOS 蛋白表達(dá)的柱狀圖(±s，n=6)

4 討論

氧化苦參堿具有廣泛的藥理學(xué)作用，已用于治療乙型肝炎、抗肝纖維化和抗腫瘤輔助治療［1］，研究表明，氧化苦參堿對(duì)心血管系統(tǒng)具有對(duì)抗急性心肌缺血、減少左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎所致大鼠心肌梗死的梗死范圍，改善心力衰竭大鼠的心功能等作用［1-3］，但其在心血管系統(tǒng)中抑制心肌肥厚和保護(hù)心力衰竭的作用機(jī)制研究仍較少。本實(shí)驗(yàn)室前期研究證實(shí)氧化苦參堿是通過(guò)調(diào)控ADMA 代謝通路發(fā)揮抑制心力衰竭作用的［8］。為此本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討氧化苦參堿抑制慢性心力衰竭及心肌肥厚可能的機(jī)制。結(jié)果表明，氧化苦參堿抑制ISO 致心力衰竭大鼠心肌肥厚作用的機(jī)制可能與減少血清ET-1 的生成，調(diào)控心肌組織NO 水平及eNOS 表達(dá)有關(guān)。

心肌肥厚是心臟對(duì)持續(xù)性超負(fù)荷的一種適應(yīng)性反應(yīng)，長(zhǎng)期心肌肥厚是導(dǎo)致心力衰竭的重要因素之一［6，9］。異丙腎上腺素5 mg/kg 連續(xù)給藥7 d，可導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大，膠原纖維增生，心肌肥厚發(fā)生，同時(shí)心功能下降心力衰竭，該方法作為研究心力衰竭的藥理試驗(yàn)動(dòng)物模型被廣泛使用［9-10］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比，ISO 組HW/BW 和LVW/BW 顯著增大，與相關(guān)報(bào)道結(jié)果一致［9-10］。氧化苦參堿(100 和50 mg/kg)可明顯降低心衰大鼠HW/BW 和LVW/BW，說(shuō)明氧化苦參堿具有抑制心肌肥厚的作用。心肌病理組織觀察及病理分級(jí)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示ISO 組心肌纖維化嚴(yán)重，氧化苦參堿(100 和50 mg/kg)可明顯減少ISO 所致心力衰竭大鼠心肌纖維化，進(jìn)一步改善心室重構(gòu)［8，10］。

ET-1 是一種強(qiáng)的縮血管因子，也是一種炎癥因子，具有促細(xì)胞生長(zhǎng)和促有絲分裂的特性，ET-1 的過(guò)度產(chǎn)生與心肌肥厚及心力衰竭的發(fā)生密切相關(guān)［4-5］。研究表明，在心衰患者及動(dòng)物的體內(nèi)，血清ET-1 水平顯著增高［5，12］。NO 是由內(nèi)皮細(xì)胞中的內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)催化L-精氨酸(L-Arg)而生成的［6-7］。其是目前已知最強(qiáng)的擴(kuò)張血管因子之一，在心肌代償性肥厚時(shí)，NO 的增多可以減緩心肌肥厚的進(jìn)程，是阻止心室重構(gòu)的重要因素之一［6］。而內(nèi)源性NO 的減少可減弱舒血管效應(yīng)，加重心力衰竭［4，6］。近年來(lái)的諸多研究表明，ET-1 和NO 均是由內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的，兩者共同維持血管張力，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能平衡［13］。心力衰竭時(shí)，ET-1 和NO 存在相互制約的關(guān)系，ET-1 可刺激NO 的釋放增多，而NO 又可抑制ET-1 的合成［14］。因此，心力衰竭時(shí)內(nèi)皮功能失調(diào)與ET-1 和NO 的平衡失調(diào)直接相關(guān)，降低血清ET-1 并提高NO 水平對(duì)抑制心肌肥厚和抗心力衰竭有益［13-14］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ISO 可使大鼠血清ET-1 和NO 水平升高，心肌組織NO 水平降低，與前人報(bào)道結(jié)果一致［12，15］。氧化苦參堿(100 和50 mg/kg)可使ISO 誘導(dǎo)心力衰竭大鼠血清ET-1 水平明顯下降并使心肌組織NO的水平明顯增加，但對(duì)血清升高的NO 無(wú)影響。提示氧化苦參堿抑制心肌肥厚和逆轉(zhuǎn)心力衰竭在降低血清ET-1 同時(shí)，保留了NO 的舒血管作用。此外，內(nèi)源性NO 的產(chǎn)生有賴于eNOS 的活性和表達(dá)，eNOS 表達(dá)減少，NO 生物活性的下降則加重心力衰竭的發(fā)展［16］。對(duì)心臟特異性eNOS 過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠研究表明，eNOS 過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠冠脈結(jié)扎后左室收縮功能和舒張功能有所改善，左室肥厚和心肌肥厚減輕［16］。因此，恢復(fù)和增強(qiáng)eNOS 活性，增加NO 水平可抑制心力衰竭所致的心臟重構(gòu)［9］。本實(shí)驗(yàn)研究表明，ISO 所致的心力衰竭大鼠模型中eNOS 的表達(dá)顯著降低，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［15，17］。氧化苦參堿(100 和50 mg/kg)可使心肌組織eNOS 的表達(dá)明顯增加，提示氧化苦參堿抑制心力衰竭大鼠心肌肥厚與上調(diào)心肌組織eNOS 表達(dá)有關(guān)，從而增加心肌組織NO 水平。

綜上所述，氧化苦參堿可減輕ISO 致心力衰竭大鼠的心肌肥厚，改善心肌病理變化，對(duì)ISO 致大鼠心力衰竭具有保護(hù)作用。該作用機(jī)制與抑制大鼠血清ET-1 的水平，增加心肌組織NO 水平和上調(diào)eNOS 表達(dá)有關(guān)。

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